Demonstração de técnicas Whole Genome hibridização genômica comparativa de matriz

Este vídeo é uma demonstração técnica do protocolo de hibridização para todo o genoma azulejos caminho disposição CGH, que escaneia todo o genoma humano usando apenas 25-100 ng de DNA que podem ser isoladas a partir de uma variedade de fontes, incluindo o material de arquivo formol fixa.

Matriz hibridização genômica comparativa (array CGH) é um método para a detecção de ganhos e perdas de segmentos de DNA ou dosagem do gene no genoma ^1. Os recentes avanços nesta tecnologia permitiram a comparação de alta resolução de genomas inteiros para a identificação de alterações genéticas no cancro e outras doenças genéticas ^2. O Sub-Megabase Resolução série Tiling set-(ou SMRT) matriz é composta por um conjunto de cerca de 30 mil sobreposição cromossomo artificial bacteriano (BAC) clones que abrangem o genoma humano em ~ par kilobase 100 (kb) segmentos ^2. Essas metas são BAC individualmente sintetizados e manchado em duplicado por uma lâmina de vidro única ^2-4. Matriz CGH é baseado no princípio de hibridização competitiva. Amostra de DNA e de referência são diferencialmente marcada com Cyanine-3 e corantes fluorescentes Cyanine-5, e co-hibridizados para a matriz. Após um período de incubação, as amostras não ligadas são lavadas a partir do slide ea matriz é impressa. Um pacote de software disponível gratuitamente personalizado chamado SeeGH (www.flintbox.ca) é usado para processar o grande volume de dados coletados - um único experimento gera 53.892 pontos de dados. SeeGH visualiza o log2 relação intensidade de sinal entre as duas amostras em cada alvo BAC, que está verticalmente alinhado com a posição cromossômica ^5,6. A matriz SMRT pode detectar alterações tão pequenas quanto 50 kb de tamanho ^7. A matriz SMRT pode detectar uma variedade de eventos de rearranjo do DNA DNA incluindo os ganhos, perdas, amplificações e deleções homozigótica. A única vantagem da matriz SMRT é que se pode usar DNA isolado de amostras de parafina fixado em formalina incorporado. Quando combinado com os requisitos de entrada baixa de DNA sem amplificação (25-100ng), que permite perfis de amostras preciosos como os produzidos por microdissecção ^7,8. Isto é atribuído ao grande tamanho de cada alvo de hibridização BAC que permite a ligação de amostras suficientes rotulados para produzir sinais para detecção. Outra vantagem desta plataforma é a tolerância da heterogeneidade do tecido, diminuindo a necessidade de microdissecção tecido tedioso ^8. Este protocolo de vídeo é um tutorial passo-a-passo da rotulagem o DNA de entrada até a aquisição de sinal para o genoma série azulejos toda SMRT caminho.

PROBE ROTULAGEM

Nota: limite de exposição de Corantes Cye à luz o tempo todo (isso pode ser conseguido através do trabalho em uma área escura ou pela proteção dos tubos com uma tampa, como folha de alumínio)

1. Combine:
   (Setup um tubo de reação para referência e um tubo de reação para a amostra)
   • DNA (25-400 ng)
   • 5 mL de tampão 5X primers aleatórios (concentração final: 5X Promega Klenow tampão e 7 mg / mL octâmeros aleatório)
   • Diluída para 17,0 mL de volume total com H ₂ O destilada
2. Ferva por 10 minutos a 100 ° C. Transferir imediatamente para o gelo por 1 minuto.
3. Adicionar 4 mL de dNTP mix 10X (2mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP 1,2 mm).
4. Adicionar CyeDyes:
   • Adicione 2 mL (2 nmoles) de Cy-3 dCTP marcado com o DNA da amostra
   • Adicione 2 mL (2 nmoles) de Cy-5 dCTP marcado para Referência DNA (por exemplo, Novagen DNA genômico humano)
5. Adicionar 2,5 mL de Klenow (9 U / mL, Promega) e misturar.
6. Incubar a 37 ° C durante a noite * (~ 18 horas).
   
   * O tempo de hibridização durante a noite pode ser ajustada entre 14 a 24 horas sem afetar negativamente o processo de rotulagem para se adequar a um cronograma de laboratório.

AMOSTRA CLEAN UP

(Sonda combinada de limpeza e preparação para a hibridação)

1. Usando um microcontrolador YM-30 coluna:
   • Adicionar 100 Cot-1 mL DNA (1μg/μL) à coluna. Não toque membrana com pipeta ponta.
   • Piscina as reações (de referência e amostra) e adicionar a coluna.
   • Lugar na coluna tubo fornecido e girar à 13.000 g por 10 minutos.
   • Adicionar 200 mL H ₂ 0 destilada e repetir a membrana de giro para lavagem.
   • Descartar tubo e adicionar 45 mL de solução de hibridização: (Roche DIG Fácil)
   Opcional: adicione DNA do esperma 5μL sheared arenque (unidade 10μg/μL, Promega)
   
   • Inverter microcontrolador, coloque em um novo tubo rotulado, e girar a 3000 g por 3 minutos.

CÁLCULO de incorporações

1. Remover 1,5 mL e incorporação medida fluoróforo usando Espectrofotômetro NanoDrop. Usando o seu tampão de hibridação como um espaço em branco (DIG Easy) siga as instruções na tela. (Você pode recuperar a amostra do pedestal, se necessário, após a medição.)
   
   (Nota:. Incorporações abaixo de 3,0 pmol / mL nos dois canais têm mostrado resultados variáveis)
   
   
2. Desnaturar a 85 ° C por 10 minutos.
3. Sonda lugar a 45 ° C por 30 minutos a 1 hora (permite Cot-1 DNA annealing).

HIBRIDIZAÇÃO ARRAY

1. Coloque 44 mL de solução sonda sobre a lamínula (22 mm mm x 60) (Fisher Scientific). Se disponível, coloque a lamínula sobre uma lâmina quente ou bloco de aquecimento pré-aquecido a 45 ° C para manter a temperatura.
2. Alinhar deslizar sobre lamínula e solução de sonda, uma borda inferior da lâmina permitindo contato com a solução de hibridação. Continue a diminuir até a lamela está ligado ao slide com tensão superficial. Inverter slide.
3. Coloque o slide em cassete hibridação (Telechem), pré-aquecido a 45 ° C, e adicionar 10 mL de água na parte inferior do sulco (para controle de umidade durante a hibridação).
4. Cassete Seal e incubar por 36-40 horas a 45 ° C.

LAVAGEM ARRAY

Nota: Todas as soluções de lavagem são em pH 7,0

Remoção da lâmina da cassete hibridação é crítica. DIG Fácil cristaliza rapidamente a temperatura ambiente. A lâmina deve ser imediatamente imersas ea lamínula removidos na solução de lavagem.

1. Adicionar aproximadamente 60 mL de 0.1XSSC, 0,1% SDS (pH 7,0, 45 ° C) lavar solução para um frasco Coplin antes de abrir a câmara de hibridação.
2. Câmara aberta, adicionar slides solução para lavar e remover lamela (deve escorregar).
3. Lave o slide 3 vezes em 0.1XSSC + 0,1% SDS a 45 ° C por 1 minuto cada, com agitação.
4. Lavar o slide 3 vezes em 0.1XSSC fresca *. Não deve haver bolhas residual da lavagem SDS visível.
   
   * Os slides podem permanecer na solução de lavagem final até estar pronto para centrífuga e scan (~ 15 minutos).
   
   
5. Centrifugar o slide em uma tubos de 50 mL Falcon em 700 g por 3 minutos.
6. Verificar imediatamente os slides (intensidades de sinal irá diminuir ao longo do tempo.)

Pobres DNA de qualidade não vai fornecer um perfil de hibridização bom. É essencial para garantir que a amostra de ADN de referência e estão livres de contaminantes tais como fenol, RNA, sal, etc que possam interferir com a etapa de rotulagem aleatória principal antes de iniciar um experimento de hibridização. Por exemplo, a ressuspensão de DNA em Tris - EDTA (TE) em vez de água não é recomendada como alta concentração de sal pode inibir a reação rotulagem. Recomendamos assaying qualidade do DNA usando o espectrofotômetro Nanodrop para medir tanto a quantidade de DNA, bem como forma geral da curva de absorbância e 260/280, 260/230 ratio.

Lavagem: Retirar a lâmina do cassete de hibridação e transferindo para a solução de lavagem aquecida é um passo crítico no processo de hibridização como a DIG solução de hibridização Fácil cristaliza muito rapidamente. É importante que as soluções de lavagem estar em um pH neutro ea temperatura da solução de lavagem é importante para o rigor durante a remoção da sonda desacoplado. Após a secagem slides, é importante mantê-los no escuro, se não a digitalização imediatamente, ou após a digitalização se quiser rescan-los em um momento posterior.

Ozônio: O ozônio tem sido uma preocupação mundial ao realizar CGH array. Os níveis de ozônio acima 5ppm foram mostrados para afetar adversamente as tinturas Cye. Cye 5 é particularmente sensível à degradação de ozônio. Minimizar a exposição do ozono é fundamental para prevenir a degradação do corante Cye e perda do sinal antes e durante a digitalização. Digitalização à noite por exemplo, quando o ozônio ambiental é normalmente inferior, é uma opção possível. Caixas de ozônio livre para deslizar automatizados lavagem e varredura e tratamentos químicos vários slides estão disponíveis comercialmente. Corantes de ozônio resistentes Cye, recentemente, também foram desenvolvidos.

Queremos agradecer aos membros do Laboratório de Lam Wan equipe matriz BAC especialmente Miwa Suzuki e Bryan Chi para a preparação deste artigo. Este trabalho foi financiado com recursos do Canadian Institutes for Health Research, Canadá Genoma / British Columbia Genoma, e NIH / NIDCR conceder RO1 DE15965-01.