Этот протокол имеет важное значение, поскольку он открывает двери для дальнейшего исследования в разработке наномасштабных биологических систем, которые находятся в динамическом равновесии. Этот метод заполняет часть разрыва между инженерными и природными структурами, поскольку он позволяет изучать то, что мы могли бы назвать, самовосстановление или динамическую замену молекулярных компонентов. Самый важный совет для того, чтобы попробовать этот метод в первый раз, чтобы убедиться, что экспериментатор следует всем протоколам безопасности.
Во-первых, подготовить фондовые решения, изложенные в текстовом протоколе. Пипетка 21,8 микролитров BRB80 Buffer в небольшую микро центрифугу трубки. Добавьте 1 микролитер раствора хлорида магния, 1 микролитер раствора запаса GTP и 1,2 микролитера раствора DMSO для завершения подготовки буфера роста микротрубочек.
Чтобы начать полимеризацию микротрубочек, добавьте 6,25 микролитров буфера роста микротрубочек непосредственно в 20 микрограммовую алицитат лиофилизированного тубулина; помечены как возбужденные на 647 нанометров. Вихрь на 40 RPS в течение 5 секунд. Охладить алицит на льду в течение 5 минут.
Затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 45 минут. Для начала стабилизации микротрубочек добавьте 5 микролитров раствора пачлитакселя сликтом в 490 микролитров буфера BRB80. Vortex раствор на 30 RPS в течение 10 секунд.
После того, как 45 минут инкубации для микротрубочек вверх, добавить 5 микролитров этого решения в BRB80, и paclitaxel смеси, чтобы создать раствор MT100. Во-первых, добавьте 9,0 микролитров раствора алицита в 291 микролитер буфера BRB80. Пипетт 83 микролитров раствора корпусина BRB80 в новую 6-миллилитровую микро центрифугу трубки.
Добавьте 1 микролитер D-глюкозы, оксидазы глюкозы, каталазы, ПТТ, фосфата креатина и фосфокиназы. Затем добавьте 1 микролитр раствора АТФ в подвижность раствора. Флик, или вихрь aliquot однородно распространять химические вещества.
Далее добавьте 1 микролитр подготовленного кинезинового раствора в подвижность раствора, так что окончательная концентрация составляет 20 наномоляров. Добавьте 10 микролитров раствора MT100 в подвижность раствора. Для ячеек потока используйте как большую крышку, так и небольшую крышку.
Промыть все крышки дважды этанолом и дважды ультрапурной водой. Sonicate промывают крышки в ультрачистой воде в течение 5 минут. Затем высушите крышки в духовке при температуре от 50 до 75 градусов по Цельсию.
Используйте УФ-озоноочиститель для лечения одной стороны каждой крышки в течение 15 минут при комнатной температуре и в нормальных атмосферных условиях. Используя пинцет, переверните каждый coverslip и использовать УФ-озона для лечения необработанных стороны, а также. Sonicate обработанные крышки в ультрапурной воде в течение 5 минут.
Затем высушите их в духовке при температуре от 50 до 75 градусов по Цельсию. Далее, Дон защитное снаряжение, как указано в текстовом протоколе. Погрузите каждый coverslip в солевой раствор в течение 15 секунд.
Вымойте крышки дважды в толуоле и три раза в метаноле. Используйте под давлением азота, чтобы высушить крышки. Как только крышки высохнут, вырежьте кусок двухсторонней ленты, который составляет 2 сантиметра на 2,5 сантиметра.
Разрежьте этот кусок пополам вертикально на две 1 сантиметр на 2,5 сантиметра полосы. Положите большую крышку на тонкий стеклоочиститель задачи и придерживаться ленты полосы к нему, длина-мудрый по краям, чтобы создать 1 сантиметр на 2,5 сантиметра области между кусочками ленты. Stick небольшой крышкой на верхней части ленты полосы, чтобы закончить сборку потока ячейки.
Во-первых, поток около 20 микролитров решения PEG-PPG-PEG в собранный поток ячейки. Пусть раствор поглощается на поверхности в течение 5 минут, затем, обменять это решение с 20 микролитров буфера BRB80 три раза, пропуская буфер дюйма Поток 20 микролитров подвижного раствора в ячейку потока.
После этого, печать края потока ячейки с жиром, чтобы предотвратить испарение, если запланированный эксперимент длится более часа. Выполняйте визуализацию с помощью полной внутренней микроскопии флорескции объективного типа. Поместите каплю масла погружения на цель.
Затем поместите ячейку потока на платформу микроскопа. И довести цель до тех пор, пока есть контакт между нефтью на цель и поток ячейки. Используйте систему блокировки микроскопа, чтобы заблокировать весь лазерный свет от побега.
Затем включите лазер и сосредоточьтесь на нижней поверхности клетки потока с помощью 642 нанометрового лазера для изображения микротрубочек и 488 нанометрового лазера для изображения кинезиновых двигателей GFP. Запись изображений или видео, представляющих интерес. Изображения могут быть записаны до тех пор, пока есть подвижность в ячейке потока.
В этом исследовании представлена активная наномасштабная система, которая самостоятельно собирает слабо связывающие строительные блоки для построения собственного трека. С помощью микроскопии тифа, скользящие микротрубоконы по отдельности изображены от кинезин-моторов. Микротрубоконы видны при возбуждении с помощью 647 нанометрового лазера.
И GFP кинезин видны, когда возбужденных с 488 нанометровый лазер. Время между возбуждением и красным и зеленым светом было менее одной секунды. Как видно, скользящие микротрубоконы накапливают кинезин-двигатели из раствора и откладывают их на поверхность.
Кинезин двигатели остаются в результате микротрубочек в течение короткого периода времени, прежде чем вернуться к раствору. Очень важно иметь правильную концентрацию реагентов в антифаде подвижности раствора, в противном случае, отбеливание фотографий приведет к провалу эксперимента. Этот метод прокладывает путь для более эффективного использования белковых двигателей в наномасштабных инженерных системах.
Таким образом, позволяет проектировать и изучать более сложные наноструктуры.
