动脉粥样硬化中主动脉组织的三维成像

我们的研究重点是了解神经系统在动脉粥样硬化进展中的作用。具体来说，每次与嵴的相互作用，我们旨在回答动脉粥样硬化期间神经如何变化，以及其相互作用如何影响疾病进展。目前有几种尖端技术被用于推进动脉粥样硬化研究，以提高对疾病机制的理解。

这些技术包括组织透明化和 3D 成像、先进的显微技术、人工智能、单细胞测序和机器学习。在动脉粥样硬化进展过程中，动脉壁成分经历稳健的重组。描绘完整组织的 3D 和高分辨率成像的变化是关键的实验挑战。

此处描述的成像工具将帮助研究人员和心脏病专家更好地了解这种疾病，并最终帮助治疗患者。与传统技术相比，此处描述的协议具有多项优势，例如完整组织的深层组织成像，以及其结构的可视化，否则无法获得。这些方案将有助于更好地了解细胞 - 细胞和细胞 - 组织的相互作用，以提高对疾病进展的理解。

可视化完整组织中的 3D 细胞和结构变化可以提供新的见解，以更好地了解心血管研究中尚未解决的生物学问题。首先，将麻醉的鼠标放在覆盖有手术纸巾的泡沫板上。使用胶带将鼠标的手臂和腿固定在仰卧位。

用 75% 乙醇消毒胸部。使用 1 毫升一次性注射器从左心室采集血液。然后在胸部做一个中线切口，在右心房做一个小切口。

用 10 毫升 5 毫摩尔 EDTA 的 PBS 溶液灌注小鼠的左心室 5 分钟，直到血液冲出，然后用 20 毫升 PBS 灌注 5 到 10 分钟。最后，用 10 毫升 4% 多聚甲醛灌注 20 分钟。在解剖立体显微镜下，去除内部器官，包括胃肠道和生殖器官。

保持心脏主动脉和肾脏完好无损。然后小心地去除胸腺和周围的脂肪组织。将整个主动脉从升主动脉暴露到髂分叉处。

收获整个主动脉，并将其放入装满 PBS 的培养皿中。将主动脉分成不同的段，并纵向分开，以进行两个 2,2'硫代二乙醇或 TDE 清除。将端面主动脉固定在 Y 形的扁平黑色蜡板上，并在 4 摄氏度下用 4% 多聚甲醛固定过夜。

第二天，解开主动脉并将其转移到 PBS 中洗涤 5 分钟。然后将主动脉转移到封闭液中 2 小时进行封闭和透化。接下来，将主动脉与封闭溶液中的一抗孵育 24 小时。

在 PBS 中洗涤主动脉 5 分钟，重复 5 次，然后与 10% 正常驴血清中的二抗和 DAPI 一起孵育过夜以进行核染色，将染色的主动脉转移到浓度递增的 TDE 溶液中。接下来，将双面粘性矩形成像垫片很好地粘在干净的载玻片上并转移清除的主动脉，确保端面主动脉外膜面向盖玻片。用 60%TDE 溶液滴加固主动脉，并小心地将盖玻片贴在孔上，避免气泡。

打开配备 20 倍油浸物镜的倒置共聚焦激光扫描显微镜。根据染色染料调整混合二极管检测器。调整显示设置并选择 1024x1024 像素 XY 格式进行成像。

将浸油滴在盖玻片上，然后将 63 倍物镜粗略地移向样品，直到它接触到浸油和盖玻片。然后确定感兴趣区域，并以 2 到 4 微米的步长从端面主动脉的外膜侧采集 Z 堆栈，深度可达 60 微米，用于三维成像。使用样本详细信息和扫描详细信息命名文件，然后保存数据。

使用配备 20 倍物镜的正置多光子显微镜，以 10 至 15 微米的步长至 700 微米的深度从腔内侧获取 Z 堆栈。用 PBS 和多聚甲醛麻醉和灌注小鼠后，解剖隔膜水平以上的身体部位。在 4 摄氏度下用 4% 多聚甲醛固定下半身一到两天。

接下来，在 PBS 中彻底洗涤样品 10 分钟，重复 3 次。将样品在 20% 立方溶液中孵育 48 小时。用 PBS 洗涤后，将样品在 PGST 溶液中孵育过夜以进行透化和封闭。

第二天，将样品与一抗在 PGST 溶液中于 4 摄氏度孵育，轻轻摇动 10 至 12 天。在 PGST 中洗涤样品后，在 4 摄氏度的 PGST 中加入 DAPI中的二抗 7 天。在 PGST 中彻底洗涤样品 1 小时，重复 5 次。

将染色样品转移到一系列浓度增加的四氢呋喃工作溶液中进行脱水，每种浓度孵育 12 小时。脱水后，将样品置于无水二氯甲烷溶液中 3 小时以去除脂质。接下来，将样品在折光率匹配的苯甲醇苯甲酸苄酯溶液中孵育 3 至 6 小时。

首先，将小鼠主动脉和下半身部分图像的 Z 堆栈平铺图像加载到图像处理工作站。要对细胞或结构的体积深度进行颜色编码，请使用图像修复软件对原始图像进行去卷积。在 Fiji 软件中，使用时间颜色编码生成去卷积数据的最大强度投影。

将 Z 堆栈平铺的 TIFF 图像系列加载到软件中。使用 Fiji stitching 插件，拼接图像并将其保存为 TIFF 格式。接下来，将拼接的图像加载到 3D 可视化软件中进行图像分割。

沿着主动脉和神经节之间的整个路径手动追踪 X-Y-Z 轴上的神经元结构。将预处理后的图像加载到图像分析软件中。使用自发荧光分割主动脉和结缔组织。

应用单独的伪色以可视化不同的主动脉壁和斑块。最后，使用对比度受限的自适应直方图均衡函数来增强处理图像背景上的局部对比度。TDE 清除动脉粥样硬化主动脉显示斑块中 CD3e 染色的 T 细胞，这是动脉三级淋巴器官中 NF200 染色神经纤维的广泛新生。

APOE 敲除小鼠患病腹主动脉的多光子成像显示，表达 NF200 的轴突在动脉三级淋巴器官内缺乏 B220 阳性 B 细胞的区域发芽。iDISCO 清除的小鼠腹部的光片成像可视化了主动脉和交感神经节之间的空间关系，与动脉粥样硬化斑块相邻的外膜上新形成的 NF200 染色轴突。