La surexpression des gènes dans les cellules est un moyen important d’étudier la fonction génétique. La transfection stable avec le rétrovirus permet d’intégrer des gènes endogènes dans le génome hôte et de s’exprimer en permanence. Nous avons ramassé des colonies simples de l’infection rétrovirale et généré des lignées cellulaires stables surexprimant flag-marqué DR3.
Les lignées cellulaires ont compensé l’indisponibilité d’un bon anticorps DR3 et fourni d’excellents outils pour l’étude de la fonction DR3 post in vitro et in vivo. Nous avons généré les lignées cellulaires de surexpression DR3 en ramassant une seule colonie de l’infection rétrovirale. Les lignées cellulaires d’une seule colonie pourraient maintenir l’homogénéité et la pureté.
En outre, le protocole est facile et simple à manipuler. Pour commencer cette procédure, faire pousser les cellules plat-A pendant la nuit dans des plats de 60 millimètres avec quatre millilitres de DMEM. Lorsque les cellules atteignent 80 à 90% de confluent, utilisez le réaccente de transfection pour les transfectionr avec deux microgrammes du plasmide construit tel que décrit dans le manuel du fabricant.
Après 72 heures, recueillir le surnatant. À l’aide d’un filtre stérile de 0,45 micromètre, filtrez les médias et gardez la suspension virale dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Ensuite, cultivez des cellules HT29 pendant la nuit dans un plat de 60 millimètres avec DMEM, incubant les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Lorsque les cellules atteignent 30 à 50% de confluence, infectez-les avec deux millilitres de suspension virale en présence de huit microgrammes de polybrene par millilitre de suspension virale. Incuber les cellules infectées à 37 degrés Celsius pendant quatre à six heures. Ensuite, aspirez la suspension virale.
Ajouter quatre millilitres de DMEM frais et remettre le plat à l’incubateur. À 24 heures après l’infection, retirer les médias de la vaisselle et laver soigneusement les cellules avec deux millilitres de PBS préchauffé. Ajouter un millilitre de trypsine EDTA, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.
À l’aide d’un microscope à 10 fois grossissement, observez les cellules pour s’assurer que la plupart d’entre elles se sont détachées. Après cela, ajouter deux millilitres de DMEM contenant 10%FBS pour arrêter la trypsinisation, et de recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes à température ambiante, et enlever le surnatant.
Suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 10 millilitres de DMEM et pipette doucement de haut en bas pour mélanger. Ensuite, diluer les cellules par des facteurs de 30, 100 et 300. Les graines des cellules sont des plats de 150 millimètres qui contiennent chacun 20 millilitres de DMEM contenant de la blasticidine à une concentration d’un microgramme par millilitre.
Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant environ une à deux semaines. Pendant cette période, utilisez un microscope inversé à 10 fois le grossissement pour observer les colonies chaque jour. Marquez les colonies bien isolées au fond du plat lorsque le diamètre des colonies est d’environ un à deux millimètres.
Lorsque la période d’incubation est terminée, aspirer le milieu et laver les cellules avec trois millilitres de PBS préchauffé. Ajouter deux millilitres de trypsine EDTA dans un plat de 60 millimètres. Utilisez des forceps stériles pour ramasser les cylindres stériles de clonage autoclavés et les placer dans le plat.
Ensuite, prenez les cylindres qui contiennent maintenant chacun environ 30 microlitres de trypsine EDTA, et placez-les doucement sur les colonies marquées. Remettre le plat à l’incubateur pendant trois minutes. Après cela, vérifiez les cellules au microscope pour s’assurer qu’elles se sont détachées.
Lorsque les cellules se sont levées, à 70 microlitres de culture moyenne à chaque cylindre pour inactiver la trypsine. Utilisez une pipette de 200 microlitres pour mélanger délicatement la suspension cellulaire, en vous assurant de ne pas déplacer le cylindre pendant le mélange. Mettez en place deux plaques de 24 puits, et étiquetez-les plaque A et plaque B.Ajouter un millilitre de DMEM à chaque puits.
Ajouter 30 microlitres de suspension cellulaire à chaque puits de la plaque A et ajouter 70 microlitres aux puits correspondants de la plaque B.Placez les plaques dans l’incubateur. Lorsque les cellules de la plaque B sont à 90% confluent, retirez le média et lavez soigneusement les cellules avec un millilitre de PBS. Retirer complètement le PBS et ajouter 50 microlitres de tampon de chargement 1X SDS-PAGE pour lyser les cellules.
Après cinq minutes, transférer le lysate cellulaire de la plaque de 24 puits à des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Faire bouillir les échantillons à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Faire fonctionner les échantillons sur du gel 10% SDS à une tension constante de 80 volts pendant 15 minutes, puis à 120 volts pendant une heure.
Ensuite, transférez la protéine à une membrane de fluorure polyvinylidene par transfert humide à un courant constant de 400 milliamps pendant deux heures. Diluer l’anticorps primaire par un facteur de 5000 dans 5% de lait non gras dissous dans le TBST. Ajouter l’anticorps FLAG à la membrane et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
À l’aide d’un shaker décoloré réglé à 200 RPM, laver la membrane avec le TBST pendant 15 minutes, en rafraichissant le TBST toutes les cinq minutes. Ensuite, diluer un anticorps secondaire anti-souris par un facteur de 10 000 dans 5% de lait non gras. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire dilué à quatre degrés Celsius pendant cinq à six heures.
Lavez la membrane sur le shaker décolorant à nouveau comme décrit précédemment. Après cela, utilisez la chemiluminescence améliorée occidentale et un système de documentation de gel pour imager la membrane et détecter l’expression flag. Tout d’abord, recueillir à la fois HT29 et HT29-DR3 cellules par trypsinisation, et utiliser un compteur de cellules automatiques pour mesurer la densité cellulaire.
Ensemencer les cellules dans les puits de plaques de 12 puits avec du DMEM à une densité de 30 000 cellules par puits, et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, ajouter 10 nanomolaires de diazonamide à chaque puits qui contient des cellules utilisant 1% DMSO comme un contrôle négatif, et transférer les plaques à un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après 48 heures de traitement, imagez les cellules au microscope à 10 fois grossissement.
Ensuite, les graines à la fois HT29 et HT29-DR3 cellules dans les puits de plaque de 96 puits avec DMEM à une densité de 3000 cellules par puits, et leur permettre de croître à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez des concentrations de diazonamide qui augmentent la dose, comme le décrit le protocole textuel. Après 48 heures de traitement, utilisez un kit d’analyse de viabilité cellulaire à base de luminescence pour mesurer la viabilité cellulaire.
Retirer la plaque de 96 puits de l’incubateur et la laisser reposer à température ambiante pendant environ 30 minutes. Ensuite, ajouter 50 microlitres de réacciens d’essai à chaque puits, et secouer la plaque pendant deux minutes à température ambiante pour lyse les cellules. Incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes, puis utiliser un lecteur de microplaque pour déterminer la luminescence de chaque puits.
La caractérisation des cellules HT29 exprimant stably DR3 révèle que les clones expriment différents niveaux de DR3 tandis que les cellules de type sauvage ne montrent pas l’expression exogène de gène. Les gènes un et cinq sont considérés comme exprimer les niveaux les plus élevés de DR3, et sont donc choisis pour d’autres expériences. La morphologie des cellules HT29 et HT29-DR3 est observée après avoir été traitée pendant 48 heures avec du diazonamide.
Les cellules HT29-DR3 présentent une apoptose évidente avec une membrane cellulaire cassée et des débris cellulaires. Cependant, les cellules HT29 ne montrent que l’arrêt mitotique avec des cellules intactes qui présentent une forme cellulaire arrondie. La viabilité cellulaire de ces types de cellules est ensuite déterminée après avoir été traitée pendant 48 heures avec trois nanomolaires de diazonamide.
Les cellules HT29-DR3 sont considérées comme une mort cellulaire de plus de 80%, tandis que les cellules parentales HT29 ne démontrent qu’une légère réponse sous forme d’arrestation mitotique. Ceci indique que la surexpression de DR3 a reconstitué la voie apoptotique diazonamide-induite dans ces cellules. Les dilutions en série appropriées sont importantes pour obtenir une densité optimale de clones simples.
Il est également important de s’assurer que chaque cylindre clone ne contient qu’une seule colonie et d’éviter de contaminer les colonies voisines. Les lignées cellulaires surexprimantes DR3 ont facilité l’étude biochimique des mécanismes moléculaires in vitro. Nous avons généré des xénogreffes HT29-DR3 par injection sous-cutanée de cellules HT29-DR3, et il a aidé à élaborer les mécanismes de l’apoptose induite par les agents antimitotic in vivo.
Ce protocole peut être utilisé pour étudier les gènes d’intérêt dans d’autres lignées cellulaires. En outre, le ko génétique est une autre façon d’étudier fonctionnellement, et notre protocole peut être adapté aux systèmes de knockdown génétique. Ainsi, il est généralement applicable aux fonctions génétiques élucidées.
N’oubliez pas de déposer le relais du virus à la poubelle dans des contenants spécifiques pour l’élimination de la sécurité.
