Окрашивание Picrosirius Red для полуколичественной гистопатологической оценки отложения коллагена у мышей моделей хронического отторжения аллотрансплантата легкого

Наше исследование сосредоточено на анализе развития фиброза при хроническом отторжении аллотрансплантата легкого. Поэтому нас интересуют методы, которые характеризуют фиброзный тканевый компартмент. Для воспроизведения заболеваний, связанных с трансплантацией, мы используем мышиную модель трансплантации одного легкого, которую мы представили несколько лет назад.

В этой модели было показано, что трансплантация легкого между аллогенными линиями мышей приводит к различным уровням фиброза трансплантата. Гистологические данные по ремоделированию фиброзной ткани часто представлены качественно. Наш метод окрашивания Picrosirius Red дает преимущество полуколичественной оценки и позволяет дифференцировать толстые и тонкие коллагеновые волокна.

Для начала увлажните образцы легких мыши, содержащие парафин, в уменьшающейся концентрации этанола в течение двух минут каждый. Окрасьте предметное стекло на восемь минут в раствор гемалума Мейера. Промойте предметное стекло в течение 10 минут под проточной водой из-под крана, затем выдержите предметное стекло в течение одного часа в растворе Picrosirius Red.

Опустите предметное стекло от пяти до 10 раз в 0,5% раствор уксусной кислоты. Осторожно встряхните предметное стекло, чтобы удалить раствор. Теперь обезвожьте предметное стекло в возрастающей концентрации этанола и 100% ксилола в течение пяти минут каждого.

Добавьте одну каплю монтажного носителя на образец для встраивания и накройте крышкой. Дайте предметным стеклам высохнуть под вытяжным шкафом. Под световым микроскопом используйте соответствующее программное обеспечение для фокусировки образца до тех пор, пока не будет получено четкое и четкое изображение.

Регулируйте степень поляризационного фильтра до тех пор, пока фон не станет полностью темным или черным. Отсканируйте образец с 20-кратным увеличением и экспортируйте изображения в формат TIFF. Перенесите изображения в программное обеспечение Fiji.

Нажмите кнопку Редактировать и выберите Очистить снаружи. Затем нажмите «Анализировать», а затем «Измерить», чтобы измерить общую площадь поверхности. Чтобы измерить общее содержание коллагена в образце, нажмите «Изображение», а затем «Настройка» и «Порог цвета».

Установите оттенок от 2 до 130 и яркость от 35 до 255. Затем нажмите «Анализ» и в окне «Анализ частиц» установите размер на 1 минус бесконечность и отметьте галочками поля «Очистить» и «Суммировать». Отрегулируйте оттенок на красный для анализа толстых коллагеновых волокон и желтый зеленый для тонких коллагеновых волокон, а также измерьте общее количество коллагена.

Наконец, нажмите «Подключаемые модули», «Макросы» и «Запись», чтобы настроить макрос для автоматической обработки. Окрашивание по трихрому Массона, Херовичи и Picrosirius Red проиллюстрировало обширное отложение парабронхиального и параваскулярного коллагена в несогласованной модели основного комплекса гистосовместимости. Незначительная несогласованная модель в первую очередь показала плотные лимфоцитарные инфильтраты с менее интенсивным отложением коллагена.

Окрашивание Picrosirius Red с помощью поляризационного фильтра показало зеленый вид отложенных волокон на обеих моделях. Контроль изотрансплантата показал, что коллаген ограничен парабронхиальными и параваскулярными границами, подобно наивным мышиным легким. Анализ цифровых изображений выявил повышенное содержание общего коллагена в несоответствующих трансплантатах большого комплекса гистосовместимости по сравнению с незначительными несовпадающими трансплантатами, правосторонней наивной легочной тканью или наивными левыми легкими BALB/c.

Различий в толстых коллагеновых волокнах не выявлено. Анализ тонких коллагеновых волокон показал повышенное присутствие в основной несоответствующей модели по сравнению с незначительной несоответствующей моделью, наивной правосторонней легочной тканью или наивной левой легкой BALB/c.