I geni sovraespressivi nelle cellule sono un modo importante per studiare la funzione genica. La trasfezione stabile con il retrovirus consente ai geni endogeni di essere integrati nel genoma ospite ed essere espressi continuamente. Abbiamo raccolto singole colonie dell'infezione retrovirale e generato linee cellulari stabili che sovraesprimevano la DR3 con tag FLAG.
Le linee cellulari compensano l'indisponibilità di un buon anticorpo DR3 e hanno fornito strumenti eccellenti per lo studio della funzione DR3 post in vitro e in vivo. Abbiamo generato le linee cellulari di sovraespressione DR3 raccogliendo una singola colonia dell'infezione retrovirale. Le linee cellulari di una singola colonia potevano mantenere l'omogeneità e la purezza.
Inoltre, il protocollo è facile e semplice da gestire. Per iniziare questa procedura, far crescere le cellule plat-A durante la notte in piatti da 60 millimetri con quattro millilitri di DMEM. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, utilizzare il reagente di trasfezione per trasfettarle con due microgrammi del plasmide costruito come descritto nel manuale del produttore.
Dopo 72 ore, raccogli il supernatante. Utilizzando un filtro sterile da 0,45 micrometri, filtrare il supporto e mantenere la sospensione virale al buio a quattro gradi Celsius. Successivamente, far crescere le cellule HT29 durante la notte in un piatto da 60 millimetri con DMEM, incubando le cellule a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Quando le cellule raggiungono il 30-50% di confluenza, infettarle con due millilitri di sospensione virale in presenza di otto microgrammi di polibrene per millilitro di sospensione virale. Incubare le cellule infette a 37 gradi Celsius per quattro o sei ore. Quindi, aspirare la sospensione virale.
Aggiungere quattro millilitri di DMEM fresco e restituire il piatto all'incubatore. A 24 ore dopo l'infezione, rimuovere il supporto dai piatti e lavare accuratamente le cellule con due millilitri di PBS pre-riscaldato. Aggiungere un millilitro di tripside EDTA e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti.
Utilizzando un microscopio a 10 volte l'ingrandimento, osservare le cellule per assicurarsi che la maggior parte di esse si sia staccata. Successivamente, aggiungere due millilitri di DMEM contenenti 10%FBS per interrompere la tripinazione e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare a 200 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante.
Sospendere di nuovo il pellet di cella in 10 millilitri di DMEM e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Quindi, diluire le cellule per fattori di 30, 100 e 300. Seme le cellule sono piatti da 150 millimetri che contengono ciascuno 20 millilitri di DMEM contenenti blastidina ad una concentrazione di un microgrammo per millilitro.
Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per circa una o due settimane. Durante questo periodo, utilizzare un microscopio invertito a 10 volte l'ingrandimento per osservare le colonie ogni giorno. Segna le colonie ben isolate sul fondo del piatto quando il diametro delle colonie è di circa uno o due millimetri.
Al termine del periodo di incubazione, aspirare il mezzo e lavare le cellule con tre millilitri di PBS prerifabbturato. Aggiungere due millilitri di EDTA di triptina in un piatto da 60 millimetri. Utilizzare forcep sterili per raccogliere cilindri di clonazione sterili autoclavati e metterli nel piatto.
Quindi, raccogliere i cilindri che ora contengono ciascuno circa 30 microlitri di EDTA di tripina e posizionarli delicatamente sulle colonie contrassegnate. Riportare il piatto nell'incubatrice per tre minuti. Successivamente, controllare le cellule al microscopio per assicurarsi che si siano staccate.
Quando le cellule si sono alzate, a 70 microlitri di mezzo di coltura per ogni cilindro per inattivare la tripina. Utilizzare una pipetta da 200 microliter per mescolare delicatamente le sospensioni cellulari, assicurandosi di non spostare il cilindro durante la miscelazione. Impostare due piastre da 24 pozzetti ed etichettarle con la piastra A e la piastra B.Aggiungere un millilitro di DMEM ad ogni pozzo.
Aggiungere 30 microlitri di sospensione cellulare ad ogni pozzo della piastra A e aggiungere 70 microlitri ai corrispondenti pozzi della piastra B.Posizionare di nuovo le piastre nell'incubatore. Quando le celle nella piastra B sono al 90% di confluenza, rimuovere il supporto e lavare accuratamente le celle con un millilitro di PBS. Rimosso completamente il PBS e aggiungere 50 microlitri del buffer di caricamento 1X SDS-PAGE per la lyse delle celle.
Dopo cinque minuti, trasferire il llysate cellulare dalla piastra da 24 pozzi a tubi di centrifuga da 1,5 millilitri. Far bollire i campioni a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Eseguire i campioni su gel 10%SDS a una tensione costante di 80 volt per 15 minuti e quindi a 120 volt per un'ora.
Quindi trasferire la proteina su una membrana fluoruro di polivinilidene mediante trasferimento a umido ad una corrente costante di 400 milliarti per due ore. Diluire l'anticorpo primario di un fattore di 5.000 nel latte non grasso al 5% che viene sciolto in TBST. Aggiungere l'anticorpo FLAG alla membrana e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.
Utilizzando uno shaker decolorante impostato su 200 RPM, lavare la membrana con TBST per 15 minuti, rinfrescando il TBST ogni cinque minuti. Quindi, diluire un anticorpo secondario anti-topo di un fattore 10.000 nel 5% di latte non grasso. Incubare la membrana con anticorpo secondario diluito a quattro gradi Celsius per cinque o sei ore.
Lavare nuovamente la membrana sullo shaker decolorante come descritto in precedenza. Successivamente, utilizzare la chemiluminescenza avanzata occidentale e un sistema di documentazione gel per immagini la membrana e rilevare l'espressione FLAG. In primo luogo, raccogliere entrambe le celle HT29 e HT29-DR3 mediante tripsicinazione e utilizzare un contatore automatico delle celle per misurare la densità cellulare.
Seminare le cellule nei pozzi di piastre da 12 porri con DMEM a una densità di 30.000 cellule per pozzo e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5%. Il giorno successivo, aggiungere 10 nanomolari di diazonamide a ogni pozzo che contiene cellule che usano l'1%DMSO come controllo negativo e trasferire le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Dopo 48 ore di trattamento, immagini le cellule al microscopio a 10 volte l'ingrandimento.
Successivamente, seminare entrambe le cellule HT29 e HT29-DR3 nei pozzi di piastra da 96 porri con DMEM a una densità di 3.000 cellule per pozzo e consentire loro di crescere a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere concentrazioni di diazonamide che aumentano la dose come delineato nel protocollo di testo. Dopo 48 ore di trattamento, utilizzare un kit di dosaggio di vitalità cellulare a base di luminescenza per misurare la vitalità cellulare.
Rimuovere la piastra da 96 pozzi dall'incubatore e lasciarla riposare a temperatura ambiente per circa 30 minuti. Quindi, aggiungere 50 microlitri di reagenti di dosaggio ad ogni pozzo e agitare la piastra per due minuti a temperatura ambiente per lisciviare le cellule. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi utilizzare un lettore di micropiastrine per determinare la luminescenza di ogni pozzo.
La caratterizzazione delle cellule HT29 che esprimono stabilmente DR3 rivela che i cloni esprimono vari livelli di DR3 mentre le cellule di tipo selvaggio non mostrano espressione genica esogena. I geni uno e cinque sono visti per esprimere i più alti livelli di DR3, e quindi vengono scelti per ulteriori esperimenti. La morfologia delle cellule HT29 e HT29-DR3 si osserva dopo essere stata trattata per 48 ore con diazonamide.
Le cellule HT29-DR3 mostrano un'evidente apoptosi con una membrana cellulare rotta e detriti cellulari. Tuttavia, le cellule HT29 mostrano solo arresto mitotico con cellule intatte che mostrano una forma cellulare arrotondata. La vitalità cellulare di questi tipi di cellule viene quindi determinata dopo essere stata trattata per 48 ore con tre nanomolari di diazonamide.
Si ritiene che le cellule HT29-DR3 abbiano una morte cellulare superiore all'80%, mentre le cellule parentali HT29 dimostrano solo una leggera risposta sotto forma di arresto mitotico. Ciò indica che la sovraespressione di DR3 ricostituì la via apoptotica indotta dalla diazonamide in queste cellule. Le diluizioni seriali corrette sono importanti per ottenere una densità ottimale di singoli cloni.
È anche importante assicurarsi che ogni cilindro clone contenga solo una colonia ed evitare di contaminare le colonie vicine. Le linee cellulari sovraespresse dr3 hanno facilitato lo studio biochimico dei meccanismi molecolari in vitro. Abbiamo generato xenoinnesti HT29-DR3 attraverso l'iniezione sottocutanea di cellule HT29-DR3 e ha contribuito a elaborare i meccanismi dell'apoptosi indotta da agenti antimitotici in vivo.
Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i geni di interesse in altre linee cellulari. Inoltre, il knockout genico è un altro modo per lo studio funzionale, e il nostro protocollo può essere adattato ai sistemi di abbattimento genico. Pertanto, è generalmente applicabile alle funzioni geniche ucidate.
Ricordarsi di far cadere il relè del virus nella spazzatura in contenitori specifici per lo smaltimento della sicurezza.
