이 비디오의 목적은 성인 심근 세포 격리, 장기 문화 및 경질에 대한 표준화 된 프로토콜을 시연하는 것입니다. 마우스 또는 쥐에서 심근세포를 분리하고 배양하는 것은 건강하고 질병 심혼 내의 심근세포의 세포 자율 생물학을 조사하는 필수적인 방법이 계속되고 있습니다. 우리가 고립 된 심근 세포를 사용 하 여 대답할 수 있는 몇 가지 질문이 있다.
증식 가능성과 같은. 상해 반응시 유전자 발현 변화 또는 특정 사이토카인 발현이 있습니다. 불행히도, 마우스 심근세포는 정상적인 문화 조건에서 1 주일 지난 생존하지 않습니다.
따라서,이 비디오에서는 성인 마우스 심근 세포를 분리하고, 이를 고정하고 21 일 이상 배양하는 최적화 된 방법을 설명하며,이 기술은 처음에는 마스터하기 어렵다. 그러나 연습을 통해 약 80~90%가 격리 후 심근세포에서 생존할 수 있으며 약 100% 경질 효율을 달성할 수 있습니다. 그리고 올바른 조건에서 이러한 심근 세포의 대부분은 지난 20 일 살아남을 수 있습니다.
15분 동안 70%의 알코올에 담그고 이중 증류수로 세척하여 수술기구를 청소하고 살균하십시오. 물 후, 다음에 건조하기 위해 공기에 도구를 두고, 각각 5 분 동안 두 번 70 %의 알코올을 실행하여 풍부 장치를 청소합니다. 유량을 늘리면 알코올이 10 분 동안 이중 증류수를 실행하여 남은 알코올을 헹구면 튜브를 청소하는 데 도움이됩니다.
절제 후 심장을 청소하기 위해 세 가지 요리를 설정합니다. 각 요리에 20밀리리터의 심근세포 버퍼를 채웁니다. 파스퇴르 파이펫으로 각 접시에 2~3방울의 헤파린을 넣고 여러 번 위아래로 파이펫을 섞어 웰을 섞습니다.
10 밀리리터 주사기를 가져 와서 심근 세포 버퍼로 채웁니다. 주사기에서 기포를 제거하고 각진 위치에 세 번째 접시에 배치하여 테이프로 고정합니다. 외과 봉합사로 느슨한 매듭을 준비하고 바늘 주위에 놓습니다.
마취 20분 전에 IP 주입을 통해 헤파린으로 마우스를 주입하십시오. 분당 3밀리리터의 유속으로 증혈 장치를 통해 심근세포 풍부완충액을 순환한다. 5분 후, 풍부농축 버퍼를 효소 용액으로 대체하고, 효소 용액을 공정 중에 산소로 포화하고, 다시 효소 용액을 분당 3mLs의 유량으로 설정한다.
발가락 꼬집기로 마취를 확인하고 수술 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 70%의 알코올로 피부를 살균합니다. 조심스럽게 가슴을 열고, 심장을 운동하고 첫 번째 요리에 마음을 넣어.
부드러운 압박으로 심장에서 혈액을 맑게 한 다음 심장에서 혈액을 더 깨끗하게하고 비 심장 조직을 제거하기 위해 두 번째 접시에 심장을 옮기습니다. 그 후 심장을 세 번째 요리로 옮기습니다. 대마를 찾아 서 페이튼 을 더 캐너팅 바늘 주위에 배치 유지 하려면 집게를 사용 하 여.
미리 꽉 매듭을 당기고 두 번째 매듭을 만들어 고정하십시오. 추가 안정성을 위해 클립의 도움으로 순서와 장소를 수정합니다. 여분의 봉합사 실을 다듬고, 마침내 주사기의 심근세포 완충액을 사용하여 심장 이혈을 시작하여 심장에 남아 있는 혈액을 제거합니다.
주사기에서 계산 바늘을 조심스럽게 제거하고 증혈 장치에 연결합니다. 기포가 심장으로 들어가는 것을 막으려고 노력하십시오. 이 효소 용액및 소화의 흐름에 영향을 미칠 수 있습니다.
워터 재킷을 위로 이동하여 풍부한 동안 심장에 균일한 환경을 제공합니다. 효소 용액이 분당 2~3mL의 속도로 심장을 통해 흐르도록 합니다. 효소 용액이 2분 동안 심장을 통해 흐르게 하십시오.
2분 만에 100마이크로몰라 칼슘 염화물 용액의 40마이크로리터를 효소 용액에 섞어 드시면 됩니다. 효소 용액이 심장을 통과하여 10-15분 간 더 지나도록 하십시오. 흐름이 부드러워지고 심장이 갈색이고 부드러워 보이기 시작하면 심장의 적절한 소화를 달성하기 위해 콜라게나아제 효소를 균등하게 분배한다는 것을 알 수 있습니다.
소화가 완료되었다고 생각하면 랑엔도르프 관류 시스템에서 심장을 내려 놓고 5밀리리터의 효소 용액으로 채워진 16mm 페트리 접시에 넣고 생물안전 제고에 넣습니다. 조심스럽게 아리아와 여분의 지방 조직을 제거합니다. 집게의 도움으로 정의 된 조각으로 심장을 다진다.
멸균 파스퇴르 파이펫을 넣고 45도에서 팁을 자른다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 부드럽게 파이프를 위아래로 피펫하여 심장 조직을 분해하십시오. 최적의 소화는 소화를 피하기 위해 효소 활성을 중지하고, 처음 50 밀리리터 원모튜브를 복용하고 멸균 된 백 미콘 세포 스트레이너를 배치하기 위해 5 밀리리터의 스톱 용액을 추가 한 후 단일 세포 심근 세포의 현탁액을 제공합니다.
세포의 큰 덩어리를 제거하기 위해 세포 스트레이너를 통해 심근세포 현탁액을 전달합니다. 마지막으로 부착 된 심근 세포가 남아있는 모든 부착 된 심근 세포를 수집하기 위해 정지 용액으로 여과기를 씻으십시오. 3 분 동안 20 GS에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.
100 밀리머 칼슘 염화물 용액의 10 마이크로 리터에서 3 분 간격으로 심근 세포와 정지 용액의 10 밀리리터를 다시 중단하고 혼합하십시오. 제4판 원심분리기 후 심근세포 현탁액은 20GS에서 3분 동안 정지하고 상판을 폐기한다. 다시 배양 매체로 심근세포를 중단하여 세포를 60mm 접시로 플레이트하고 2~3시간 동안 CO2 인큐베이터에 넣습니다.
2~3시간 만에. 섬유 폭발과 같은 주요 오염 물질 세포 유형은 접시의 서비스에 부착되어 심근세포의 순수한 격리를 허용합니다. 그 후, 인큐베이터에서 접시를 꺼내 원내 튜브에 떠있는 심근세포를 수집하고 24 잘 배양 플레이트를 코팅 한 라미닌에서 심근세포를 재생합니다.
심근세포가 표면에 부착되기에 4~6시간이 면충분합니다. 따라서 도금 후 6시간 후에 는 회신을 수행할 수 있습니다. RNA IMAX 경질 시약은 siRNAs를 가진 심근구를 이식하기 위하여 이용되었습니다.
배양 매체는 10%FBS로 보충된 25개의 마이크로몰라 혈액 스테이언을 포함하고 있으며, 이는 장기 심근세포 배양을 수행하고 증식 분석을 유도하는 데 더 적합하다는 것을 발견했습니다. 형질 검사 후, 마이크로 인큐베이터를 활용하여 심근세포를 볼 수 있습니다. 이들은 낮은 높은 배율에 전관 된 막대 모양의 심근세포의 밝은 필드 이미지입니다.
여기에서, 당신은 성인 마우스 심근 세포 형태에 변화를 보여주는 일 별 이미징을 볼 수 있습니다. 우리는 심근세포가 초기 시점에서 건강하고 수축하고, D 분화 및 장기 문화 후에 도래한다는 것을 확인합니다. 다음은 SiRNAs, transfection 후 배양에서 성인 심근 세포의 유도 된 확산을 보여주는 Ki67 면역 형광 염색의 예입니다.
이 기술을 사용하여 결과에서 볼 수 있듯이 마우스와 쥐에서 건강한 성인 심근세포를 얻고 장기 연구를 위해 문화 할 수 있습니다. 결론적으로, 일단이 기술을 마스터하면 현재 배양 프로토콜을 훨씬 넘어 심근구를 연구 할 수 있습니다.
