Hepatit E virüs araştırmaları, etkin bir hücre kültür sisteminin olmaması nedeniyle engellenmiştir. Tekniklerimiz bu sınırlamaların üstesinden gelerek ilaç tasarımı ve aşı geliştirmenin önünü açarak. Bu protokol ile, çeşitli hücrelerin enfeksiyonunu kolaylaştırarak, hem zarf dışı hem de zarf hev partiküllerinin enfeksiyöz yüksek titrevirüslerini üretebiliyoruz.
Bu protokolün uygulanması için bsa-2 tesisine erişim ve temel hücre kültürü teknikleri ile deneyim gerekir. Plazmid DNA'sını doğrusallaştırmak için şablon DNA'sının 10 mikrogramını 10 mikrolitre tampon ve iki mikrolitre Micrococcus luteus restriksiyon enzimiyle karıştırın ve son hacmi suyla birlikte 100 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra 37 santigrat derece bir saat için çözüm kuluçka ve standart protokollere göre agarose jel elektroforez ile plazmid doğrusalizasyon onaylamak.
Plazmid DNA izolasyonu ve lineerizasyondan sonra, doğrusallaştırmanın başarısı sindirilmemiş plazmid DNA'sı jel elektroforezile sindirilmiş plazmid DNA'sı ile karşılaştırılarak doğrulanabilir. Saflaştırılmış, tam uzunlukta hepatit E virüs DNA'sının in vitro transkripsiyonu için, doğrusaldna şablonunun iki mikrogramını uygun reaktiflerle karıştırın ve çözeltinin son hacmini 100 mikrolitreye getirmek için çekirdeksiz su kullanın. Iyice karıştırdıktan sonra, 37 santigrat derece iki saat boyunca çözelti kuluçka.
İki saat sonra, tüpe iki mikrolitre T7 RNA polimeraz ekleyin. Sonra reaksiyonu karıştırın ve tüpü 37 derecede iki saat daha kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, 7,5 mikrolitre DNA ile ilk DNA şablonunu 30 dakika boyunca 37 derece boyunca iyice karıştırArak ve kuluçkaya yatırArak sindirin.
Ekstraksiyondan sonra, standart protokollere göre agarose jel elektroforezi ile RNA bütünlüğünü ve verimini dikkatlice kontrol edin. Düşük RNA bolluğu durumunda bulanık yayma yerine farklı bantlar gözlenmelidir. Bazı adımlar hızlı yürütme ve bu nedenle ayrıntılı hazırlık gerektirir.
Ayrıca, RNA bütünlüğü ve hücre canlılığı için özel dikkat edin. Hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs üretimi için insan karaciğer kanseri hücreleri hazırlamak için, 15 santimetre kollajen kaplı kültür çanak üzerine tam DMEM 20 mililitre hücreleri tohum ve 37 santigrat derece de inkübat onlar% 90 biraraya ulaşana kadar. Kültürün sonunda, hücreleri hücre kültür plakasından 37 santigrat derecede %0.05 Tripsin-EDTA ile ayırmadan önce 10 mililitre PBS ile yıkayın.
Tam DMEM 10 mililitre müstakil hücreleri resuspend ve sayma için 50 mililitrekonik tüp içine hücreleri aktarın. Altı hücreye beş kez 10'u yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve hücreleri yıkama başına 35 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, supernatant çıkarmadan buz hücreleri yerleştirin.
Hedef hücrelerin elektroporasyonu için, iki milimolar ATP ve beş milimolar glutatyon ile sitomix ek 384 mikrolitre, daha sonra daha fazla kullanım akadar buz üzerinde saklamak. Supernatant'ı 400 mikrolitre çözeltinin tamamıyla dikkatlice değiştirin. Hücrelere saflaştırılmış viral genomik RNA beş mikrogram ekleyin ve 20 milisaniye için 975 mikrofarad ve 270 volt elektroporasyon için dört milimetrelik bir cuvette hücre süspansiyon aktarın.
Elektroporasyondan sonra, hücreleri mümkün olan en kısa sürede 11 mililitre tam DMEM'e aktarmak için pasteur pipeti kullanın ve 10 mililitre elektroporated hücreyi kollajenle kaplanmış 10 santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin. Daha sonra, kollajen kaplı 24 mikrotiter plaka bir kuyuda bir kapak kayma üzerine orta 300 mikrolitre beşinci hücrelere 1,3 kez 10 ekleyin ve 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka için plaka ve çanak yerleştirin. Ertesi gün, taze DMEM 10 mililitre ile çanak supernatant değiştirin ve ek bir altı gün için hücre kültürü kuluçka için çanak dönmek.
Beşinci günden 7'ye kadar, hücre yoğunluğuna bağlı olarak, transfeksiyon kontrolünün immünororesan boyamasını gerçekleştirerek, hedef proteini ifade eden hücre sayısının toplam hücre sayısına normalleştirilmesini sağlar. Başarılı elektroporasyon transfeksiyon kontrolünün immünoresan boyama ile izlenebilir. Transfeksiyon verimliliği aşmalıdır 40% Bir çoğaltma eksik mutant boyama özgüllüğünü doğrulamak için olumsuz bir kontrol olarak hizmet verebilir.
Hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs partiküllerini hasat etmek için, altıncı günde, süpernatant'ı 0,45 mikrolitrelik bir kafesten filtreleyin, herhangi bir hücre enkazını çıkarın ve hasat edilen hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüsünü dört santigrat derecede saklayın. Hücre içi hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacık hasadı için, hücreleri PBS ile yıkayın ve hücreleri 1,5 mililitre ile 37 santigrat derecede %0,05 Tripsin-EDTA ile ayırın. Hücreler ayrıldığında, 8.5 mililitre DMEM ile reaksiyonu durdurun ve hücre süspansiyonunu santrifüj için 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Tek tek iki mililitre reaksiyon tüpleri için elektroporasyon başına tam orta 1.6 mililitre ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için orta 800 mikrolitre kullanın, böylece tüplere hücreleri aktarArak. Hücreleri sıvı nitrojenle dondurun ve daha sonra yüksek hızda 10 dakika 10 dakika boyunca 10 dakika, 000 kez g'de santrifüj etmeden önce hücreleri buzüzerinde üç kez eritin. Sonra eksi 80 santigrat depolama için hücre enkaz pelet rahatsız etmeden yeni tüpler içine supernatants aktarın.
Yeni üretilen intra ve ekstrasellüler hepatit E virüs stoklarının titrelerini değerlendirmek için, kollajen kaplı 96 kuyulu mikrotiter plakanın 60 merkez kuyusuna her 100 mikrolitre mem başına dört hücreye iki kez 10 tohum tohumu ve en dış kuyuları kuyu başına 100 mikrolitre PBS ile doldurun. 37 santigrat derecede 24 saat sonra, hücrelerin ilk satırına 50 mikrolitre ekstrasellüler virüs parçacığı ekselansları ekleyin. Iyice karıştırdıktan sonra, seri hücrelerin son satırına kadar yinelenen hücrelerin önceki bir sonraki satıra supernatant 50 mikrolitre aktararak kuyu başına bir ila üç konsantrasyon altı kez seyreltin.
Hücre içi hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacıkları ile hücreleri enfekte etmek için, hücrelerin üst satırına hücre içi virüs parçacığı supernatant 25 mikrolitre ekleyin ve seri olarak bir ila beş oranında hücreleri altı kez seyreltme önce iyice karıştırın 25 kopya seyreltme çoğaltılması olarak gösterilmiştir. Daha sonra yazıdaki protokole göre immünofloresan boyama önce yedi gün boyunca hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Kuluçka ve immün boyama sonrasında, plakalar immünfloresans mikroskobu kullanılarak analiz edilebilir.
İmmünleledikten sonra hücre içi ve hücre dışı partiküllerin son titreci belirtildiği gibi uygun formül kullanılarak hesaplanabilir. Seri seyreltme ile hücre kültürü kaynaklı E virüs parçacıkları ile hedef hücre enfeksiyonu sonra, mililitre başına altı odak oluşturan birimleri bir kez 10 ila üç kez arasında titreler olmayan zarflı hücre içi hücre kültürü türevi hepatit E virüs parçacıkları ile enfekte hücre kültürleri beklenebilir. Zarflı hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacıkları ile enfekte kültürlerde, mililitre başına birim oluşturan dördüncü odak 10 bir kez 10 ve bir kez arasında titrebekleniyor.
Buna ek olarak, genom kopyaları ve zarfsız hücre içi enfeksiyöz virüs parçacıkları arasındaki oran tipik olarak hücre dışı hücre kültürü kaynaklı hepatit E virüs parçacık enfekte kültürleriçin gözlenenden daha düşüktür, bu da zarfsız hepatit E virüs türlerinin daha yüksek spesifik bir enfekteliği düşündürmektedir. Viral parçacık üretimi ve hedef hücre enfeksiyonu tam bir viral yaşam döngüsü gerektirir, ve virüs-host etkileşimleri içine yeni anlayışlar sağlayabilir. Bu protokol çoğaltma kinetik gerçekleştirmek veya enfeksiyon tahlilleri kullanılabilecek parçacıklar üretmek için değiştirilebilir.
Araştırmalarımızın çoğu şu anda hem zarflı hem de zarfsız HEV'de bulunan enfeksiyöz partiküllere bağlıdır. Ve tekniklerimizi kullanan makaleler şu anda yayınlanmaktadır.
