Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в гепатотропных инфекций и полей заболеваний печени. Такие, как вклад популяций клеток резидентов печени, вирусный патогенез, продольная инфекция кинетики, механизмы вирусной репликации, иммунного вторжения, в физиологической модели системы и исследования тестирования на наркотики. Основным преимуществом этой техники является способность резюмировать печеночную микроокноронию.
Которые могут поддерживаться в течение длительных периодов времени и, естественно, восприимчивы к инфекции гепатита В на физиологических соответствующих уровнях. Ранее это было одним из основных ограничений в области гепатита В. Последствия этого метода распространяются на терапию или диагностику инфекции ВГВ, поскольку исследования по тестированию на наркотики могут проводиться на физиологической платформе в течение длительного времени.
Это позволяет оценить последовательные лекарственные препараты наряду с анализом эффективности существующих и новых стратегий лечения. Этот метод может обеспечить понимание гепатита В, а также может быть применен к другим исследованиям болезни, в том числе других гепатотропных инфекций, заболеваний печени, или исследования метаболизма наркотиков. Как правило, лица, новые для этого метода будет бороться, потому что она требует внимания к конкретным деталям, чтобы успешное поддержание тканей печени в течение длительных периодов времени.
А также знакомство со специализированными инструментами и оборудованием. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Включая сборку пластин, а также оттаивание и посев клеток.
Поскольку шаги, связанные с долгосрочной культурой печени полученных клеток являются сложными при использовании новой системы культуры. Во-первых, включите компрессор и вакуумный насос, связанный с платформой чипа печени. Приступайте к стеклянной трубке шкаф для сборки и equilibrate пластин.
Поместите стерильную мембрану на основание пластины, чтобы начать асептически сборку микрофлюидных пластин. Убедившись, что стерильная мембрана плавно лежит на двух булавках базовой пластины. Затем добавьте хорошо содержащую верхнюю пластину.
Добавьте стерильную крышку пластины. И использовать автоматизированный точность крутящего момента, установленный на 33 фунтов. Использование спирали ужесточения последовательности затянуть винты у основания пластины.
Используя ручной крутящий момент, убедитесь, что все винты затягиваются до 35 фунтов. Далее, предварительно разогреть гепатоцитов посева среды до 37 градусов по Цельсию до грунтовки. Поместите полностью собранную тарелку в стиральный док.
И убедитесь, что пластина защелками полностью. Добавьте 400 микролитров среды посева гепатоцитов в резервуарную сторону каждой системы, чтобы загрунтовать пластину. После этого, инициировать поток в восходящем направлении в течение 3,5 минут на один микролитер в секунду.
Красные индикаторы на стороне пластины будут указывать, правильно ли функционирует микрофлюидная циркуляция. После того, как среда перекачивается в клеточной стороне роста пластины, добавить дополнительные 1,2 миллилитров гепатоцитов посева среды. Тщательно перенесите пластину на стыковочный станцию в пределах увлажненной инкубатора при 37 градусах Цельсия и 5%CO2.
Инициировать поток в восходящем направлении со скоростью потока один микролитер в секунду в течение 16 часов. После этого перенесите тарелку в стиральный док. Аккуратно пипетки вверх и вниз, чтобы устранить любые пузыри.
Используя стерильные типсы, добавьте стерильную круглую фильтровальную бумагу к каждому хорошо. Затем добавьте эшафот крепления клетки и сохраняя кольцо к каждому наилучшим образом. Используйте стерильный поршень, чтобы нажать вниз каждый колодец и заблокировать подпорные кольца и леса на место.
Далее, аспирировать все среды. И аккуратно добавьте 400 микролитров предварительно разогретой среды посева гепатоцитов над эшафотом. Инициировать поток в нисходящем направлении на один микролитер в секунду в течение 3 1/2 минут.
Аспирировать все средние откачивается из резервуара стороне пластины. Добавьте 1,4 миллилитров среды посева гепатоцитов к каждому хорошо. Затем верните пластину на скамью подсудимых, чтобы довести общий объем на колодец до 1,6 миллилитров.
Во-первых, предварительно разогреть гепатоцитов оттаивания среды и гепатоцитов посева среды до 37 градусов по Цельсию. Далее, оттепель один флакон первичных гепатоцитов человека в соответствии с инструкциями поставщика. В стеклянной трубке шкаф, повторного перерасхода клеток в один миллилитр гепатоцитов посева среды.
Затем поместите на лед повторно натядные клетки. Используя трипан синий, подсчитайте клетки, чтобы убедиться, что жизнеспособность клеток выше 90%Передача полностью собранной пластины в стиральный док. И аспирировать всю среду из скважин.
Извлеки клетки из льда и добавьте 600 000 гепатоцитов к каждому из них в 500-микролитерный объем среды посева гепатоцитов. Инициировать поток в нисходящем направлении со скоростью потока один микролитер в секунду. Добавьте 900 микролитров среды посева гепатоцитов к каждой хорошо, чтобы довести общий объем в каждом до 1,6 миллилитров.
Перенесите пластину на док-станцию в рамках увлажненной инкубатора при 37 градусах Цельсия и с 5%CO2. Инициировать поток в нисходящем направлении со скоростью потока один микролитер в секунду в течение восьми часов. После этого в течение восьми часов обратный поток в восходящем направлении со скоростью потока в один микролитер в секунду.
Затем перенесите пластину в стиральный док, и аспирировать все среды из колодцев. Добавьте 400 микролитров гепатоцитов среднего обслуживания к каждой хорошо. И инициировать поток в нисходящем направлении со скоростью потока один микролитер в секунду в течение 3 1/2 минут.
Далее, аспирировать все среды из резервуара, и добавить 1,4 миллилитров гепатоцитов поддержания среды. Перенесите пластину на док-станцию в рамках увлажненной инкубатора при 37 градусах Цельсия и 5%CO2. Инициировать поток в восходящем направлении со скоростью потока один микролитер в секунду в течение 48 часов.
Через 48 часов вымойте тарелку, переведя ее в стиральный док. Аспирировать все среды из скважин. И добавить 400 микролитров среднего обслуживания.
И инициировать поток в нисходящем направлении на один микролитер в секунду в течение 3,5 минут. Затем аспирировать все средства, появляющиеся в резервуарной стороне скважин. Добавьте 1,4 миллилитров среды обслуживания гепатоцитов.
Затем перенесите пластину обратно на док-станцию во влажном инкубаторе. Инициировать поток в восходящем направлении со скоростью потока один микролитер в секунду в течение 48 часов. Замените носитель с помощью этого процесса мытья и замены каждые 48 часов.
Первичные гепатоциты человека, как правило, только стабильны в течение ограниченного периода времени при использовании обычных систем культуры. Однако, используя описанный здесь протокол, они могут функционально поддерживаться в течение длительных периодов времени. Человеческий альбумин выделяется функциональными гепатоцитами и считается лучшим маркером для оценки печеночным функционалом.
Альбумин считается стабилико и высоко выражены 3D культур, по крайней мере до дня 40 после посева. Для совместной культуры функциональность и жизнеспособность клеток Купфера оцениваются путем измерения секреции конкретных цитокинов. Как видно здесь, измеренные уровни IL-6 и TNF альфа указывают на то, что клетки были функционально поддерживается и жизнеспособным.
В дополнение к сохранению их физиологического клеточного метаболизма, эти культуры стали исключительно восприимчивы к инфекции ВГВ. ДНК HBV и другие вирусные маркеры легко обнаруживаются со дня второй после заражения. В то время как традиционные культуры требуют прививки, по крайней мере, 500 эквивалентов генома HBV, дополненных DMSO и PEG, эти 3D культуры заражены всего 05 эквивалентами неизгладимого генома.
В дополнение к секретным маркерам вирусной инфекции, гепатоцитсодержащие леса извлекаются из этих культур. Иммунофторесценция микроскопии показывает, что эти леса содержат вирусные антигены. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы быть нежным при обработке гепатоцитов перед посевом, чтобы избежать смерти клеток.
Кроме того, важно убедиться, что пластины правильно собраны и все каналы потока позволяют правильное распространение средств массовой информации до посева гепатоцитов. После этой процедуры, другие методы, такие как иммунофлуоресценция может быть выполнена для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Включая расположение и частоту инфицированных клеток в тканях.
Физиологическое состояние гепатоцитов также можно оценить путем окрашивания для альбуминовых или печеночными структурами, включая плотный стыковый белок ЗО-1. После этого развития, этот метод прокладывает путь для исследователей в области вирусологии для изучения инфекции гепатита В и иммунных реакций в физиологической 3D-модели системы. Не забывайте, что работа с вирусом гепатита В может быть опасной, и такие меры предосторожности, как предыдущая вакцинация, использование соответствующих СИЗ и работа в соответствии с соответствующими руководящими принципами биобезопасности, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.
