צביעה אדומה של פיקרוזיריוס להערכה היסטופתולוגית כמותית למחצה של שקיעת קולגן במודלים עכבריים של דחיית אלוגרפט ריאה כרונית

המחקר שלנו מתמקד בניתוח התפתחות פיברוזיס בדחיית השתלת ריאות כרונית. לכן אנו מעוניינים בשיטות המאפיינות את תא הרקמה הפיברוטית. כדי לשחזר מחלות הקשורות להשתלה, אנו משתמשים במודל העכברי של השתלת ריאה בודדת שהצגנו לפני מספר שנים.

במודל זה, הוכח כי השתלת ריאה בין זני עכברים אלוגניים גורמת לרמות שונות של פיברוזיס בשתלים. נתונים היסטולוגיים על שיפוץ רקמות פיברוטיות מוצגים לעתים קרובות באופן איכותי. השיטה שלנו המשתמשת בצביעה אדומה של פיקרוזיריוס מציעה יתרון של הערכה חצי כמותית ומבדילה בין סיבי קולגן עבים ודקים.

כדי להתחיל, יש להרטיב את דגימות הריאות של העכבר המוטבעות בפרפין בריכוזי אתנול יורדים למשך שתי דקות כל אחת. צבעו את השקופית במשך שמונה דקות בתמיסת ההמאלום של מאייר. שטפו את המגלשה במשך 10 דקות תחת מי ברז זורמים, ולאחר מכן דגרו את המגלשה למשך שעה בתמיסת Picrosirius Red.

טובלים את השקופית חמש עד 10 פעמים בתמיסת חומצה אצטית של 0.5%. נער בעדינות את השקופית כדי להסיר את התמיסה. כעת ייבשו את המגלשה בריכוזי אתנול הולכים וגדלים ו-100% קסילול למשך חמש דקות כל אחד.

הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה על הדגימה להטמעה וכסה בהחלקת כיסוי. הניחו למגלשות להתייבש מתחת למכסה אדים. תחת מיקרוסקופ אור, השתמש בתוכנת הדמיה מתאימה כדי למקד את הדגימה עד לקבלת תמונה ברורה וחדה.

התאם את מידת מסנן הקיטוב עד שהרקע כהה או שחור לחלוטין. סרוק את הדגימה בהגדלה של פי 20 וייצא את התמונות בפורמט TIFF. העבר את התמונות לתוכנת פיג'י.

לחץ על Edit ובחר Clear Outside. לאחר מכן לחצו על 'נתח' ולאחר מכן על 'מדידה' כדי למדוד את שטח הפנים הכולל. כדי למדוד את תכולת הקולגן הכוללת בכל דגימה, לחצו על Image ולאחר מכן על Adjust ו-Color Threshold.

הגדר את הגוון בין 2 ל-130 ואת הבהירות בין 35 ל-255. לאחר מכן לחץ על נתח ובחלון ניתוח חלקיקים, הגדר את הגודל ל -1 מינוס אינסוף וסמן את התיבות נקה וסיכום. התאימו את הגוון לאדום לניתוח סיבי קולגן עבים ולירוק צהוב לסיבי קולגן דקים, ומדדו את ספירת הקולגן הכוללת.

לבסוף, לחץ על תוספים, פקודות מאקרו והקלטה כדי להגדיר את המאקרו לעיבוד אוטומטי. הטריכרום של מאסון, הצביעה האדומה של הרוביצ'י ופיקרוסיריוס המחישו שקיעת קולגן פרברונכיאלית ופרה-וסקולרית נרחבת במודל הלא תואם של קומפלקס התאימות ההיסטולוגית העיקרית. המודל הלא תואם הקטן הראה בעיקר חדירות לימפוציטיות צפופות עם שקיעת קולגן פחות אינטנסיבית.

צביעה אדומה של פיקרוסיריוס עם מסנן קיטוב חשפה מראה ירוק של הסיבים המופקדים בשני הדגמים. בקרות איזוגרפט הראו קולגן מוגבל לגבולות פרברונכיאלים ופרא-וסקולריים, בדומה לריאות עכברים נאיביות. ניתוח תמונה דיגיטלית חשף קולגן כולל מוגבר בשתלי ריאות לא תואמים של קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי בהשוואה לשתלים קלים לא תואמים, רקמת ריאה נאיבית בצד ימין או ריאות שמאל נאיביות BALB/c.

לא הודגמו הבדלים בסיבי קולגן עבים. ניתוח של סיבי קולגן דקים הראה נוכחות מוגברת במודל הלא תואם העיקרי בהשוואה למודל הלא תואם הקטן, רקמת ריאה ימנית נאיבית או ריאות שמאל BALB/c נאיביות.