Este protocolo es significativo porque abre la puerta a una mayor investigación en el diseño de sistemas biológicos a nanoescala que están en equilibrio dinámico. Esta técnica llena parte de la brecha entre las estructuras diseñadas y naturales porque permite el estudio de lo que podríamos llamar, la autorreparación'o el reemplazo dinámico de componentes moleculares. El consejo más importante para probar esta técnica por primera vez es asegurarse de que el experimentador está siguiendo todos los protocolos de seguridad.
En primer lugar, prepare las soluciones de stock como se describe en el protocolo de texto. Pipetear 21,8 microlitros de BRB80 Buffer en un pequeño tubo de micro centrífuga. Añadir 1 microlitro de la solución de material de cloruro de magnesio, 1 microlitro de la solución de material GTP y 1,2 microlitros de la solución de stock DMSO para terminar de preparar el tampón de crecimiento de microtúbulos.
Para comenzar la polimerización de microtúbulos, agregue 6,25 microlitros de tampón de crecimiento de microtúbulos directamente en una alícuota de 20 microgramos de tubulina liofilizada;etiquetada para excitarse a 647 nanómetros. Vórtice a 40 RPS durante 5 segundos. Enfríe la alícuota sobre hielo durante 5 minutos.
Luego, incubar a 37 grados Celsius durante 45 minutos. Para iniciar la estabilización de microtúbulos, añada 5 microlitros de la solución de paclitaxel alícuota a 490 microlitros de tampón BRB80. Vortex la solución a 30 RPS durante 10 segundos.
Una vez que haya terminados los 45 minutos de incubación de los microtúbulos, añadir 5 microlitros de esa solución a la mezcla BRB80, y paclitaxel, para crear la solución MT100. En primer lugar, añada 9,0 microlitros de la solución de caseína alícuota alícuo a 291 microlitros de tampón BRB80. Pipetear 83 microlitros de la solución de caseína BRB80 en un nuevo tubo de micro centrífuga de 6 mililitros.
Añadir 1 microlitro de D-glucosa, glucosa oxidasa, catalasa, TDT, fosfato de creatina y fosfoquinasa. A continuación, agregue 1 microlitrotro de la solución de ATP a la solución de motilidad. Flick, o vórtice la alícuota para distribuir homogéneamente los productos químicos.
A continuación, añadir 1 microlitro de solución de kinesina preparada a la solución de motilidad, de modo que la concentración final sea de 20 nanomolares. Agregue 10 microlitros de la solución MT100 a la solución de motilidad. Para las celdas de flujo, utilice un cubreobjetos grande y un cubreobjetos pequeño.
Enjuague todos los cubreobjetos dos veces con etanol y dos veces con agua ultrapura. Sonicar los cubreobjetos lavados en agua ultrapura durante 5 minutos. A continuación, seque los cubreobjetos en un horno a una temperatura entre 50 y 75 grados centígrados.
Utilice un limpiador de ozono UV para tratar un lado de cada cubreplo durante 15 minutos a temperatura ambiente y en condiciones atmosféricas normales. Usando pinzas, voltee cada cubreobjetos y use el ozono UV para tratar el lado no tratado también. Sonicar los cubreobjetos tratados en agua ultrapura durante 5 minutos.
Luego, séquelos en un horno a una temperatura entre 50 y 75 grados centígrados. A continuación, no haga equipo de protección como se describe en el protocolo de texto. Sumerja cada cubreobjetos en solución salina durante 15 segundos.
Lave los cubreobjetos dos veces en tolueno y tres veces en metanol. Utilice nitrógeno presurizado para secar los cubreobjetos. Una vez que los cubreobjetos estén secos, corte un trozo de cinta adhesiva de doble cara de 2 centímetros por 2,5 centímetros.
Corte esta pieza por la mitad verticalmente en dos tiras de 1 centímetro por 2,5 centímetros. Coloque el cubreobjetos grande en un delicado limpiaparabrisas y pegue las tiras de cinta en él, a lo largo de los bordes para crear un área de 1 centímetro por 2,5 centímetros entre las piezas de cinta. Pegue el cubreobjetos pequeño en la parte superior de las tiras de cinta para terminar el conjunto de celdas de flujo.
En primer lugar, fluya aproximadamente 20 microlitros de la solución PEG-PPG-PEG en la celda de flujo ensamblada. Deje que la solución absorba en la superficie durante 5 minutos, luego, intercambie esta solución con 20 microlitros de tampón BRB80 tres veces fluyendo el búfer. Flujo 20 microlitros de la solución de motilidad en la celda de flujo.
Después de esto, selle los bordes de la celda de flujo con grasa para evitar la evaporación si el experimento planificado es más de una hora. Realice la toma de imágenes utilizando una microscopía de florescencia interna total de tipo objetivo. Coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo.
A continuación, coloque la celda de flujo en la plataforma del microscopio. Y subir el objetivo hasta que haya contacto entre el aceite en el objetivo y la celda de flujo. Utilice el sistema de cubierta de enclavamiento del microscopio para bloquear el escape de toda la luz láser.
A continuación, encienda el láser y concéntrese en la superficie inferior de la celda de flujo utilizando un láser de 642 nanómetros para crear imágenes de los microtúbulos, y un láser de 488 nanómetros para crear imágenes de los motores de kinesina GFP. Graba las imágenes o vídeos de interés. Las imágenes se pueden grabar mientras haya motilidad en la celda de flujo.
En este estudio, se presenta un sistema activo de nanoescala, que se automonta bloques de construcción débilmente vinculantes para construir su propia vía. Mediante la microscopía de timón, los microtúbulos deslizantes se visualizan por separado de los motores de kinesina. Los microtúbulos son visibles al excitar con un láser de 647 nanómetros.
Y la kinesina GFP son visibles cuando se excita con un láser de 488 nanómetros. El tiempo entre la excitación y la luz roja y verde fue de menos de un segundo. Como se puede ver, los microtúbulos deslizantes acumulan motores de kinesina a partir de la solución y los depositan en la superficie.
Los motores de kinesina permanecen a raíz de los microtúbulos durante un corto período de tiempo antes de volver a la solución. Es muy importante tener la concentración correcta de reactivos en el antifado de la solución de motilidad, de lo contrario, el blanqueo fotográfico haría que el experimento fallara. Esta técnica allana el camino para un uso más eficiente de los motores proteicos en sistemas de ingeniería a nanoescala.
Por lo tanto, permite el diseño y estudio de nanoestructuras más complejas.
