وقد أعاق أبحاث فيروس التهاب الكبد E عدم وجود نظام فعال لثقافة الخلايا. تقنياتنا التغلب على هذه القيود تمهيد الطريق لتصميم المخدرات وتطوير اللقاحات. مع هذا البروتوكول، ونحن قادرون على إنتاج الفيروسات عالية الاتر المعدية من كل من غير المغلف والجسيمات HEV المغلف، مما يسهل العدوى من مجموعة متنوعة من الخلايا.
يتطلب تنفيذ هذا البروتوكول الوصول إلى مرفق BSA-2 والخبرة في تقنيات زراعة الخلايا الأساسية. لتكييف الحمض النووي البلازمي ، اخلط 10 ميكروغرام من الحمض النووي للقالب مع 10 ميكرولترات من العازلة واثنين من ميكروليترس إنزيم تقييد luteus وضبط الحجم النهائي إلى 100 ميكرولترات مع الماء. ثم احتضان الحل لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية وتأكيد الخطية من البلازميد بواسطة agarose هلام electrophoresis وفقا للبروتوكولات القياسية.
بعد عزل الحمض النووي plasmid والخطية، يمكن التحقق من نجاح الخطية من خلال مقارنة الحمض النووي البلازميد غير هضم إلى الحمض النووي plasmid هضم بواسطة جل electrophoresis. للنسخ في المختبر من الحمض النووي النقي، كامل طول التهاب الكبد E، مزيج اثنين من ميكروغرام من قالب الحمض النووي الخطي مع الكواشف المناسبة واستخدام نواة خالية من المياه لتحقيق الحجم النهائي للحل إلى 100 ميكرولترات. بعد خلط شامل، احتضان الحل لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.
بعد ساعتين، إضافة اثنين من microliters إضافية من T7 RNA البوليميراز إلى الأنبوب. ثم اخلطي رد الفعل وحضن الأنبوب عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة، هضم قالب الحمض النووي الأولي مع 7.5 ميكرولترات من DNAs مع خلط شامل واحتضان لمدة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد الاستخراج، تحقق بعناية من سلامة الحمض النووي الريبي والعائدة بواسطة agarose هلام electrophoresis وفقا للبروتوكولات القياسية. في حالة انخفاض RNAs الزهد، ينبغي ملاحظة نطاقات متميزة، بدلا من تشويه غير واضح. بعض الخطوات تتطلب التنفيذ السريع، وبالتالي إعداد شامل.
أيضا، إيلاء اهتمام خاص لسلامة RNA وقابلية الخلية. لإعداد خلايا سرطان الكبد البشرية لإنتاج فيروس التهاب الكبد E المشتق من ثقافة الخلايا ، بذور الخلايا في 20 ملليلتر من DMEM كاملة على طبق ثقافة الكولاجين المغلفة 15 سنتيمترا واحتضان في 37 درجة مئوية حتى تصل إلى 90 ٪ التقاء. في نهاية الثقافة، وغسل الخلايا مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل فصلها من لوحة ثقافة الخلية مع ثلاثة ملليلتر من 0.05٪ تريبسين-EDTA في 37 درجة مئوية.
resuspend الخلايا المنفصلة في 10 ملليلتر من DMEM كاملة ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر للعد. نقل خمس مرات 10 إلى الخلايا الست إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر وغسل الخلايا مرتين مع 35 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل. بعد الغسيل الثاني، ضع الخلايا على الجليد دون إزالة المابير.
لكهربية الخلايا المستهدفة, تكملة 384 ميكرولترات من cytomix مع اثنين من المليمولار ATP وخمسة الجلوتاثيون مليمولار, ثم تخزين على الجليد حتى مزيد من الاستخدام. استبدال بعناية supernatant مع كامل 400 ميكرولترات من الحل. إضافة خمسة ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي الفيروسي المنقى إلى الخلايا ونقل تعليق الخلية إلى cuvette أربعة ملليمتر للكهربة في 975 microfarad و 270 فولت لمدة 20 مللي ثانية.
بعد الكهربة، استخدم ماصة باستور لنقل الخلايا في أسرع وقت ممكن إلى 11 ملليلتر من DMEM كاملة والبذور 10 ملليلتر من الخلايا الكهروبروميد في طبق ثقافة 10 سم المغلفة مع الكولاجين. بعد ذلك، أضف 1.3 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة في 300 ميكرولترات من المتوسط بالتساوي على زلة غلاف في بئر واحدة من لوحة 24 ميكروتيات المغلفة بالكولاجين ووضع الطبق والطبق في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدل المابير في الطبق بـ 10 ملليلتر من DMEM الطازجة واعيد الطبق إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ستة أيام إضافية.
في اليوم الخامس إلى السابع، اعتمادا على كثافة الخلية، إجراء تلوين مناعي من التحكم في transfection للسماح بحساب عدد الخلايا التي تعبر عن البروتين المستهدف من الفائدة تطبيع إلى العدد الإجمالي للخلايا. يمكن رصد الكهربة الناجحة عن طريق تلطيخ الفلوروست المناعية للتحكم في التواليف. وينبغي أن تتجاوز كفاءة transfection 40 ٪ A استنساخ متحولة ناقصة يمكن أن تكون بمثابة سيطرة سلبية لتأكيد خصوصية تلطيخ.
لحصاد جزيئات فيروس التهاب الكبد E المشتقة من الخلايا خارج الخلية، في اليوم السادس، قم بفرز السائل الخارق من خلال شبكة ميكرولتر 0.45 لإزالة أي حطام خلية وتخزين فيروس التهاب الكبد E المشتق من الخلايا خارج الخلية المحصّل عند أربع درجات مئوية. بالنسبة للحصاد الناتج عن الخلايا بين الخلايا، جزيء التهاب الكبد E، قم بغسل الخلايا باستخدام PBS وفصل الخلايا بـ 1.5 ملليلتر بنسبة 0.05٪ لتربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية. عندما تكون الخلايا منفصلة، ووقف رد فعل مع 8.5 ملليلتر من DMEM ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر للطرد المركزي.
إضافة 1.6 ملليلتر من DMEM كاملة متوسطة perporation الفردية اثنين من المليلتر ردود الفعل أنابيب واستخدام 800 ميكرولترات من المتوسطة ل resuspend الخلايا، وبالتالي نقل الخلايا إلى الأنابيب. تجميد الخلايا في النيتروجين السائل، وبعد ذلك ذوبان الخلايا على الجليد ثلاث مرات قبل سرعة عالية الطرد المركزي لlysates الناتجة لمدة 10 دقائق في 10، 000 مرات ز. ثم نقل super في أنابيب جديدة دون إزعاج الكريات حطام الخلية للتخزين ناقص 80 درجة مئوية.
لتقييم الارتداء من الأسهم فيروس التهاب الكبد E داخل الخلايا المنتجة حديثا وخارج الخلايا، البذور مرتين 10 إلى الخلايا الأربع لكل 100 ميكرولتر من MEM في البئر في 60 آبار مركز من لوحة 96-جيدا المغلفة الكولاجين microtiter وملء الآبار الخارجية مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في البئر. بعد 24 ساعة في 37 درجة مئوية، إضافة 50 ميكرولترات من الجسيمات خارج الخلية فيروس عظمى إلى الصف الأول من الخلايا. بعد خلط دقيق، بشكل تسلسلي تخفيف محتويات البئر ست مرات في تركيز واحد إلى ثلاثة في بئر عن طريق نقل 50 ميكرولترات من ااسخدام من السابق إلى الصف التالي من الخلايا في مكررة حتى الصف الأخير من الخلايا.
لتصيب الخلايا مع الخلايا داخل الخلايا المشتقة من جسيمات فيروس التهاب الكبد E، إضافة 25 ميكرولترات من الجسيمات الفيروس داخل الخلايا supernatant إلى الصف العلوي من الخلايا ومزيج جيدا قبل تخفيف المسلسل الخلايا ست مرات بنسبة واحد إلى خمسة مع 25 ميكرولترات من التخفيف في مكررة كما هو موضح. ثم ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة سبعة أيام قبل تلطيخ الفلورات المناعية وفقًا للبروتوكول في المخطوطة. بعد الحضانة والتلطيخ المناعي، يمكن تحليل اللوحات باستخدام المجهر المناعي.
بعد المناعة يمكن حساب اللتيتر النهائي للجسيمات داخل الخلية وخارج الخلية باستخدام الصيغة المناسبة على النحو المشار إليه. بعد إصابة الخلية المستهدفة مع جزيئات فيروس E المشتقة من ثقافة الخلية عن طريق التخفيف التسلسلي ، يمكن توقع الارتداء بين مرة واحدة 10 إلى 10 × 10 إلى وحدات تشكيل التركيز الست لكل ملليلتر من ثقافات الخلايا المصابة بجزيئات فيروس التهاب الكبد الوبائي E المشتقة من الخلايا غير المغلفة. في الثقافات المصابة بجزيئات فيروس التهاب الكبد E المشتقة من الخلايا خارج الخلية، من المتوقع أن تتراوح نسبة الإصابة بين 10 مرات إلى الثانية و10 مرات إلى وحدات التركيز الرابعة لكل ملليلتر.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن النسبة بين نسخ الجينوم وجزيئات الفيروس المعدية داخل الخلايا غير المغلفة هي عادة أقل من تلك التي لوحظت بالنسبة للثقافات المصابة بجزيئات فيروس التهاب الكبد E المشتقة من الخلايا خارج الخلية، مما يشير إلى وجود إصابة إصابة أعلى تحديداً لأنواع فيروس التهاب الكبد E غير المغلفة. ويتطلب إنتاج الجسيمات الفيروسية والعدوى المستهدفة للخلايا دورة حياة فيروسية كاملة، ويمكن أن يوفر رؤى جديدة للتفاعلات بين مضيفي الفيروسات. يمكن تعديل هذا البروتوكول لتنفيذ حركية النسخ المتماثل أو لإنتاج الجسيمات التي يمكن استخدامها في مقايسات العدوى.
يعتمد معظم أبحاثنا حاليًا على الجسيمات المعدية ، سواء في HEV المغلفة وغير المغلفة. والمقالات التي تستخدم تقنياتنا يتم نشرها حاليا.
