Bu videonun amacı yetişkin kardiyomiyosit izolasyon, uzun vadeli kültür ve transfeksiyon için standart bir protokol göstermektir. Fare veya sıçandan kardiyomiyositlerin izole edilmesi ve kültüre alınması, sağlıklı ve hastalıklı kalpteki kardiyomiyositlerin hücre otonom biyolojisini araştırmak için gerekli bir yöntem olmaya devam etmektedir. İzole kardiyomiyositkullanarak cevaplanabileceğimiz birkaç soru var.
Proliferatif potansiyel gibi. Yaralanma yanıtı üzerine gen ekspresyonu değişiklikleri veya spesifik sitokin ekspresyonları vardır. Ne yazık ki, fare kardiyomiyositnormal kültür koşullarında son bir hafta hayatta değildir.
Bu nedenle, bu videoda, yetişkin fare kardiyomiyositleri izole etmek için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlıyoruz, onları 21 gün boyunca aşındırıp kültürediyoruz, bu teknikte ustalaşmak başlangıçta zor. Ama uygulama ile bir izolasyon ve yaklaşık% 100 transfeksiyon verimliliği sonra kardiyomiyosithayatta yaklaşık% 80-90 elde edebilirsiniz. Ve bu kardiyomiyositlerin çoğu son 20 gün hayatta kalabilir.
Cerrahi aletlerinizi 15 dakika %70 alkolle ıslatarak ve daha sonra çift distile su ile yıkayarak temizleyin ve sterilize edin. Sudan sonra, havadaki araçları bir sonraki kurumaya bırakın, her biri beş dakika boyunca iki kez %70 alkol çalıştırarak profüzyon cihazını temizleyin. Akış hızının artırılması, alkolden sonra 10 dakika boyunca çift distile su çalıştırarak kalan alkolü duruladıktan sonra tüpün temizlenmesine yardımcı olacaktır.
eksizyondan sonra kalbi temizlemek için üç tabak ayarlayın. Her tabakları 20 mililitre miyosit tamponuile doldurun. Pasteur pipeti ile her çan araya iki ila üç damla heparin ekleyin ve birden çok kez yukarı ve aşağı boru ile iyice karıştırın.
10 mililitrelik bir şırınga al ve miyosit tamponuyla doldur. Şırıngadan hava kabarcıklarından herhangi birini çıkarın ve üçüncü tabağa yerleştirin ve bantla emniyete alayın. Cerrahi dikiş ile gevşek bir Düğüm hazırlayın ve iğne etrafında yerleştirin.
Anesteziden 20 dakika önce IP enjeksiyonu ile fareye heparin enjekte edin. Dakikada üç mililitre lik bir akış hızında profüzyon cihazı ile miyosit profüzyon tampon dolaşımı. Beş dakika sonra, enzim çözeltisi ile profüzyon tampon değiştirin, süreç sırasında oksijen ile enzim çözeltisi doygun, tekrar, dakikada üç mLs bir akış hızına enzim çözeltisi ayarlayın.
Anesteziyi parmak ucutuile onaylayın ve fareyi cerrahi platforma yerleştirin. % 70 alkol ile cildi sterilize. Dikkatle göğüs açın, kalp egzersiz ve ilk çanak kalp koymak.
Nazik sıkma ile kalpten kan temizleyin, daha sonra daha fazla kalpten kan temizlemek ve herhangi bir kardiyak olmayan dokuları kaldırmak için ikinci çanak için kalp transfer. Daha sonra üçüncü çanak için kalp aktarın. Aort bulun ve Peyton daha cannulating iğne etrafında yerleştirerek tutmak için forceps kullanın.
Önceden sıkı düğüm sıkma aşağı çekerek ve daha sonra ikinci bir düğüm yaparak güvenli. Ek kararlılık için bir klip yardımı ile sipariş ve yer düzeltmek. Herhangi bir aşırı dikiş iplik trim, ve nihayet kalp te kalan kan temizlemek için şırınga içinde miyosit tampon kullanarak kalp profüzyonu başlar.
Hesaplama iğnesini şırıngadan dikkatlice çıkarın ve profüzyon cihazına bağla. Kalbine giden herhangi bir hava kabarcıkları önlemek için girişimi. Bu enzim çözeltisi ve sindirim akışını etkileyebilir gibi.
Profüzyon sırasında kalbe homojen bir ortam sağlamak için su ceketini yukarı taşıyın. Enzim çözeltisinin kalpten dakikada 2-3 mL hızla akmasına izin verin. Enzim çözeltisinin iki dakika boyunca kalpten akmasına izin verin.
İki dakika sonra, enzim çözeltisine 100 mikromolar kalsiyum klorür çözeltisinin 40 mikrolitresini karıştırın. Enzim çözeltisi 10-15 dakika daha kalpten geçsin. Bir kez akış pürüzsüz olur ve kalp kahverengi ve yumuşak görünmeye başlar, eğer kalbin düzgün sindirim elde etmek için kollajenaz enzimi eşit bir dağılım olduğunu biliyorum.
Sindiriminizin tamamolduğunu düşündüğünüzde, kalbi Langendorff perfüzyon sisteminden aşağı alın ve beş mililitre enzim solüsyonuyla dolu 16 milimetrelik Petri kabına koyun ve biyogüvenlik ayağına götürün. Dikkatle atria ve ekstra yağ dokusu kaldırın. Forceps yardımı ile tanımlanan parçalar halinde kalp kıyma.
Steril bir Pasteur pipet alın ve 45 derece onun ucu kesti. Pasteur pipetini kullanarak kalp dokusunu parçalayarak hafifçe pipetleme yaparak kullanın. Optimal sindirim sindirim üzerinde önlemek için enzim aktivitesini durdurmak için durdurmak çözeltisi beş mililitre eklemek sonra tek hücreli kardiyomiyositbir süspansiyon sağlar, Ilk 50 mililitre konik tüp alın ve üzerine steril yüz mikron hücreli süzgeç yerleştirin.
Doku herhangi bir büyük parçalar kaldırmak için hücre süzgeci aracılığıyla kardiyomiyosit süspansiyon geçirin. Son olarak herhangi bir bağlı kardiyomiyosit kalıntıları toplamak için stop çözeltisi ile süzgeç yıkayın. Hücre süspansiyonuna 20 GS'de üç dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.
Kardiyomiyositleri ve 10 mililitre stop çözeltisini 100 milimolar kalsiyum klorür çözeltisinin 10 mikrolitresinde üç dakikalık aralıklarla dört kez askıya alın ve karıştırın. Dördüncü baskıdan sonra kardiyomiyosit süspansiyonu 20 GS'de üç dakika lığına askıya alıp supernatant'ı atın. Yeniden kültür medya içine kardiyomiyositaskıya Ön plaka hücreleri 60 milimetrelik çanak içine ve 2-3 saat co2 kuluçka içine koymak.
2-3 saat içinde. Lif patlamaları gibi ana kirletici hücre tipleri, kardiyomiyositlerin saf izolasyonuna olanak tanıyan çanak servise yapışacaktır. Bundan sonra, kuvöz dışında çanak almak ve konik bir tüp içinde yüzen kardiyomiyosit toplamak ve bir laminin kaplı kardiyomiyositler replayed 24 iyi kültür plakası.
Kardiyomiyositlerin yüzeye yapışması için 4-6 saat yeterlidir. Yani transfeksiyon kaplamadan altı saat sonra yapılabilir. RNA IMAX transfeksiyon reaktifi siRNA ile kardiyomiyosit nakli için kullanıldı.
Kültür medya 25 mikromolar kan Staten içerir 10% FBS ile desteklenmektedir, biz bulduk ki daha iyi uzun vadeli kardiyomiyosit kültürü gerçekleştirmek ve proliferasyon analizi neden uygundur. Transfeksiyondan sonra, mikro kuvöz kullanarak kardiyomiyositleri mikroskobik olarak görüntüleyebilirsiniz. Bunlar düşük ve yüksek büyütme transfected çubuk şeklinde kardiyomiyositler parlak alan görüntüleri.
Burada, yetişkin fare kardiyomiyosit morfolojisindeki değişiklikleri sergileyen günlük görüntülemeyi görebilirsiniz. Kardiyomiyositlerin erken zaman noktalarında, D farklılaşması ve uzun süreli kültürden sonra sağlıklı ve kontraktil olduğunu doğrulıyoruz. İşte ki67 immünofloresan boyama siRNA sonra kültürde yetişkin kardiyomiyositlerin indüklenen çoğalma gösteren bir örnek, bir transfeksiyon.
Bu tekniği kullanarak sonuçlardan da görebileceğiniz gibi, bir uzun vadeli çalışma için fare ve sıçan ve kültür onları sağlıklı yetişkin kardiyomiyosit elde edebilirsiniz. Sonuç olarak, bu teknik hakim bize mevcut culturing protokolleri çok ötesinde kardiyomiyosit çalışma sağlayacaktır.
