Dimostrazione tecnica di ibridazione Whole Genome Array Comparative Genomic

Questo video è una dimostrazione tecnico del protocollo di ibridazione per intero genoma piastrelle CGH array di percorso, che analizza l'intero genoma umano utilizzando solo 25-100 ng di DNA che può essere isolato da una varietà di fonti, tra cui materiale d'archivio formalina fisso.

Ibridazione genomica comparativa Array (array CGH) è un metodo per rilevare gli utili e le perdite di segmenti di DNA o di dosaggio del gene nel genoma ^1. I recenti progressi nella tecnologia hanno permesso questo confronto ad alta risoluzione di interi genomi per l'identificazione di alterazioni genetiche nel cancro e altre malattie genetiche ^2. Il Sub-Megabase risoluzione Tiling-set array (o SMRT) array è costituito da un insieme di circa 30.000 sovrapposizione cromosoma batterico artificiale (BAC) cloni che coprono il genoma umano in ~ 100 coppie kilobase (kb) segmenti ^2. Questi obiettivi BAC sono individualmente sintetizzato e individuato in duplice copia su un vetrino solo ^2-4. CGH Array si basa sul principio della ibridazione competitiva. Campione di DNA e di riferimento sono etichettati in modo differenziale con Cyanine-3 e coloranti fluorescenti Cyanine-5, e co-ibridato alla matrice. Dopo un periodo di incubazione i campioni non legato sono lavati dalla diapositiva e l'array è ripreso. Un pacchetto disponibile gratuitamente il software personalizzato chiamato SeeGH (www.flintbox.ca) è usato per trattare i grandi volumi di dati raccolti - un singolo esperimento genera 53.892 punti dati. SeeGH visualizza il rapporto segnale log2 intensità tra i 2 campioni a ciascun target BAC che è allineata verticalmente con posizione cromosomica ^5,6. L'array SMRT in grado di rilevare alterazioni più piccolo di 50 kb di dimensione ^7. L'array SMRT in grado di rilevare una serie di eventi riarrangiamenti del DNA compresi gli utili del DNA, le perdite, amplificazioni e delezioni omozigoti. Un vantaggio unico del vettore SMRT è che si può utilizzare il DNA isolato da campioni di paraffina fissati in formalina embedded. Se combinato con i requisiti di ingresso bassa di DNA non amplificato (25-100 ng) questo permette il profiling di campioni preziosi come quelli prodotti da microdissezione ^7,8. Questo è attribuito al grande formato di ciascun target ibridazione BAC, che permette il legame di sufficiente campioni etichettati in modo da produrre i segnali per il rilevamento. Un altro vantaggio di questa piattaforma è la tolleranza di eterogeneità del tessuto, riducendo la necessità di microdissezione del tessuto noioso ^8. Questo protocollo video è uno step-by-step tutorial dall'etichettatura il DNA di ingresso fino alla acquisizione del segnale per l'intera gamma piastrelle SMRT genoma percorso.

SONDA ETICHETTATURA

Nota: limite di esposizione di coloranti Cye alla luce in ogni momento (questo può essere realizzato lavorando in una zona buia o schermatura dei tubi con una copertura, come un foglio di alluminio)

1. Combina:
   (Setup 1 tubo di reazione di rinvio e 1 tubo di reazione per il campione)
   • DNA (25-400 ng)
   • 5 ml di tampone 5X random primer (concentrazione finale: 5X Promega Klenow tampone e 7 mg / mL octamers casuale)
   • Diluire a 17,0 microlitri di volume totale con acqua distillata H ₂ O
2. Far bollire per 10 minuti a 100 ° C. Trasferire immediatamente in ghiaccio per 1 minuto.
3. Aggiungere 4 ml di 10X mix di dNTP (2mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP 1,2 mm).
4. Aggiungi CyeDyes:
   • Aggiungere 2 microlitri (2 nmoli) di Cy-3 dCTP etichettati al DNA del campione
   • Aggiungere 2 microlitri (2 nmoli) di Cy-5 etichettati dCTP di DNA di riferimento (ad esempio, il DNA genomico Novagen umano)
5. Aggiungere 2,5 ml di Klenow (9 U / mL, Promega) e mescolare.
6. Incubare a 37 ° C per una notte * (~ 18 ore).
   
   * Il tempo di ibridazione durante la notte può essere regolata tra 14 a 24 ore senza danneggiare il processo di etichettatura per adattarsi a una pianificazione di laboratorio.

Purificazione del campione

(Combinato sonda pulizia e preparazione per l'ibridazione)

1. Utilizzando un microcontrollore YM-30 colonna:
   • Aggiungere 100 ul Cot-1 DNA (1μg/μL) alla colonna. Non toccare membrana con puntale.
   • Piscina le reazioni (e del campione) e aggiungere alla colonna.
   • Colonna posto in tubo forniti e girare a 13000 g per 10 minuti.
   • Aggiungere 200 ul H ₂ 0 distillata a membrana e ripetere di selezione per lavarsi.
   • Gettare tubo e aggiungere 45 ul di soluzione di ibridazione: (Roche DIG Easy)
   Facoltativo: aggiungere 5μL tranciati DNA degli spermatozoi di aringhe (unità 10μg/μL, Promega)
   
   • Inverti microcontrollore, posto in un tubo di nuova etichetta, e far girare a 3000 g per 3 minuti.

CALCOLO delle incorporazioni

1. Rimuovere 1,5 microlitri e fluoroforo incorporazione misura con spettrofotometro NanoDrop. Utilizzo del buffer di ibridazione come uno spazio (DIG Easy) seguire le indicazioni sullo schermo. (È possibile recuperare il campione dal piedistallo, se necessario, dopo la misura.)
   
   (Nota:. Incorporazioni di sotto di 3,0 pmol / mL in uno dei due canali hanno mostrato risultati variabili)
   
   
2. Denaturare a 85 ° C per 10 minuti.
3. Sonda posto a 45 ° C per 30 minuti a 1 ora (consente Cot-1 DNA ricottura.)

ARRAY IBRIDAZIONE

1. Posto 44 microlitri soluzione sonda sul coprioggetto (22 mm x 60 mm) (Fisher Scientific). Se disponibile, posizionare il coprioggetti su un vetrino più caldo o in blocco termico pre-riscaldato a 45 ° C per mantenere la temperatura.
2. Allineare scorrere sul coprioggetto e la soluzione della sonda, un bordo inferiore della slitta che permette il contatto con la soluzione di ibridazione. Continuare ad abbassare fino a quando il vetrino è attaccato alla diapositiva con tensione superficiale. Inverti diapositive.
3. Mettere il vetrino in cassetta ibridazione (Telechem), pre-riscaldato a 45 ° C e aggiungere 10 ml di acqua nella scanalatura inferiore (per il controllo dell'umidità durante l'ibridazione).
4. Seal cassetta e incubare per 36 - 40 ore a 45 ° C.

ARRAY LAVAGGIO

Nota: Tutte le soluzioni di lavaggio sono a pH 7,0

La rimozione del vetrino dalla cassetta ibridazione è critica. DIG Facile cristallizza rapidamente a temperatura ambiente. La slitta deve essere immediatamente immersi e la polizza di copertura rimossa nella soluzione di lavaggio.

1. Aggiungere circa 60 ml di 0.1XSSC, 0,1% SDS (pH 7,0, 45 ° C) Lavare la soluzione di una vaschetta Coplin prima di aprire la camera di ibridazione.
2. Camera aperta, aggiungere diapositiva alla soluzione di lavaggio e rimuovere coprioggetto (dovrebbe scivolare via).
3. Lavare il vetrino 3 volte in 0.1XSSC + 0,1% SDS a 45 ° C per 1 minuto ciascuna con agitazione.
4. Sciacquare il vetrino 3 volte in 0.1XSSC fresca *. Non ci dovrebbero essere bolle residui del lavaggio SDS visibile.
   
   * Le slide possono rimanere nella soluzione di lavaggio finale, fino al momento di centrifuga e di scansione (~ 15 minuti).
   
   
5. Centrifugare il vetrino in un mL 50 tubi Falcon a 700 g per 3 minuti.
6. Immediatamente scansione le diapositive (intensità del segnale diminuisce nel tempo.)

DNA di scarsa qualità non fornirà un buon profilo di ibridazione. E 'essenziale assicurare che il DNA del campione e di riferimento sono esenti da contaminanti come il fenolo, RNA, sale, ecc che possono interferire con il passaggio casuale di etichettatura principale prima di iniziare un esperimento di ibridazione. Per esempio la risospensione del DNA in Tris - EDTA (TE) al posto dell'acqua non è raccomandato in quanto la concentrazione di sali in grado di inibire la reazione di marcatura. Si consiglia di saggiare la qualità del DNA con lo spettrofotometro NanoDrop di misurare sia la quantità di DNA così come la forma generale della curva di assorbimento e la 260/280, 260/230 rapporto.

Lavaggio: Rimozione la diapositiva dal cassetto ibridazione e il trasferimento alla soluzione di lavaggio riscaldata è un passo fondamentale nel processo di ibridazione, come la facile soluzione di ibridazione DIG cristallizza molto rapidamente. E 'importante che le soluzioni di lavaggio essere a pH neutro e la temperatura della soluzione di lavaggio è importante per rigore, mentre la rimozione della sonda non legata. Dopo l'essiccazione diapositive è importante tenerli al buio, se non la scansione subito, o dopo la scansione se si desidera verificare nuovamente loro in un secondo momento.

Ozono: l'ozono è stata una preoccupazione in tutto il mondo durante l'esecuzione di CGH array. I livelli di ozono sopra 5ppm hanno dimostrato di influenzare negativamente le tinture Cye. Cye 5 è particolarmente sensibile alla degradazione dell'ozono. Minimizzando l'esposizione di ozono è fondamentale per evitare il degrado Cye tintura e la perdita di segnale prima e durante la scansione. Scansione per esempio di notte, quando l'ozono ambientale è tipicamente inferiore, è una opzione possibile. Custodie di ozono gratuito per scorrimento automatico di lavaggio e la scansione e vari trattamenti chimici scivolo sono disponibili in commercio. Coloranti Cye ozono resistenti sono stati recentemente sviluppati.

Desideriamo ringraziare i membri della Lam Array Wan Lab squadra BAC soprattutto Miwa Suzuki e Bryan Chi per la preparazione di questo articolo. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dal Canadian Institutes for Health Research, Genome Canada / Genome British Columbia, e NIH / NIDCR concedere RO1 DE15965-01.