Техническая демонстрация полного генома массива Сравнительный геномной гибридизации

Это видео является техническая демонстрация гибридизации протокол для целого генома плитки путь массив CGH, который сканирует весь геном человека, используя только 25-100 нг ДНК, которые могут быть выделены из различных источников, в том числе архивных фиксированных формалином материал.

Массив сравнительной геномной гибридизации (CGH массив) является методом для выявления выгод и потерь от сегменты ДНК или дозы генов в геноме ^1. Последние достижения в этой технологии позволили высокое разрешение сравнения целых геномов для идентификации генетических изменений у онкологических и других генетических заболеваний ^2. Суб-Megabase Резолюция Черепица набора массива (или SMRT) массив состоит из набора около 30 тысяч перекрытия бактериальные искусственные хромосомы (BAC) клонов, которые охватывают генома человека в ~ 100 пар kilobase (кб) сегментов ^2. Эти BAC цели индивидуально синтезированы и с пятнами в двух экземплярах, на одном предметном стекле ^2-4. Массив CGH основан на принципе конкурентного гибридизации. Выборка и ссылки ДНК дифференциально помечены цианиновых-3 и цианиновых-5 флуоресцентные красители, и со-гибридизации с массивом. После инкубационного периода, несвязанные образцы отмывали от слайдов и массив образ. В свободном доступе пользовательский пакет программного обеспечения под названием SeeGH (www.flintbox.ca) используется для обработки больших объемов данных, собранных - одного эксперимента генерирует 53 892 точек данных. SeeGH визуализирует интенсивности сигнала log2 соотношение между 2 пробы в каждой целевой концентрации алкоголя в крови которого вертикально с хромосомными позиции ^5,6. Массив SMRT может обнаружить изменения как малые, как 50 КБ ^7. Массив SMRT может обнаружить различные ДНК перестановки событий, включая ДНК, прибыли, убытки, усилений и гомозиготных делеций. Уникальное преимущество массива SMRT является то, что можно использовать ДНК, выделенной из фиксированных формалином и залитые парафином образцов. В сочетании с низкими требованиями к входу неусиленных ДНК (25-100ng) это позволяет профилирования драгоценных образцов, таких как, производимые микродиссекции ^7,8. Это объясняется большой размер каждой целевой BAC гибридизации, который позволяет связывание меченых образцов достаточное для получения сигналов для обнаружения. Еще одним преимуществом этой платформы является толерантность тканей неоднородности, уменьшая необходимость в утомительной микродиссекции ткани ^8. Это видео протокол шаг за шагом учебник от маркировки входных ДНК до получения сигнала для целого ряда плитки генома SMRT пути.

PROBE МАРКИРОВКА

Примечание: воздействия в Cye Красители на свет в любое время (это может быть достигнуто за счет работы в затемненной области или экранирование труб с крышкой, таких как алюминиевая фольга)

1. Комбинат:
   (Setup 1 реакционную трубку для сведения и в 1 реакционную трубку для образца)
   • ДНК (25-400 нг)
   • 5 мкл 5X буфера случайных праймеров (Конечная концентрация: 5X Promega Кленова буфера и 7 мкг / мкл случайных octamers)
   • Развести до 17,0 мкл общего объема дистиллированной H ₂ O
2. Варить в течение 10 минут при температуре 100 ° C. Передача сразу на лед в течение 1 минуты.
3. Добавьте 4 мкл 10X смесь дНТФ (2 мм дАТФ, дГТФ, dTTP, 1.2мм дЦТФ).
4. Добавить CyeDyes:
   • Добавьте 2 мкл (2 нмоль) Су-3 помечены дЦТФ к образцу ДНК
   • Добавьте 2 мкл (2 нмоль) Су-5 помечены дЦТФ Ссылка ДНК (например, Novagen геномной ДНК человека)
5. Добавить 2,5 мкл Кленова (9 ед / мкл, Promega) и перемешать.
6. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи * (~ 18 часов).
   
   * Ночь времени гибридизации можно регулировать в пределах от 14 до 24 часов без ущерба для процесса маркировки в соответствии с графиком лаборатории.

ОБРАЗЕЦ ОЧИСТКА

(Комбинированный датчик очистке и подготовке к гибридизации)

1. Использование микроконтроллер YM-30 колонке:
   • Добавить 100 мкл Кот-1 ДНК (1μg/μL) на колонке. Не прикасайтесь к мембране с пипетки.
   • Бассейн реакции (справочно-образец) и добавить к колонке.
   • Место столбца в условии, трубки и спина при 13000 г в течение 10 минут.
   • Добавить 200 мкл дистиллированной H ₂ 0 к мембране и повторить спина мыть.
   • Отменить трубки и добавить 45 мкл раствора гибридизации: (Roche DIG Easy)
   Дополнительно: добавить 5 мкл стриженой ДНК спермы сельди (10μg/μL блок, Promega)
   
   • Обратить микроконтроллер, место в новой помечены трубки, и спина в 3000 г в течение 3 минут.

РАСЧЕТ инкорпорации

1. Удалить 1,5 мкл и измерить флуорофора включения использованием NanoDrop спектрофотометр. Использование гибридизации буфер пуст (DIG Easy) следуйте указаниям на экране. (Вы можете восстановить образца с пьедестала, при необходимости, после измерения.)
   
   (Примечание:. Инкорпорации ниже 3,0 пмоль / мкл в любом канале показали разные результаты)
   
   
2. Денатурации при 85 ° С в течение 10 минут.
3. Место зонд при 45 ° С в течение 30 минут до 1 часа (позволяет Кот-1 ДНК отжига.)

ARRAY ГИБРИДИЗАЦИЯ

1. Место 44 мкл решение зонд на покровное (22 мм х 60 мм) (Fisher Scientific). Если возможно, поместите покровное на слайде теплее или тепла блока предварительно нагревают до 45 ° С для поддержания температуры.
2. Совместите скользить по покровное и зонда решение, нижний край слайда позволяет связаться с гибридизации решение. Продолжайте ниже, пока покровное прилагается к слайду с поверхностным натяжением. Обратить слайда.
3. Место скользить в гибридизации кассета (Telechem), предварительно нагревают до 45 ° С, и добавить 10 мкл воды в нижний паз (для контроля влажности при гибридизации).
4. Кассета Печать и инкубировать в течение 36 - 40 часов при 45 ° C.

ARRAY СТИРАЛЬНЫЕ

Примечание: Все мыть решения при рН 7,0

Удаление слайда из гибридизации кассета имеет решающее значение. DIG Легкая быстро кристаллизуется при комнатной температуре. Слайд должен быть немедленно окунуться и покровное стекло снимается в промывочного раствора.

1. Добавьте примерно 60 мл 0.1XSSC, 0,1% SDS (7,0 рН, 45 ° C) промывочного раствора в банке Коплин до открытия гибридизации камеры.
2. Открытая камера, добавить слайд мыть раствором и удалить покровное (она должна соскальзывать).
3. Вымойте слайд 3 раза в 0.1XSSC + 0,1% SDS при 45 ° С в течение 1 минуты каждый с волнением.
4. Промыть слайд 3 раза в пресной 0.1XSSC *. Там должно быть никаких остаточных пузырьков от мытья SDS видно.
   
   * Слайды может оставаться в финале промывочного раствора до готовности к центрифуге и сканирования (~ 15 минут).
   
   
5. Центрифуга слайда в 50 мл труб Сокол на 700 г в течение 3 минут.
6. Сразу сканировать слайды (сигнал интенсивности будет уменьшаться с течением времени.)

Низкое качество ДНК не будет обеспечивать хороший профиль гибридизации. Важно, чтобы образцов и эталонов ДНК свободными от загрязняющих веществ, таких как фенол, РНК, соль и т.д., которые могут помешать случайные премьер шаг маркировки до начала гибридизации эксперимента. Например ресуспендирования ДНК в Трис - ЭДТА (TE) вместо воды не рекомендуется, поскольку высокая концентрация соли может ингибировать маркировки реакции. Мы рекомендуем опробование ДНК качества с использованием Nanodrop спектрофотометр для измерения как ДНК количество, а также общая форма кривой поглощения и 260/280, 260/230 отношение.

Стиральные: Удаление слайда из гибридизации кассеты и передаче подогревом промывочного раствора является важным шагом в процессе гибридизации, как DIG простое решение гибридизации кристаллизуется очень быстро. Важно, чтобы вымыть решения быть нейтральным рН и температуры промывочного раствора важна для строгость, удаляя несвязанного зонда. После высыхания слайды важно, чтобы держать их в темноте, если не выполняется сразу же, или после сканирования, если вы хотите провести повторную проверку их на более позднее время.

Озон: озон была обеспокоенность во всем мире при выполнении массив CGH. Озон уровней выше 5ppm Было показано, что отрицательно влияет на Cye красителей. Cye 5 Особенно чувствительны к озону, деградации. Минимизация воздействия озона является ключом к предотвращению Cye красителя деградации и потери сигнала до и во время сканирования. Сканирование в ночное время, например, когда экологические озона, как правило, ниже, является одним из возможных вариантов. Озон свободных корпусов для автоматизированного слайд мойки и сканирования и лечения различных химических слайд имеются в продаже. Озон устойчивыми красителями Cye также недавно был разработан.

Мы хотели бы поблагодарить членов Ван Лам Лаборатории BAC массива команда особенно Мива Suzuki и Брайан Чи для подготовки этой статьи. Работа выполнена при поддержке за счет средств канадского института исследований в области здравоохранения, Геном Канада / Геном Британской Колумбии, и NIH / NIDCR грант RO1 DE15965-01.