Секвенирование нанопор третьего поколения является мощной новой технологией секвенирования, которая позволяет очень легко получить информацию о последовательности из широкого спектра образцов. Основными преимуществами этого метода являются портативность устройства секвенирования, чрезвычайно длинная длина чтения и доступность данных в режиме реального времени. Секвенирование нанопор является особенно полезной технологией во время вспышек болезней в отдаленных районах.
Он успешно используется в полевых лабораториях во время и после вспышек вируса Эбола в Западной и Центральной Африке. Через nanospore секвенирования и использования устройства MinION для этой цели довольно легко, уход должен быть принят во время подготовки библиотеки и во время загрузки потока ячейки. Чтобы начать эту процедуру, создать приземления ПЦР, чтобы усилить cDNA с грунтовка установить один с помощью горячего начала высокой точности ДНК полимеразы с соответствующим буфером реакции в 50 микролитровый объем реакции с одним шаблоном микролитр.
Если возможно, установите реакцию на льду или в прохладном блоке при четырех градусах по Цельсию. Инкубировать реакцию в термоциклере, как указано в текстовом протоколе. После этого перенесите 50 микролитров продукта ПЦР в 1,5 миллилитровую трубку с низкой связывающей реакцией ДНК.
Повторное расследование магнитных бусин тщательно вихревых. Затем добавьте 50 микролитров бисера в реакцию ПЦР и хорошо перемешайте. Инкубировать образец на вращающемся миксере в течение пяти минут при комнатной температуре при повороте при температуре 15 об/мин.
Кратко спина вниз образца, а затем поместить трубку на магнитной стойке гранул магнитных бусин. Подождите, пока супернатант был полностью выяснен, прежде чем продолжить. Далее, аспирировать супернатант, не нарушая гранулы шарика и отбросить его.
Pipette 200 микролитров 70% этанола в реакционной трубке и инкубировать в течение 30 секунд при комнатной температуре. Аспирировать этанол, не нарушая гранулы шарика и отказаться от него. Повторите этот процесс мытья этанолом еще раз в общей сложности два моет.
Воздух высушит гранулы в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем снимите реакционной трубки с магнитной стойки. Повторное производство гранул в 30 микролитров нуклеазы свободной воды и инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут.
Поместите реакционной трубки обратно на магнитной стойке и ждать, пока реакция шарики полностью pelleted. После этого удалите супернатант, не нарушая гранулы и перенесите в новую 1,5 миллилитровую реакционной трубку. Если одновременно секвенировать несколько образцов, штрих-коды теперь могут быть добавлены двумя дополнительными этапами ПЦР с последующим очисткой ДНК, как показано ранее.
Во-первых, объединить равное количество штрих-кодов ДНК из каждого образца в общей сложности один микрограмм ДНК в объеме 45 микролитров в 0,2 миллилитров реакции трубки. Для dA-Tailing добавьте семь микролитров буфера реакции конечной подготовки, три микролитров смеси фермента конечной подготовки и пять микролитров нуклеазы свободной воды. Аккуратно флик трубки для смешивания.
В термоциклере инкубировать реакцию в течение пяти минут при 20 градусах по Цельсию, а затем пять минут при 65 градусах по Цельсию. Далее выполните очистку ПЦР реакции продукта, как указано в текстовом протоколе. Факультативно возьмите один микролитер для количественной оценки концентрации образца с помощью УФ-спектрофотометра.
Объедините 22,5 микролитров ранее полученной очищенной ДНК с 2,5 микролитров адаптера 1D2 и 25 микролитров Blunt/TA Ligase Master Mix в новой 1,5 миллилитровой трубке с низкой связывающей реакцией ДНК. Аккуратно флик трубки для смешивания. Кратко спина вниз смесь и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут.
Затем выполните ПЦР очистку реакционной продукции, как указано в текстовом протоколе. Объедините 45 микролитров реакционной продукции с пятью микролитров смеси адаптера штрих-кодов и 50 микролитров Blunt/TA Ligase Master Mix в трубке с низкой связывающей реакцией ДНК. Аккуратно щелкнуть, чтобы смешать и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
Очистите продукт реакции, описанный в текстовом протоколе, и храните полученный продукт на льду или при четырех градусах Цельсия до готовности к использованию. Для начала выполните проверку качества ячейки потока перед использованием. С этой целью подключите устройство секвенирования к компьютеру-хозяину и откройте программное обеспечение.
Вставьте ячейку потока в устройство секвенирования. Затем выберите тип ячейки потока из окна селектора и нажмите кнопку, доступную для подтверждения. В нижней части экрана щелкните ячейку потока проверки и выберите правильный тип ячейки потока.
Нажмите на стартовый тест, чтобы начать проверку качества. Минимум 800 активных нанопоров в общей сложности требуется для потока ячейки, чтобы быть использованы. Во-первых, откройте покрытие грунтового порта, сдвинув его по часовой стрелке.
Установите пипетку P1000 до 200 микролитров и вставьте наконечник в грунтовку порта. Затем отрегулируйте пипетку до 230 микролитров, сохраняя кончик в грунтовочном порту, чтобы составить от 20 до 30 микролитров буфера и удалить любые пузырьки воздуха. В новой 1,5 миллилитровой ДНК низкой связывающей реакционной трубки подготовьйте грунтовку, объединив 576 микролитров буфера RBF с 624 микролитров нуклеазной свободной воды.
Аккуратно пипетки 800 микролитров подготовленной грунтовки смешайте в грунтовочном порту и подождите пять минут. После этого поднимите образец портового покрытия и пипетку еще 200 микролитров подготовленной грунтовочной смеси в грунтовку порта. Pipette 35 микролитров буфера RBF в новый чистый 1,5 миллилитров ДНК низкой связывающей реакционной трубки.
Тщательно смешайте бусы LLB с помощью пипетки и добавьте 25,5 микролитров бисера в буфер RBF. Далее добавьте 2,5 микролитера нуклеазы свободной воды и 12 микролитров библиотеки ДНК и смешайте с помощью пипетки. Добавьте 75 микролитров образцовой смеси в медленном падении мудрым образом к ячейке потока через порт образца.
Затем замените крышку порта образца, закройте грунтовку порта и закройте крышку устройства секвенирования. В программном обеспечении подтвердите, что ячейка потока по-прежнему доступна. Откройте новый эксперимент и навеяте параметры запуска, выбрав используемый комплект.
Выберите живой basecalling. Начните секвенирование, нажав на начало эксперимента. Продолжайте секвенирование до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество экспериментальных данных.
В репрезентативном эксперименте РНК извлекается из 10 различных образцов крови пяти видов животных. Концентрации РНК наблюдаются между 43 нанограммами и 543 нанограммами на микролитер. После усиления RT-PCR гель-анализ продуктов MPC1 PCR показывает различные результаты с заметно более слабыми полосами для образцов BC01 и BC02.
Эти различия, скорее всего, вызваны различиями в качестве выборки, хотя различия в эффективности ПЦР из-за различий в грунтовой привязки к гену MCP1 различных видов не могут быть исключены. Однако эти различия в урожайности и/или эффективности усиления не оказывают заметного влияния на общий результат последовательности. Затем выбирается подмножество из 10 000 полученных считывания и демултипировано для дальнейшего анализа.
Из 10 000 проанализированных нуклеотидов 5 457 показывают длину от 1 750 до 2000 нуклеотидов, что соответствует ожидаемым размерам фрагментов ПЦР, усиленных в рамках нашего рабочего процесса. Дополнительный пик в распределении длины считых наблюдается между 250 до 500 нуклеотидов, которые могут быть отнесены к неспецифическим продуктам ПЦР. Демультиплексирование считывания позволяет присчитывания 87,6% считывания одному из 10 проанализированных образцов.
Хотя этот метод является достаточно надежным, в полевых условиях, усиление ПЦР является наиболее проблематичным шагом. Во время нашего опыта, вложенные протоколы часто были необходимы для усиления целевых последовательностей. Помимо секвенирования генов животных-хозяина, этот метод также может быть использован для последовательности любой ДНК или РНК, включая вирусные или бактериальные патогены.
Таким образом, секвенирование нанопор в настоящее время все чаще используется не только во время вспышек болезней или для научных исследований в отдаленных районах, но и в обычных лабораториях, где длинная длина чтения открывает новые захватывающие возможности для проведения исследований. Хотя ни один из используемых реагентов не является особо опасным, следует соблюдать стандартную гостистиваторную практику. Очевидно, что при секвенировании агентов болезни, все необходимые меры предосторожности для обработки этих агентов должны соблюдаться.
