全基因组阵列比较基因组杂交技术示范

这个视频是一个全基因组平铺路径阵列比较基因组杂交，扫描整个人类基因组只用25-100纳克的DNA，可以从多种来源，包括档案福尔马林固定材料隔离​​技术示范的杂交协议。

阵列比较基因组杂交（阵列CGH）技术是一种检测DNA片段或基因的基因组中的¹剂量的收益和损失的方法。这项技术的最新进展，使高分辨率的整个基因组的遗传变异在癌症和其他遗传性^疾病 2鉴定比较。小组Megabase分辨率平铺设置阵列（SMRT）阵列是由一组细菌人工染色体（BAC），跨越^2〜100个碱基对的人类基因组（KB）段的克隆约三万重叠。这些BAC的目标是独立的合成和发现重复单一^载玻片 2-4 。阵列比较基因组杂交的基础上有竞争力的杂交的原则。样品和参照DNA差异与菁- 3标记和荧光染料菁- 5，和合作的阵列杂交。潜伏期后，未​​结合的样品从幻灯片冲洗成像阵列。 SeeGH（www.flintbox.ca）免费提供的自定义软件包是用来处理大量的数据收集 - 一个单一的实验产生53892个数据点。 SeeGH可视化之间在每个BAC目标的2样品与^5,6染色体的位置，这是垂直对齐的log2信号强度的比值。 SMRT的阵列，可以检测高达50 KB的^大小 7小的改动。 SMRT的阵列，可以检测多种，包括DNA的收益，损失，扩增和纯合性缺失的DNA重组事件。 SMRT的阵列的一个独特优势是，可以使用从福尔马林固定石蜡包埋样品中分离DNA。当与非放大的DNA（25 - 100ng）的低投入的要求相^结合 ，这使得如7,8显微切割生产的珍贵样品的分析。这要归功于大尺寸每个BAC杂交的目标，让约束力，以生产足够的标记的样品进行检测的信号。这个平台的另一个优势是组织异质性的耐受性，减少繁琐^的组织显微切割8的需要。此视频的协议是一个标签输入DNA，通过对整个基因组的瓦片路径SMRT的阵列信号收购一步一步的教程。

探针标记

注:限制接触CYE染料在任何时候都光（这可以通过在黑暗的领域工作，或屏蔽如铝箔盖管）

1. 结合:
   （安装1个反应管样品，以供参考和1个反应管）
   • DNA（25-400纳克）
   • 5μL5X缓冲随机引物（终浓度:5X Promega公司的Klenow缓冲和7微克/μL，随机八聚体）
   • 稀释到17.0μL，用蒸馏水H _{2 O}的总体积
2. 煮沸10分钟，在100 ° C。立即转移到1分钟的冰。
3. 加入4μL10X dNTP混合液（2MM的dATP，dGTP，dTTP的，1.2mm的dCTP）。
4. 新增CyeDyes:
   • CY - 3标记的dCTP 2μL（2 nmoles）样品DNA
   • CY - 5标记的dCTP 2μL（2 nmoles）参考DNA（例如，Novagen公司人类基因组DNA）
5. 添加2.5μL的Klenow（9 U /μL，Promega公司）和混合。
6. 在37 ° C孵育过夜*（〜18小时）。
   
   *杂交过夜时间可以调整14至24小时之间，无不良影响贴标过程，以适应实验室时间表。

样本数据库

（探头的清理和准备杂交组合）

1. 使用一个单片机YM - 30柱:
   • 添加100μLCOT - 1 DNA（1μg/μL）列。请勿触摸膜与枪头。
   • 游泳池的反应（参考样本），并添加到列。
   • 将列在提供管和旋转10分钟，在13000克。
   • 加入200微升蒸馏水₂ 0膜和重复旋转洗。
   • 丢弃管，添加45μL杂交液:（罗氏辛易）
   可选:添加5μL剪切鲱鱼精子DNA（10μg/μL单位，Promega公司）
   
   • 反转单片机，在一个新的标记管的地方，并在3000克3分钟旋转。

的法团的计算

1. 卸下1.5μL和使用NanoDrop分光光度计测量荧光法团。使用您的杂交缓冲液作为空白（辛轻松）按照屏幕上的指示。 （您可以从底座中恢复过来的样品，测量后，如果必要的。）
   
   （ 注:低于3.0 pmol /μL在任一通道的法团有不同的结果。 ）
   
   
2. 变性在85 ° C 10分钟。
3. 将探头放置在45 ° C 30分钟至1小时（允许COT - 1 DNA退火。）

阵列杂交

1. 广场44μL到盖玻片探头解决方案（22毫米× 60毫米）（尔科技）。如果可以，盖玻片放在幻灯片温暖或热块预热至45 ° C，保持温度。
2. 对齐滑动盖玻片和探头解决方案，低的一个幻灯片的边缘，使杂交液接触。继续降低，直到盖玻片表面张力的幻灯片。反向滑动。
3. 放置到杂交带（Telechem）的幻灯片，预热至45 ° C，并添加10μL的水，在低槽（控制杂交过程中的湿度）。
4. 密封的纸盒和孵育36 - 40小时在45 ° C。

阵列洗涤

注:所有的清洗解决方案，在pH 7.0

从杂交盒去除幻灯片是至关重要的。辛轻松快速晶体在室温下。幻灯片，应立即浸入和盖玻片，在洗涤液中删除。

1. 加入约60毫升0.1XSSC，0.1％SDS（pH值7.0，45℃）洗一个Coplin JAR的解决方案之前，开放的杂交室。
2. 开放室，添加幻灯片洗涤液，取出盖玻片（应滑出）。
3. 洗净幻灯片0.1XSSC 3倍+ 0.1％SDS在45℃，各1分钟与躁动。
4. 冲洗幻灯片新鲜0.1XSSC的3倍*。应无残留的气泡从SDS洗可见。
   
   *幻灯片可以保持在最后的洗涤液，直到准备离心机和扫描（〜15分钟）。
   
   
5. 离心3分钟，在700克50毫升猎鹰管的幻灯片。
6. 立即扫描幻灯片（信号强度会随着时间的推移减弱。）

质量差的DNA，将不会提供一个良好的杂交个人资料。它是必不可少的，以确保样品和参照DNA污染物，如苯酚，RNA，盐等可能与干预的随机总理标签步骤之前开始杂交实验。例如再悬浮的DNA在Tris - EDTA代替水（TE）是不建议高盐浓度能抑制标记反应。我们建议使用Nanodrop分光光度计测量DNA的数量以及吸光度曲线的整体形状和260/280，二百三十分之二百六十零比例化验DNA的质量。

洗衣机:从杂交盒中删除的幻灯片，并转移到加热洗涤液是在杂交过程中关键的一步，掏轻松杂交液的结晶速度非常快。重要的是清洗解决方案，在中性PH值和洗涤液的温度是重要的紧缩的，同时去除未结合的探针。干燥后的幻灯片，它是重要的，以保持他们在黑暗中，如果不马上扫描，扫描后，如果你想在稍后的时间重新扫描。

臭氧:臭氧已成为全世界关注的执行阵列比较基因组杂交时。 5PPM以上的臭氧水平已经表明，产生不利影响CYE染料。 CYE 5是特别敏感，臭氧降解。防止CYE染料退化和扫描之前和期间的信号损失，最大限度地减少臭氧接触是关键。扫描晚上例如，当环境臭氧是通常较低，是一个可行的选择。市售的冲洗和扫描的自动幻灯片和各种化学幻灯片治疗无臭氧罩。耐臭氧CYE染料最近也得到了发展。

我们要感谢为编写本文运临实验室的BAC阵列队，特别是三轮铃木和布赖恩志的成员。这项工作是支持由来自加拿大研究所的资金卫生研究院，加拿大基因组/基因组不列颠哥伦比亚省和美国国立卫生研究院/ NIDCR授予RO1 DE15965 - 01。