Этот метод более надежен и эффективен и не требует обширной практики или обучения по сравнению с наиболее часто используемыми аппаратными методами Лангендорфа. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он ограничивает время ишемии, так как начальная перфузия происходит in vivo. При выполнении этой техники важно избегать пузырьков в коллекторе и избегать чрезмерного движения сердца во время пищеварения, это может снизить выход.
Продемонстрирует эту технику Сара Стерджилл, аспирант лаборатории доктора Марка Зиоло. Начните с очистки коллектора с регулируемой температурой с помощью свежеприготовленного перфузионного буфера. Для этого вкрутите иглу 27 калибра и очистите пузырьки с помощью соединителя замка Люера.
Следите за тем, чтобы не оставалось пузырьков. Чтобы изолировать кардиомиоцит, обнажают грудину полностью анестезированной мыши и латерально к средней линии разрезают проксимально через ребра и в подмышечную впадину. Затем прорежьте диафрагму, обеспечив неглубокие разрезы, чтобы избежать сердца.
Зажмите грудину гемостатом и сложите ребра назад, чтобы обнажить грудную полость. Осторожно удалите перикард из сердца, прежде чем прорезать нижнюю полую вену непосредственно дистальнее сердца. Введите три миллилитра ледяного очищающего буфера в правый желудочек сердца в течение одной минуты с помощью иглы 27 калибра.
Далее удерживаем сердце с помощью пинцета. Оттяните его от тела и обнаживите как можно большую часть аорты. Затем пережмите восходящую аорту с помощью гемостата и иссеките сердце.
Быстро перенесите зажатое сердце на крышку полипропиленовой чашки Петри, содержащей 10 миллилитров теплого перфузионного буфера. Поместите зажатое сердце в опорную платформу и введите 10 миллилитров перфузионного буфера с регулируемой температурой при температуре 37 градусов Цельсия в левый желудочек в течение пяти минут, используя стабилизированную иглу 27 калибра, прикрепленную к коллектору. Затем перенесите зажатое сердце и опорную платформу в чашку Петри с примерно пятью миллилитрами буфера для пищеварения.
Замените входные шприцы на 50-миллилитровый шприц, содержащий 25 миллилитров буфера для разложения. Очистите коллектор от любых пузырьков и оставшегося буфера перфузии перед инъекцией. Осторожно вставьте иглу в то же положение иглы в верхушке левого желудочка.
С помощью перфузионного насоса введите буфер для пищеварения с температурой 37 градусов Цельсия в левый желудочек в течение 15 минут с помощью шприца объемом 50 миллилитров. Контролируйте температуру раствора с помощью водяной рубашки, откалиброванной для выброса раствора при температуре 37 градусов Цельсия. Удалите желудочки из предсердий, прежде чем переносить их в 10-миллилитровый стакан.
Добавьте в стакан три миллилитра буфера для переваривания и разрежьте желудочки на большие куски острыми ножницами. Накройте стакан алюминиевой фольгой и поставьте на встряхивающую водяную баню, разогретую до 37 градусов Цельсия, на пять минут. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте кусочки ткани в трех миллилитрах буфера для переваривания и растирайте его в течение примерно четырех минут или до тех пор, пока не будет достигнута однородная смесь.
После этого отфильтруйте ячейки в 50-миллилитровую полипропиленовую трубку с помощью 70-микрометрового нейлонового ситечка. Промойте ситечко из нейлоновых клеток тремя миллилитрами буфера для пищеварения. Верните фильтрат в полипропиленовую пробирку с круглым дном объемом 14 миллилитров и центрифугируйте ее.
Выбросьте надосадочную жидкость перед ресуспендированием гранулы в трех миллилитрах стоп-буфера. К клеточной суспензии добавьте 54 микролитра 100 миллимолярного запаса хлорида кальция, чтобы получить конечную концентрацию хлорида кальция 1,8 миллимоля. Дайте живым клеткам отстояться в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость, содержащую мертвые клетки.
После ресуспендирования гранул в растворе для хранения клетки можно использовать для функциональных экспериментов и культур. Изображения изолированных клеток под микроскопом светлого поля показали, что выделение кардиомиоцитов мыши продуцировало палочковидные покоящиеся клетки без мембранных пузырьков или закругленных краев. Клетки показали примерно 80% выход и высокую выживаемость, что определило успех метода изоляции.
Для успешной изоляции очень важно удалить пузырьки из коллектора и ввести иглу в то же отверстие в сердце. После выделения кардиомиоциты могут быть использованы для клеточных и молекулярных функциональных экспериментов.
