Исследования вируса гепатита Е сдерживаются отсутствием эффективной системы клеточной культуры. Наши методы преодолевают эти ограничения, прокладывая путь к разработке лекарств и разработке вакцин. С помощью этого протокола, мы можем производить инфекционные вирусы с высоким содержанием titer как не-конверт и конверт HEV частиц, облегчая инфекцию различных клеток.
Выполнение этого протокола требует доступа к объекту BSA-2 и опыта работы с основными методами клеточной культуры. Для линейной плазмидной ДНК смешайте 10 микрограммов шаблонной ДНК с 10 микролитров буфера и двумя микролитров фермента ограничения Micrococcus luteus и отрегулируйте конечный объем до 100 микролитров с водой. Затем инкубировать раствор в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию и подтвердить линейность плазмиды электрофорезом агарозного геля в соответствии со стандартными протоколами.
После плазмидной изоляции ДНК и линейности, успех линейности может быть проверен путем сравнения неусвоенной плазмидной ДНК с переваренной плазмидной ДНК гель-электрофорезом. Для транскрипции в пробирке очищенной, полнометражной ДНК вируса гепатита Е смешайте два микрограмма линейного шаблона ДНК с соответствующими реагентами и используйте воду без ядра, чтобы довести конечный объем раствора до 100 микролитров. После тщательного смешивания, инкубировать раствор в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию.
Через два часа добавьте в трубку еще два микролитров РНК-полимеразы Т7. Затем смешайте реакцию и инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение еще двух часов. В конце инкубации, переварить первоначальный шаблон ДНК с 7,5 микролитров ДНК с тщательной смешивания и инкубации на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
После экстракции тщательно проверяйте целостность РНК и урожайность по агарозовому гель-электрофорезу в соответствии со стандартными протоколами. В случае низкого уровня РНК следует соблюдать различные полосы, а не размытый мазок. Некоторые шаги требуют быстрого выполнения и, следовательно, тщательной подготовки.
Также обратите особое внимание на целостность РНК и жизнеспособность клеток. Для подготовки раковых клеток печени человека для производства вируса гепатита Е, полученного из клеточной культуры, семенной клетки в 20 миллилитров полного DMEM на 15-сантиметровый коллаген покрытием культуры блюдо и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, пока они не достигнут 90% слияния. В конце культуры, мыть клетки с 10 миллилитров PBS, прежде чем отделить их от пластины клеточной культуры с тремя миллилитров 0,05%Трипсин-ЭДТА при 37 градусов по Цельсию.
Resuspend отдельных клеток в 10 миллилитров полного DMEM и передачи клеток в 50 миллилитров конической трубки для подсчета. Передача пять раз 10 до шести клеток в новую 50 миллилитровую трубку и мыть клетки два раза с 35 миллилитров PBS за стирку. После второй стирки поместите клетки на лед, не удаляя супернатанта.
Для электропорации клеток-мишеней дополнить 384 микролитров цитомикса двумя миллимолярными АТФ и пятью миллимолярной глутатионом, впоследствии хранить на льду до дальнейшего использования. Тщательно замените супернатант на все 400 микролитров раствора. Добавьте пять микрограммов очищенной вирусной геномной РНК в клетки и перенесите подвесную клетку на четырехмиллиметровый кювет для электропорации при 975 микрофарадах и 270 вольт в течение 20 миллисекунд.
После электропорации используйте пипетку Pasteur, чтобы как можно быстрее перенести клетки в 11 миллилитров полного DMEM и семени 10 миллилитров электропомерных клеток в 10-сантиметровую культурную тарелку, покрытую коллагеном. Затем добавьте 1,3 раза 10 к пятым клеткам в 300 микролитров среды равномерно на крышку скольжения в одном колодец коллагена покрытием 24 микротитр пластины и место пластины и блюдо в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 часов. На следующий день замените супернатант в блюде 10 миллилитров свежего DMEM и верните блюдо в инкубатор клеточной культуры еще на шесть дней.
На пятый-седьмой день, в зависимости от плотности клеток, выполняют иммунофлуоресцентное окрашивание трансфекции, чтобы позволить вычислить количество клеток, выражаюющих целевой белок интереса нормализуется до общего количества клеток. Успешное электропорирование может контролироваться иммунофлуоресцентным окрашиванием контроля трансфекции. Эффективность трансфекции должна превышать 40%A репликации дефицит мутант может служить отрицательным контролем, чтобы подтвердить специфику окрашивания.
Чтобы собрать частицы вируса гепатита Е, полученные из внеклеточной культуры, на шестой день фильтруем супернатант через сетку микролитров 0,45, чтобы удалить любой клеточный мусор и хранить собранный внеклеточный вирус гепатита Е, полученный из клеток, при четырех градусах Цельсия. Для внутриклеточной клеточной культуры, полученной от вируса гепатита Е, мыте клетки с помощью PBS и отсоедините клетки с 1,5 миллилитров 0,05%трипсина-ЭДТА при 37 градусах цельсия. Когда клетки отсоединились, остановить реакцию с 8,5 миллилитров DMEM и передачи подвески клетки на 50 миллилитров трубки для центрифугации.
Добавьте 1,6 миллилитров DMEM полной среды на электропорацию в отдельные две миллилитровые реакционной трубки и используйте 800 микролитров среды для повторного перерасхода клеток, тем самым перенося клетки в трубки. Заморозить клетки в жидком азоте, а затем разморозить клетки на льду три раза до высокой скорости центрифугирования в результате лизатов в течение 10 минут при 10000 раз г. Затем перенесите супернатанты в новые трубки, не нарушая гранулы клеточного мусора при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для оценки титров недавно произведенных внутриклеточных запасов вируса гепатита Е, семена в два раза от 10 до четырех клеток на 100 микролитров MEM на скважину в 60 центральных скважин коллагена покрытием 96-ну микротитр пластины и заполнить внешние скважины с 100 микролитров PBS на скважину. Через 24 часа при 37 градусах Цельсия добавьте в первый ряд клеток 50 микролитров сверхклеточной частицы вируса. После тщательного смешивания, последовательно разбавить содержимое хорошо шесть раз на один-три концентрации на колодец путем передачи 50 микролитров супернатанта из предыдущего в следующий ряд клеток в дублировать до последнего ряда клеток.
Чтобы заразить клетки частицами вируса гепатита Е внутриклеточной клеточной культуры, добавьте 25 микролитров супернатанта внутриклеточной вирусной частицы в верхний ряд клеток и смешайте задолго до того, как серийно разбавляют клетки шесть раз при соотношении один к пяти с 25 микролитров разбавления в дубликате, как это было продемонстрировано. Затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение семи дней до иммунофлуоресцентного окрашивания в соответствии с протоколом в рукописи. После инкубации и иммунного окрашивания пластины могут быть проанализированы с помощью иммунофлуоресценции микроскопии.
После иммуностимации окончательный рейтер внутриклеточных частиц может быть рассчитан с использованием соответствующей формулы, как указано. После инфекции целевой клетки с клеточной культурой полученных частиц вируса Е путем последовательного разбавления, титеры от одного раза 10 до пятого и три раза от 10 до шести единиц фокуса формирования на миллилитр можно ожидать от клеточных культур, инфицированных не-окутанных внутриклеточной клеточной культуры полученных частиц вируса гепатита Е. В культурах, инфицированных окутанными частицами вируса гепатита Е, полученными из внеклеточной клеточной культуры, ожидается, что титр будет от одного раза 10 до второго и один раз от 10 до четвертого фокуса, образуя единицы на миллилитр.
Кроме того, соотношение между копиями генома и неокуленными внутриклеточными частицами инфекционных вирусов, как правило, ниже, чем у внутриклеточных культур, полученных от вируса гепатита Е, инфицированных культурами, что свидетельствует о более высокой специфической инфекционности неокуленных видов вируса гепатита Е. Производство вирусных частиц и целевая клеточная инфекция требуют полного вирусного жизненного цикла и могут дать новое представление о взаимодействии с вирусом-хозяином. Этот протокол может быть изменен для выполнения репликации кинетики или для производства частиц, которые могут быть использованы в анализе инфекции.
Большинство наших исследований в настоящее время зависит от инфекционных частиц, как в окутанных и не окутанных HEV. И статьи с использованием наших методов в настоящее время публикуются.
