Цель этого видео состоит в том, чтобы продемонстрировать стандартизированный протокол для взрослых кардиомиоцитов изоляции, долгосрочной культуры и трансфекции. Изоляция и культивирование кардиомиоцитов от мыши или крысы по-прежнему является важным методом для исследования клеточной автономной биологии кардиомиоцитов в здоровом и больном сердце. Есть несколько вопросов, на которые мы можем ответить с помощью изолированных кардиомиоцитов.
Такие, как потенциал распространения. Есть изменения экспрессии генов или конкретные выражения цитокинов при ответе травмы. К сожалению, мыши кардиомиоциты не выживают последние одну неделю в нормальных условиях культуры.
Поэтому в этом видео мы описываем оптимизированный метод изоляции взрослых мышей кардиомиоцитов, замирает их и культурные их далеко за 21 дней, этот метод изначально трудно освоить. Но с практикой можно достичь около 80 до 90% выжить в кардиомиоцитов после изоляции и около 100 процентов эффективности трансинфекции. И большинство из этих кардиомиоцитов в правильных условиях может выжить последние 20 дней.
Очистите и стерилизовать хирургические инструменты, замачивая их в 70% алкоголя в течение 15 минут, а затем мыть их двойной дистиллированной водой. После воды, оставьте инструменты в воздухе, чтобы высохнуть дальше, очистить аппарат изобилия, запуская 70% алкоголя в два раза в течение пяти минут каждый. Увеличение скорости потока поможет очистить трубки после алкоголя промыть любой оставшийся алкоголь, запуская двойную дистиллированную воду в течение 10 минут.
настроить три блюда, чтобы очистить сердце после иссечения. Заполните каждое из блюд 20 миллилитров буфера миоцитов. Добавить две-три капли гепарина к каждому блюду с пастер пипеткой и смесь Ну, трубопроводов вверх и вниз несколько раз.
Возьмите 10 миллилитров шприц и заполнить его с миоцитов буфера. Удалите любой из пузырьков воздуха из шприца и поместите его в третье блюдо в угловое положение, закрепив его лентой. Подготовь свободный узел хирургическим швом и поместите его вокруг иглы.
Ввимите мышь гепарином через IP-инъекцию за 20 минут до анестезии. Циркулировать буфер изобилия миоцитов через аппарат изобилия со скоростью потока три миллилитров в минуту. Через пять минут замените обильный буфер ферментным раствором, насытите ферментный раствор кислородом во время процесса, опять же установите ферментный раствор до скорости потока в три мл в минуту.
Подтвердите анестезию щипать ногой и поместите мышь на хирургической платформе. Стерилизовать кожу 70% алкоголем. Аккуратно откройте грудь, потрудуйте сердцем и положите сердце в первое блюдо.
Очистите кровь от сердца, нежно сжимая, затем перенесите сердце во второе блюдо, чтобы еще больше очистить кровь от сердца и удалить любые несердечные ткани. Впоследствии перенесите сердце на третье блюдо. Найти аорты и использовать типсы, чтобы держать его Пейтон больше размещения его вокруг cannulating иглы.
Закрейте его, потянув вниз предварительно жесткий узел ужесточения, а затем сделать второй узел. Для дополнительной стабильности исправьте порядок и место с помощью клипа. Обрезать любой избыток шовной нити, и, наконец, начать изобилие сердца с помощью буфера миоцитов в шприце, чтобы очистить любой из крови, оставшейся в сердце.
Аккуратно снимите расчетливную иглу со шприца и подключи ее к аппарату изобилия. Попытка предотвратить любые пузырьки воздуха от вдаваясь в сердце. Как это может повлиять на поток ферментного раствора и пищеварения.
Переместив водяной пиджак вверх, чтобы обеспечить однородную среду для сердца во время изобилия. Разрешить ферментный раствор течь через сердце со скоростью от двух до трех мл в минуту. Пусть ферментный раствор течет через сердце в течение двух минут.
За две минуты смешайте в растворе фермента 40 микролитров сто раствора хлорида кальция микромолара. Пусть ферментный раствор проходит через сердце еще 10-15 минут. Как только поток становится гладким и сердце начинает выглядеть коричневым и мягким, вы знаете, что у вас есть равномерное распределение фермента коллагеназы для достижения надлежащего пищеварения сердца.
Когда вы думаете, что ваше пищеварение завершено, возьмите сердце из системы перфузии Langendorff и поместите его в 16-миллиметровую чашку Петри, наполненную пятью миллилитров ферментного раствора и отвезу его в биобезопасность ноги. Тщательно удалите атрию и жировую ткань. Фарш сердце в определенных частей с помощью типсов.
Возьмите стерильный пастер пипетки и сократить его кончик на 45 градусов. Используйте пастер пипетки, чтобы разбить ткани сердца, нежный трубы вверх и вниз. Оптимальное пищеварение обеспечивает суспензию одноклеточных кардиомиоцитов после этого добавить пять миллилитров стоп-раствора, чтобы остановить активность фермента, чтобы избежать переваривания, Возьмите первые 50 миллилитров конической трубки и поместите стерильные сто микрон-клеток ситечко на нем.
Пройдите подвеску кардиомиоцитов через ситечко клетки, чтобы удалить любые большие куски ткани. Наконец мыть ситечко с стоп-раствором, чтобы собрать любые прилагается кардиомиоцитов остается. Центрифуга клеточной подвески при 20 GS в течение трех минут и отказаться от супернатанта.
Повторно приостановить кардиомиоциты и 10 миллилитров стоп-раствора, с интервалом в три минуты на 10 микролитров 100 миллимолярный раствор хлорида кальция в четыре раза и перемешать. После четвертого издания центрифуга кардиомиоцитов суспензии при 20 GS в течение трех минут и отказаться от супернатанта. Re приостановить кардиомиоцитов в культуре средств массовой информации Предварительная пластина клеток в 60 миллиметров блюдо и положить в инкубатор CO2 в течение двух-трех часов.
Через два-три часа. Основные типы загрязняющих клеток, такие как волокна взрывов будут придерживаться службы блюдо, что позволяет для чистой изоляции кардиомиоцитов. После этого вынюхив блюдо из инкубатора и соберите плавающие кардиомиоциты в конической трубке и воспроизвете кардиомиоциты в ламинине, покрытом 24 хорошо культурной пластиной.
Четыре-шесть часов достаточно для того, чтобы кардиомиоциты прилиплись к поверхности. Таким образом, трансфекция может быть выполнена через шесть часов после покрытия. Рнк IMAX трансфекции реагент был использован для трансплантации кардиомиоцитов с siRNAs.
Культурные средства массовой информации содержит 25 микромоляных крови Staten дополнены 10%FBS, который мы обнаружили, лучше подходит для выполнения долгосрочной культуры кардиомиоцитов и вызвать анализ распространения. После трансфекции, вы можете просматривать кардиомиоциты с помощью микроскопии с использованием микро-инкубатора, как клетки для замедленной визуализации. Это яркие изображения трансфектированных стержней в форме кардиомиоцитов при низком и высоком увеличении.
Здесь вы можете увидеть изо дня в день изображения, который демонстрирует изменения во взрослой морфологии сердечно-миоцитов мыши. Мы подтверждаем, что кардиомиоциты являются здоровыми и контрактильными в ранние моменты времени, а также после дифференциации D и долгосрочной культуры. Вот пример Ki67 иммунофлуоресцентного окрашивания демонстрации индуцированного распространения взрослых кардиомиоцитов в культуре после siRNAs, трансфекции.
Как вы можете видеть из результатов с помощью этой техники, можно получить здоровые взрослые кардиомиоциты от мыши и крысы и культуры их для долгосрочного изучения. В заключение, после освоения этой техники позволит нам изучать кардиомиоциты далеко за пределами нынешних протоколов культивирования.
