Ce protocole est significatif parce qu’il ouvre la porte à une étude plus approfondie dans la conception de systèmes biologiques à l’échelle nanométrique qui sont en équilibre dynamique. Cette technique comble une partie de l’écart entre les structures techniques et naturelles, car elle permet l’étude de ce que nous pourrions appeler, l’auto-guérison ou le remplacement dynamique des composants moléculaires. Le conseil le plus important pour essayer cette technique pour la première fois est de s’assurer que l’expérimentateur suit tous les protocoles de sécurité.
Tout d’abord, préparer les solutions de stock telles qu’décrites dans le protocole de texte. Pipette 21,8 microlitres de BRB80 Buffer dans un petit tube de micro centrifugeuse. Ajoutez 1 microlitre de la solution de stock de chlorure de magnésium, 1 microlitre de la solution de stock GTP et 1,2 microlitres de la solution de stock DMSO pour terminer la préparation du tampon de croissance des microtubules.
Pour commencer la polymérisation des microtubules, ajoutez 6,25 microlitres de tampon de croissance de microtubules directement dans un aliquot de 20 microgrammes de tubuline lyophilisée; Vortex à 40 RPS pendant 5 secondes. Laisser refroidir l’aliquot sur la glace pendant 5 minutes.
Puis, incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Pour commencer la stabilisation des microtubules, ajoutez 5 microlitres de la solution paclitaxel aliquoted à 490 microlitres de tampon BRB80. Vortex la solution à 30 RPS pendant 10 secondes.
Une fois que les 45 minutes d’incubation des microtubules sont en place, ajouter 5 microlitres de cette solution au mélange BRB80, et paclitaxel, pour créer la solution MT100. Tout d’abord, ajouter 9,0 microlitres de la solution de caséine aliquoted à 291 microlitres de tampon BRB80. Pipette 83 microlitres de la solution de caséine BRB80 dans un nouveau tube de micro centrifugeuse de 6 millilitres.
Ajouter 1 microlitre de D-glucose, oxidase de glucose, catalase, TNT, phosphate de créatine, et phosphokinase. Ensuite, ajoutez 1 microlitre de la solution ATP stock à la solution de motilité. Feuilletez, ou vortex l’aliquot pour répartir homogènement les produits chimiques.
Ensuite, ajoutez 1 microlitre de solution de kinésine préparée à la solution de motilité, de sorte que la concentration finale est de 20 nanomolaires. Ajoutez 10 microlitres de la solution MT100 à la solution de motilité. Pour les cellules d’écoulement, utilisez à la fois un grand coverslip et un petit coverslip.
Rincer tous les coverslips deux fois avec de l’éthanol et deux fois avec de l’eau ultrapure. Sonicate les coverslips lavés dans l’eau ultrapure pendant 5 minutes. Ensuite, séchez les couvercles dans un four à une température comprise entre 50 et 75 degrés Celsius.
Utilisez un nettoyant uv-ozone pour traiter un côté de chaque glissement pendant 15 minutes à température ambiante et dans des conditions atmosphériques normales. À l’aide d’une pince à épiler, retourner chaque glissement et utiliser l’ozone UV pour traiter le côté non traité. Sonicate les coverslips traités dans l’eau ultrapure pendant 5 minutes.
Ensuite, séchez-les dans un four à une température comprise entre 50 et 75 degrés Celsius. Ensuite, enz l’équipement de protection tel que décrit dans le protocole de texte. Plongez chaque coverslip dans une solution saline pendant 15 secondes.
Laver les coverslips deux fois en toluène et trois fois en méthanol. Utilisez de l’azote pressurisé pour sécher les couvercles. Une fois que les coverslips sont secs, couper un morceau de ruban adhésif à double face qui est de 2 centimètres par 2,5 centimètres.
Couper cette pièce en deux verticalement en deux bandes de 1 centimètre par 2,5 centimètres. Mettez le grand coverslip sur un essuie-glace de tâche délicat et collez les bandes de bande à elle, longueur-sage le long des bords pour créer une zone de 1 centimètre par 2.5 centimètre entre les morceaux de bande. Coller le petit coverslip sur le dessus des bandes de ruban pour terminer l’assemblage de la cellule d’écoulement.
Tout d’abord, écoulez environ 20 microlitres de la solution PEG-PPG-PEG dans la cellule d’écoulement assemblée. Laissez la solution absorber à la surface pendant 5 minutes, puis, échanger cette solution avec 20 microlitres de tampon BRB80 trois fois en faisant circuler le tampon. Écoulez 20 microlitres de la solution de motilité dans la cellule d’écoulement.
Après cela, sceller les bords de la cellule d’écoulement avec de la graisse pour éviter l’évaporation si l’expérience prévue est plus longue qu’une heure. Effectuez l’imagerie à l’aide d’une microscopie interne totale de florescence de type objectif. Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif.
Ensuite, placez la cellule d’écoulement sur la plate-forme du microscope. Et amener l’objectif jusqu’à ce qu’il y ait un contact entre l’huile sur l’objectif et la cellule d’écoulement. Utilisez le système de couverture antiblocage du microscope pour empêcher toute lumière laser de s’échapper.
Ensuite, allumez le laser et concentrez-vous sur la surface inférieure de la cellule d’écoulement à l’aide d’un laser de 642 nanomètres pour imager les microtubules, et d’un laser de 488 nanomètres pour imager les moteurs de kinésine GFP. Enregistrez les images ou vidéos d’intérêt. Les images peuvent être enregistrées aussi longtemps qu’il y a motilité dans la cellule d’écoulement.
Dans cette étude, un système nanométrique actif, qui auto-assemble des blocs de construction faiblement contraignants pour construire sa propre piste, est présenté. À l’aide de la microscopie tirf, les microtubules glissants sont imagent séparément des moteurs kinésine. Les microtubules sont visibles lors de l’excitation avec un laser de 647 nanomètres.
Et la kinésine GFP sont visibles lorsqu’elle est excitée par un laser de 488 nanomètres. Le temps entre l’excitation et le feu rouge et vert était de moins d’une seconde. Comme on peut le voir, les microtubules planants accumulent les moteurs de kinésine de la solution et les déposent à la surface.
Les moteurs kinésine restent dans le sillage des microtubules pendant une courte période de temps avant de revenir à la solution. Il est très important d’avoir la concentration correcte de reagents dans l’antifade de la solution de motilité, sinon, le blanchiment photo provoquerait l’échec de l’expérience. Cette technique ouvre la voie à une utilisation plus efficace des moteurs protéiques dans les systèmes d’ingénierie à l’échelle nanométrique.
Ainsi, permettant la conception et l’étude de nanostructures plus complexes.
