細胞内の遺伝子を過剰発現させることは、遺伝子機能を研究する重要な方法です。レトロウイルスによる安定したトランスフェクションにより、内因性遺伝子を宿主ゲノムに統合し、連続的に発現させることができます。我々は、レトロウイルス感染の単一のコロニーを拾い上げ、FLAGタグ付きDR3を過剰に発現する安定した細胞株を生成した。
細胞株は、良好なDR3抗体の利用不能を補償し、インビトロおよびインビボでDR3機能研究ポストのための優れたツールを提供した。我々は、レトロウイルス感染の単一コロニーを拾うことによってDR3過剰発現細胞株を生成した。単一コロニーからの細胞株は均質性および純度を維持することができた。
さらに、プロトコルは扱いやすく、扱いやすく、簡単です。この手順を開始するには、DMEMの4ミリリットルで60ミリメートルの皿で一晩plat-A細胞を成長させます。細胞が80〜90%の合流に達したら、トランスフェクション試薬を使用して、製造マニュアルに記載されている2マイクログラムの構築されたプラスミドでそれらをトランスフェクトします。
72時間後、上清を集める。0.45マイクロメートルの無菌フィルターを使用して、培地をフィルタリングし、ウイルス懸濁液を摂氏4度で暗闇の中に保ちます。次に、HT29細胞をDMEMで60ミリメートル皿で一晩成長させ、5%の二酸化炭素で摂氏37度で細胞をインキュベートする。
細胞が30〜50%合流に達すると、ウイルス懸濁液のミリリットル当たり8マイクログラムのポリブレンの存在下で2ミリリットルのウイルス懸濁液に感染する。感染した細胞を摂氏37度で4~6時間インキュベートする。次いで、ウイルス懸濁液を吸引する。
新鮮なDMEMを4ミリリットル加え、皿をインキュベーターに戻します。感染後24時間で、食器から培地を取り除き、慎重に予温PBSの2ミリリットルで細胞を洗います。トリプシンEDTAを1ミリリットル加え、37°Cで3分間培養します。
顕微鏡を10倍の倍率で観察し、細胞の大部分が剥離していることを確認します。この後、10%FBSを含むDMEMを2ミリリットル加えてトリプシン化を停止し、15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を回収します。室温で5分間200回gで遠心分離機を、上清を取り除きます。
セルペレットを10ミリリットルのDMEMで再中断し、ピペットを上下に軽くして混ぜます。次に、30、100、および300の係数で細胞を希釈する。細胞の種子は、それぞれ1ミリリットル当たり1マイクログラムの濃度でブラストシジンを含むDMEMの20ミリリットルを含む150ミリメートルの皿です。
摂氏37度で5%の二酸化炭素を約1~2週間インキュベートします。この期間中、10倍の倍率で反転した顕微鏡を使用して、毎日コロニーを観察します。コロニーの直径がおよそ1〜2ミリメートルである場合、皿の底によく隔離されたコロニーをマークします。
インキュベーション期間が終了したら、培地を吸引し、3ミリリットルの予熱PBSで細胞を洗浄する。60ミリメートル皿にトリプシンEDTAを2ミリリットル加えます。無菌鉗子を使用して、オートクレーブされた滅菌クローニングシリンダーをピックアップし、皿に入れます。
次に、各シリンダに約30マイクロリットルのトリプシンEDTAが含まれるシリンダーをピックアップし、マークされたコロニーの上にそっと置きます。皿をインキュベーターに3分間戻します。この後、顕微鏡下の細胞を調べて、細胞が切り離されていることを確認します。
細胞が持ち上がったとき、各シリンダーに培養培地の70マイクロリットルでトリプシンを不活性化する。200マイクロリットルのピペットを使用してセルサスペンションを穏やかに混合し、混合しながらシリンダーを動かさないようにします。2つの24ウェルプレートをセットし、プレートAとプレートBにラベルを付け、各ウェルにDMEMの1ミリリットルを追加します。
30マイクロリットルのセル懸濁液をプレートAの各ウェルに加え、対応するプレートBのウェルに70マイクロリットルを加え、プレートをインキュベーターに戻します。プレートBの細胞が90%合流したら、培地を取り出し、PBSの1ミリリットルで慎重に細胞を洗います。PBSを完全に取り除き、細胞を溶す1X SDS-PAGEローディングバッファの50マイクロリットルを加えた。
5分後、24ウェルプレートから1.5ミリリットルの遠心分離チューブに細胞ライセートを移します。100°Cで10分間沸騰させます。10%SDSゲルで、80ボルトの定電圧で15分間、1時間120ボルトでサンプルを実行します。
次に、400ミリアンペアの一定電流で2時間の一定電流での湿移により、フッ化ビニリデン膜にタンパク質を移す。TBSTに溶解した5%ノンファットミルクで5,000の倍で一次抗体を希釈します。FLAG抗体を膜に加え、一晩摂氏4度でインキュベートする。
200 RPMに設定した脱色シェーカーを使用して、膜をTBSTで15分間洗浄し、5分ごとにTBSTをリフレッシュします。次いで、抗マウス二次抗体を5%ノンファットミルク中に10,000倍に希釈する。膜を4°Cで5~6時間インキュベートします。
先に述べたように脱色シェーカー上の膜を再度洗浄する。この後、西洋の強化された化学発光とゲルドキュメンテーションシステムを使用して、膜を画像化し、FLAG発現を検出します。まず、トリプシン法によりHT29細胞とHT29-DR3細胞の両方を採取し、セル密度を測定するために自動セルカウンタを使用します。
12ウェルプレートのウェルに播種し、DMEMで1ウェルあたり30,000細胞の密度で、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、1%DMSOを陰性対照として使用する細胞を含む各ウェルにジアゾナミドのナノモル10ナノモルを加え、5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーターにプレートを移す。48時間の治療後、顕微鏡で細胞を10倍の倍率で画像化します。
次に、HT29とHT29-DR3の両方の細胞を、1ウェルあたり3,000細胞の密度でDMEMを備えた96ウェルプレートのウェルに播種し、一晩で摂氏37度で成長させます。翌日、テキストプロトコルで概説されているように、用量エスカレートジアゾンアミド濃度を追加します。48時間の治療の後、発光ベースの細胞生存アッセイキットを使用して、細胞の生存率を測定する。
インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、室温で約30分間放置します。次に、各ウェルに50マイクロリットルのアッセイ試薬を加え、プレートを室温で2分間振って細胞をライゼします。プレートを室温で10分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーを使用して各ウェルの発光を決定します。
DR3を安定的に発現するHT29細胞の特性評価は、クローンがDR3の様々なレベルを発現し、野生型細胞が外因性遺伝子発現を示さないことを明らかにする。遺伝子1と5は、DR3の最高レベルを発現するように見られ、さらなる実験のために選択されます。HT29およびHT29-DR3細胞の形態は、ジアゾンアミドで48時間治療された後に観察される。
HT29-DR3細胞は、細胞膜の破損および細胞の破片を伴う明らかなアポトーシスを示す。しかし、HT29細胞は、丸め細胞形状を示す無傷の細胞を有する有糸分裂逮捕のみを示す。これらの細胞タイプの細胞生存率は、ジアゾンアミドの3ナノモルで48時間治療された後に決定される。
HT29-DR3細胞は80%以上の細胞死を有すると見られるが、親HT29細胞は有糸分裂性逮捕の形でわずかな応答のみを示す。これは、DR3の過剰発現がこれらの細胞におけるジアゾンアミド誘導アポトーシス経路を再構成したことを示している。適切なシリアル希釈は、単一クローンの最適な密度を得るために重要です。
また、すべてのクローンシリンダにコロニーが1つだけ含まれていることを確認し、近くのコロニーを汚染しないようにすることも重要です。DR3は細胞株を過剰発現させることで、インビトロでの分子機構の生化学的研究を促進した。HT29-DR3細胞の皮下注射により異種移植片HT29-DR3を生成し、抗ミトーシス剤によるインビボでのアポトーシスのメカニズムを詳しく説明しました。
このプロトコルは、他の細胞株で関心のある遺伝子を研究するために使用することができます。さらに、遺伝子ノックアウトは機能研究のもう一つの方法であり、私たちのプロトコルは遺伝子ノックダウンシステムに適応することができます。したがって、遺伝子機能の解明に一般的に適用可能である。
安全処分のために、ゴミにウイルスリレーをゴミに落とすことを忘れないでください。
