Переэкспрессирование генов в клетках является важным способом изучения функции генов. Стабильная трансфекция с ретровирусом позволяет интегрировать эндогенные гены в геном хозяина и постоянно выражалась. Мы подобрали одиночные колонии ретровирусной инфекции и создали стабильные клеточные линии, переэкспрессивные FLAG-tagged DR3.
Клеточные линии компенсировали отсутствие хорошего антитела DR3 и предоставили отличные инструменты для исследования функции DR3 после in vitro и in vivo. Мы создали DR3 переэкспрессионных клеточных линий, подбирая одну колонию ретровирусной инфекции. Клеточные линии из одной колонии могли поддерживать однородность и чистоту.
Кроме того, протокол прост и прост в обращении. Чтобы начать эту процедуру, вырастить клетки плат-А на ночь в 60-миллиметровой посуде с четырьмя миллилитров DMEM. Когда клетки достигают 80 до 90% слияния, используйте трансфектический реагент, чтобы заразить их двумя микрограммами построенной плазмиды, как указано в руководстве производителя.
Через 72 часа соберите супернатант. Используя стерильный фильтр 0,45 микрометра, фильтруйте средства массовой информации и держите вирусную подвеску в темноте при четырех градусах Цельсия. Далее, расти HT29 клеток на ночь в 60-миллиметровой тарелке с DMEM, инкубации клеток при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.
Когда клетки достигают 30-50% слияния, заразить их двумя миллилитров вирусной суспензии в присутствии восьми микрограмм полибрена на миллилитр вирусной суспензии. Инкубировать инфицированные клетки при 37 градусах по Цельсию в течение четырех-шести часов. Затем, аспирировать вирусной подвески.
Добавьте четыре миллилитров свежего DMEM и верните блюдо в инкубатор. В течение 24 часов после заражения, удалить средства массовой информации из посуды и тщательно мыть клетки с двумя миллилитров предварительно разогретой PBS. Добавьте один миллилитр трипсина ЭДТА и инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение трех минут.
Используя микроскоп в 10 раз больше, наблюдать клетки, чтобы убедиться, что большинство из них отделились. После этого добавьте два миллилитров DMEM, содержащих 10%FBS, чтобы остановить трипсинизацию, и соберите подвеску клетки в 15-миллилитровую трубку. Центрифуга при 200 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре, и удалить супернатант.
Повторно приостановить ячейки гранулы в 10 миллилитров DMEM и осторожно пипетки вверх и вниз, чтобы смешать. Затем разбавляют клетки факторами 30, 100 и 300. Семена клеток 150-миллиметровые блюда, каждая из которых содержит 20 миллилитров DMEM, содержащих блацитидин в концентрации одного микрограмма на миллилитр.
Инкубационный при 37 градусах по Цельсию с 5%-ным содержанием углекислого газа в течение примерно одной-двух недель. В течение этого периода используйте перевернутый микроскоп при 10-м увеличении, чтобы наблюдать за колониями каждый день. Отметь хорошо изолированные колонии на дне блюда, когда диаметр колоний составляет примерно один-два миллиметра.
Когда инкубационный период завершен, аспирировать среды и мыть клетки с тремя миллилитров предварительно разогретых PBS. Добавьте два миллилитров трипсина ЭДТА в 60-миллиметровое блюдо. Используйте стерильные типсы, чтобы подобрать автоклавные стерильные клонирование цилиндров и поместить их в блюдо.
Затем возьмите цилиндры, которые теперь будут содержать около 30 микролитров трипсина EDTA, и аккуратно поместите их над отмеченными колониями. Верните блюдо в инкубатор на три минуты. После этого проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они отделились.
Когда клетки подняли вверх, на 70 микролитров культуры среды для каждого цилиндра, чтобы инактивировать трипсин. Используйте 200-микролитровую пипету, чтобы аккуратно смешать подвеску клетки, убедившись, что не перемещать цилиндр во время смешивания. Установите две пластины 24-хорошо, и этикетки их пластины и пластины B.Add один миллилитр DMEM к каждому хорошо.
Добавьте 30 микролитров клеточной подвески к каждому колодце пластины А и добавьте 70 микролитров в соответствующие скважины пластины B.Place пластины обратно в инкубатор. Когда клетки в пластине В находятся на 90% слияния, удалить средства массовой информации и тщательно мыть клетки с одним миллилитром PBS. Удалили PBS полностью, и добавить 50 микролитров 1X SDS-PAGE загрузки буфера для облизать клетки.
Через пять минут перенесите лисат клетки с 24-хорошой пластины на 1,5-миллилитровые центрифуги. Отварить образцы при 100 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Вы запустите образцы на 10%SDS гель при постоянном напряжении 80 вольт в течение 15 минут, а затем на 120 вольт в течение одного часа.
Затем перенесите белок в поливинилиновую фторсодержатную мембрану путем влажной передачи при постоянном токе 400 миллиампер в течение двух часов. Разбавить первичное антитело в 5 000 раз в 5% обезжиренного молока, растворенного в ТБСТ. Добавьте антитела FLAG к мембране, и инкубировать на 4 градусах Celsius всю ночь.
Используя шейкер для декалорирования до 200 об/мин, мыть мембрану с TBST в течение 15 минут, освежая TBST каждые пять минут. Затем разбавляют антимошачные вторичные антитела в 10 000 раз в 5% обезжиренного молока. Инкубировать мембрану разбавленными вторичными антителами при четырех градусах цельсия в течение пяти-шести часов.
Вымойте мембрану на раскряжке шейкер снова, как описано ранее. После этого используйте западную улучшенную химилюминесценцию и систему документации по гелю для изображения мембраны и обнаружения выражения FLAG. Во-первых, собирать как HT29 и HT29-DR3 клетки путем трипсинизации, и использовать автоматический счетчик ячейки для измерения плотности клеток.
Семя клеток в колодцы 12-хорошо пластин с DMEM при плотности 30000 клеток на скважину, и инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа. На следующий день добавьте 10 наномоляров диазономида к каждой пластине, которая содержит клетки, использующие 1%DMSO в качестве отрицательного контроля, и перенесите пластины в инкубатор при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. После 48 часов лечения, изображение клеток под микроскопом в 10 раз больше.
Далее, семена как HT29 и HT29-DR3 клетки в скважины 96-хорошо пластины с DMEM при плотности 3000 клеток на скважину, и позволяют им расти при 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующий день добавьте концентрации диасонамида, как указано в текстовом протоколе. После 48 часов лечения используйте набор анализа жизнеспособности клеток на основе люминесценции для измерения жизнеспособности клеток.
Удалите 96-хорошо пластины из инкубатора, и пусть он стоит при комнатной температуре в течение примерно 30 минут. Затем добавьте 50 микролитров анализаторов реагентов к каждому хорошо, и встряхните пластину в течение двух минут при комнатной температуре, чтобы подоцеть клетки. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем использовать микроплюрат считыватель для определения люминесценции каждого хорошо.
Характеристика клеток HT29, стабилизирующих DR3, показывает, что клоны выражают различные уровни DR3, в то время как клетки дикого типа не показывают экзогенную экспрессию генов. Гены один и пять, как видно, выражают самые высокие уровни DR3, и поэтому выбираются для дальнейших экспериментов. Морфология клеток HT29 и HT29-DR3 наблюдается после лечения в течение 48 часов диасонамидом.
Клетки HT29-DR3 демонстрируют очевидный апоптоз со сломанной клеточной мембраной и клеточным мусором. Тем не менее, HT29 клетки показывают только митотический арест с нетронутыми клетками, которые демонстрируют форму обгоночные клетки. Клеточная жизнеспособность этих типов клеток определяется после лечения в течение 48 часов с тремя наномолярами диасонамида.
HT29-DR3 клетки, как видно, клеточной смерти более 80%, в то время как родительские клетки HT29 демонстрируют лишь небольшую реакцию в виде митотического ареста. Это указывает на то, что переэкспрессия DR3 воссоздала диасонамид-индуцированный апоптотический путь в этих клетках. Правильные серийные разбавления важны для достижения оптимальной плотности одиночных клонов.
Важно также убедиться, что каждый цилиндр клона содержит только одну колонию и избежать загрязнения близлежащих колоний. Переэкспрессирование клеточных линий DR3 способствовало биохимическому изучению молекулярных механизмов in vitro. Мы создали ксенотрансплантаты HT29-DR3 путем подкожной инъекции клеток HT29-DR3, и это помогло разработать механизмы антимитотических агентов, вызванных апоптозом in vivo.
Этот протокол может быть использован для изучения генов, представляющих интерес в других клеточных линиях. Кроме того, генный нокаут является еще одним способом функционального изучения, и наш протокол может быть адаптирован к системам нокдауна генов. Таким образом, это, как правило, применимо к разъясняют функции генов.
Не забудьте сбросить вирус реле на мусор в конкретные контейнеры для безопасного удаления.
