Method Article
Представленный здесь протокол включает в себя полисомальное профилирование для выделения транслатома, мРНК, связанных с рибосомами, в неполисомальные и полисомальные РНК из Arabidopsis с помощью центрифугирования градиента плотности сахарозы. Этот метод демонстрирует эффективность трансляции термически напряженного арабидопсиса.
Трансляционный контроль различных генов в условиях теплового стресса является критически важным этапом для адаптации растений к окружающей среде. Оценка трансляционной активности различных генов может помочь нам понять молекулярные механизмы, лежащие в основе устойчивости растений, способствуя развитию культур с повышенной стрессоустойчивостью в условиях глобального изменения климата. В данной работе представлена подробная методология оценки эффективности трансляции с помощью полисомного профилирования на предприятиях, подверженных тепловому стрессу. Процедура разделена на три части: обработка термическим стрессом для арабидопсиса, проверка эффективности трансляции с использованием полисомных профилей и расчет эффективности трансляции путем выделения неполисомальной и полисомальной РНК на основе профиля. В первой части растения Arabidopsis подвергаются контролируемому тепловому стрессу, чтобы имитировать проблемы окружающей среды. Обработка включает в себя воздействие на растения высоких температур в течение заданного времени, что обеспечивает постоянную и воспроизводимую индукцию напряжения. Этот шаг имеет решающее значение для изучения физиологических и молекулярных реакций растения на тепловой стресс. Вторая часть включает в себя проверку эффективности трансляции с помощью полисомного профилирования. Полисомы экстрагируются с помощью градиентного центрифугирования сахарозы, которое разделяет мРНК на основе рибосомной нагрузки. Это позволяет исследовать занятость рибосом на мРНК, что дает представление о механизмах трансляционного контроля в условиях стресса. В третьей части РНК выделяется как из полисомных, так и из неполисомальных фракций. Spike-in РНК используется для точного измерения количества РНК в каждой фракции. Расчет эффективности трансляции выполняется путем сравнения распределения мРНК по этим фракциям в нормальных условиях и в условиях теплового стресса. Трансляционную активность конкретных генов дополнительно оценивают путем проведения количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) с рибосом-ассоциированной РНК и общей РНК. Эта методология фокусируется исключительно на эффектах теплового стресса, предоставляя подробный протокол для анализа трансляционной регуляции в растениях.
Трансляция имеет решающее значение для организмов для синтеза функциональных белков из мРНК, поддерживая основные клеточные функции и биологические процессы, такие как метаболизм и передача сигналов, а также обеспечивая реакцию на стресс. Без трансляции клетки не могут производить жизненно важные белки, что влияет на их структуру, функцию и регуляцию, тем самым влияя на поддержание жизни и способствуя биологическому разнообразию 1,2. Поэтому изучение трансляционной эффективности растений имеет решающее значение. Перевод включает в себя несколько важных этапов. Во-первых, инициация происходит по мере того, как мРНК связывается с рибосомой, чему способствуют факторы инициации, такие как eIFs у эукариот, которые идентифицируют стартовый кодон, обычно AUG. Затем происходит элонгация в виде молекул транспортной РНК (тРНК), каждая из которых несет определенные аминокислоты, последовательно связывающиеся с рибосомой. Между соседними аминокислотами образуются пептидные связи, удлиняющие полипептидную цепь в соответствии с последовательностью мРНК. Наконец, терминация инициируется при встрече со стоп-кодоном (UAA, UAG или UGA), распознаваемым факторами высвобождения, которые побуждают рибосому высвобождать вновь синтезированный белок. На протяжении всей трансляции различные эукариотические факторы инициации (эИФ), факторы элонгации и рибосомные РНК работают вместе, обеспечивая точность и эффективность 3,4.
Предыдущие исследования показали, что посттрансляционные модификации играют решающую роль в регулировании взаимодействия между эИФ и, таким образом, влияют на эффективность перевода. Исследования in vitro показали, что киназа казеина 2 (CK2) фосфорилирует eIF3c, eIF5 и eIF2β, увеличивая их взаимодействие друг с другом и с eIF1 5,6. В темноте E3-лигаза КОНСТИТУТИВНО ФОТОМОРФОГЕННАЯ 1 (COP1) подавляет трансляцию, ингибируя TOR-опосредованное фосфорилирование S6K-RPS6. Нефосфорилированный RPS6 не способен образовывать функциональные рибосомы, тем самым останавливаятрансляцию. И наоборот, в световых условиях киназа супрессор PHYA 105 (SPA1) фосфорилирует eIF2α, облегчая сборку комплекса eIF2 и способствуя инициации трансляции8. Эти результаты подчеркивают сложные механизмы контроля, которые регулируют трансляцию в ответ на сигналы окружающей среды.
Умеренные стимулы окружающей среды могут эффективно способствовать трансляционным процессам, способствующим росту, таким как фотоморфогенез 8,9. Однако, когда факторы окружающей среды являются чрезмерными, неподвижные растения должны развивать соответствующие регулирующие механизмы для смягчения ущерба, вызванного экологическим стрессом10. В предыдущих исследованиях, связанных со стрессовыми реакциями растений, большинство из них были сосредоточены на регуляции на метаболическом, гормональном и транскрипционном уровнях 11,12,13,14. Тем не менее, недавние исследования начали подчеркивать влияние трансляционной регуляции на стрессоустойчивость растений 15,16,17. Установки могут повысить свою стрессоустойчивость за счет снижения поступательной эффективности, тем самым сводя к минимуму ненужное потребление энергии. Из-за образования немембранозных стрессовых гранул в растительных клетках нетранслируемая мРНК и ассоциированные белки агрегируются внутри них, снижая эффективность трансляции18. Одним из распространенных стрессов окружающей среды, с которыми часто сталкиваются растения, является тепловой стресс, который, как сообщается, вызывает образование стрессовых гранул в растительных клетках19,20. Глобальное повышение средних температур из-за глобального потепления серьезно влияет на урожайность сельскохозяйственных культур21. Поэтому изучение физиологической регуляции растений в условиях теплового стресса имеет решающее значение. Предыдущее исследование показало, что термическая обработка пшеницы привела к снижению мРНК, связанной с полисомами. Тем не менее, мРНК, хранящиеся в стрессовых гранулах, высвобождались и возвращались в рибосомы, облегчая трансляцию после восстановления22. Кроме того, в предыдущих исследованиях сравнивали экспрессию генов между общей мРНК и связанной с полисомами мРНК у погруженных в воду растений16. Результаты показали, что равновесные уровни мРНК, связанные с абсцизовой кислотой и абиотическими стрессовыми реакциями, незначительно увеличивались после погружения. Кроме того, значительно увеличилось количество мРНК, связанных с полисомами. Эти результаты свидетельствуют о том, что регулирование трансляции может играть более важную роль в контроле устойчивости растений к стрессу. Таким образом, эффективный метод выделения полисомальных РНК имеет решающее значение для изучения транслатома образцов, подвергшихся стрессовой обработке.
В этом протоколе мы модифицировали метод выделения РНК с высокорискованной и объемной экстракции фенол/хлороформ методом осаждения LiCl на метод мелкомасштабной экстракции фенола/тиоцианата гуанидиния, который требует меньшего объема. Первый метод предполагает прямое смешивание с полисомальными фракциями, в результате чего получается более крупный экспериментальный отход 9,15,23. В отличие от этого, этот модифицированный подход использует принципы дифференциальной плотности: полисомальная РНК сначала смешивается с раствором с высоким содержанием соли и сахара, а затем осаждается ультрацентрифугированием. В дальнейшем проводят экстракцию РНК с использованием небольшого объема реагента фенол/гуанидиния тиоцианат. Такой метод эффективно снижает образование органических отходов, делая наш эксперимент более экологичным. Кроме того, используемые органические растворители обладают меньшей токсичностью. Эти причины побудили нас соответствующим образом скорректировать и усовершенствовать экспериментальные процедуры. Кроме того, предыдущие методы не предоставляли исчерпывающего протокола для расчета эффективности трансляции с использованием нормализации с помощью пиковой нормализации, которая необходима для более глубокого транслатомического анализа.
В данной статье мы описываем профилирование полисом и протокол выделения полисомальной РНК для исследования эффективности трансляции и транслатомический анализ у Arabidopsis в условиях теплового шока. Этот протокол был использован для оценки эффективности трансляции в диком типе Col-0 в нормальных условиях, условиях теплового шока и после восстановления. Результаты профилирования полисом и процентное содержание полисомальной РНК выявили изменения в эффективности трансляции после обработки тепловым стрессом у рассады арабидопсиса .
1. Подготовка образца рассады арабидопсиса с термическим стрессом
2. Приготовление градиента сахарозы
3. Подготовка образцов полисомного профилирования
4. Анализ полисомного профилирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения профилирования полисом используется фракционатор градиента плотности с микрообъемным шприцевым насосом.
5. Выделение неполисомальных и полисомальных РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой части протокола использовалась другая группа образцов из той же партии после выполнения ультрацентрифугирования с выполнением тех же этапов, которые были описаны ранее.
6. Экстракция неполисомальных и полисомальных РНК
7. Нормализация с резким увеличением
Дикий вид Arabidopsis, Col-0, выращивали на среде MS при световом фотопериоде 16 ч:8 ч. Для контроля использовали 5-дневную рассаду без обработки термическим стрессом. Группу теплового стресса подвергали тепловой обработке в течение 1 ч при 40 °С на предварительно нагретой водяной бане, в то время как группу восстановления помещали при температуре 22 °С в течение 2 ч сразу после термической обработки. Используя различные условия термообработки и восстановления, мы можем использовать последующие шаги для измерения их поступательной эффективности.
Перед экстракцией РНК необходимо сначала подготовить градиент сахарозы. Для разделения неполисомальной и полисомальной РНК на основе разницы их плотности мы приготовили градиентный раствор с концентрациями сахарозы 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% и 60%. Затем мы загружали градиентные растворы от высокой концентрации к низкой, начиная со дна (рис. 1A). Впоследствии мы можем использовать этот градиент для разделения неполисомальной РНК более низкой плотности в верхнем слое, в то время как полисомальная РНК более высокой плотности будет распределена в нижнем слое с более высокими концентрациями сахарозы. Неполисомальную и полисомальную РНК выделяли из обработанного или необработанного Col-0. Чтобы частицы в растворе не влияли на результаты анализа полисомного профилирования, РНК-содержащий раствор следует фильтровать через сетчатое фильтр для получения экстракционного раствора, не содержащего частиц. Отфильтрованную надосадочную жидкость загружали на заранее подготовленный градиент сахарозы и уравновешивали. После ультрацентрифугирования образцов, загруженных сахарозным градиентом, неполисомальные и полисомальные РНК были распределены по плотности в пределах градиента сахарозы. В дальнейшем профилирование полисом проводили с помощью фракционатора градиента плотности (рис. 1В). Управление фракционатором с градиентом плотности осуществляется с помощью программного обеспечения, первоначально откалиброванного с помощью деионизированной воды. После калибровки образцы загружаются в ректификационный агрегат после ультрацентрифугирования. Работая в режиме программного управления, микрообъемный шприцевой насос впрыскивает в градиент раствор сахарозы с концентрациями выше градиента сахарозы, проталкивая образец. Это позволяет начать измерение с вершины градиента сахарозы, где плотность ниже, и двигаться к низу, где плотность выше. Затем активируются настройки программного обеспечения, чтобы начать сбор данных, генерируя граф профиля полисом с помощью измерения OD254 (рисунок 1B). Когда мы наблюдаем более высокую интенсивность сигнала в полисомальной фракции, это указывает на то, что образец демонстрирует более высокую эффективность трансляции.
Графики профилирования полисом для 5-дневных сеянцев Col-0 при различных обработках представлены на рисунке 2. Результаты контрольной группы демонстрируют четкое разделение между неполисомальной фракцией и полисомальной фракцией (рис. 2А). Однако после 1 ч теплового стресса при 40 °C интенсивность сигнала полисомальной фракции значительно снижалась (рис. 2В). Когда термически обработанной рассаде дали восстановиться при температуре 22 °С в течение 2 ч, интенсивность сигнала полисомальной фракции восстановилась до уровня, аналогичного контрольной группе (рис. 2В). Наши результаты показали, что обработка тепловым стрессом через 1 ч значительно снижает эффективность трансляции рассады арабидопсиса. Тем не менее, растениям потребовалось 2 часа восстановления, чтобы восстановить эффективность трансляции до уровней, сравнимых с теми, которые были у рассады, не страдающей от теплового стресса.
Чтобы собрать дополнительные данные, сравнивающие эффективность трансляции сеянцев Col-0 в различных условиях обработки, мы выделили и экстрагировали фракции неполисомальной и полисомальной РНК. При сборе неполисомальных и полисомальных фракций РНК руководствовались результатами измерений профиля полисом. Для экстракции неполисомальных и полисомальных РНК мы используем реагент фенол/тиоцианат гуанидиния для экстракции выделенных образцов неполисомальной и полисомальной РНК. С помощью использованного нами метода экстракции РНК мы можем получить стабильную и высококачественную РНК для нашего последующего анализа (табл. 1). Затем нормализуйте извлеченную РНК с помощью набора GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit для смягчения ошибок, вызванных различными потерями экстракции. Затем с помощью ПЦР в реальном времени была проведена количественная оценка экспрессии генов DAP , которые входят в состав набора генов B. subtilis . Для оценки содержания РНК в условиях пропорциональной потери был проведен сравнительный анализ уровней экспрессии гена DAP между группами неполисомальных и полисомальных РНК (рис. 3А). Мы рассчитали отношение нормализованной полисомальной РНК к общей РНК для уточнения эффективности трансляции между ними (рис. 3B). Наконец, соотношение РНК в полисомах рассчитывали с использованием нормализованного содержания РНК (рис. 3C). Результаты соотношения РНК в полисомах при различных обработках Col-0 показали закономерность, согласующуюся с результатами профиля полисом, показанными на рисунке 2А. Оба результата указывают на то, что тепловой стресс значительно снижает соотношение РНК в полисомальной фракции, и этот эффект может быть обращен вспять после 2-часового восстановления при 22 °C (Таблица 1).
С помощью этого метода мы можем получить целую неполисомальную или полисомальную фракцию РНК с высоким качеством, а не разделять РНК на дополнительные фракции23. Наши результаты также показывают, что как профили полисом, так и процентное содержание РНК в полисомах могут эффективно отражать эффективность трансляции у Arabidopsis с различными условиями лечения.
Рисунок 1: Схема рабочего процесса профилирования полисом. (A) Схематическая иллюстрация приготовления градиента сахарозы в центрифужной пробирке объемом 13 мл. (B) Блок-схема иллюстрирует экспериментальный процесс профилирования полисом. Сначала извлекается транслатом. В дальнейшем неполисомальные и полисомальные РНК разделяют на основе их разницы в плотности с помощью ультрацентрифугирования в градиентах сахарозы различной плотности. Наружный диаметр254 измеряют с помощью фракционатора градиента плотности для получения приведенного ниже графика результатов профилирования полисом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Полисомное профилирование Col-0 в различных условиях. (А, В, В) Получены результаты профилирования полисом Col-0 в условиях (А) без термической обработки (контроль), (В) термической обработки при 40 °С в течение 1 ч и (В) восстановления при 22 °С в течение 1 ч после термической обработки. Неполисомальные и полисомальные РНК фракционировали с использованием градиента сахарозы 12,5%-60%. На профилях указаны положения неполисомальной (NP) и полисомальной (PL) РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Диаграмма рабочего процесса экстракции неполисомальных и полисомальных РНК. (A) Иллюстрация нормализации РНК по спайку. (B) Иллюстрация разделения неполисомальных и полисомальных РНК и расчета процентного соотношения полисомальных РНК. (C) Процентное содержание полисомальной РНК в Col-0, обработанном различными состояниями. Полосы погрешностей указывают среднее значение ± SD (n=3 биологических повторов). *p-значение < 0,01, t-критерий Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Содержание (нг) | 260/280 | 260/230 | ||
Контроль | РНК NP | 758.3 | 2.19 | 2.16 |
РНКPL | 302.3 | 2.21 | 2.13 | |
Тепловой стресс | РНК NP | 821.5 | 2.2 | 2.15 |
РНКPL | 174.3 | 2.19 | 2.21 | |
Выздоровление | РНК NP | 797.2 | 2.17 | 2.16 |
РНКPL | 300.9 | 2.19 | 2.18 |
Таблица 1: Содержание и свойства неполисомальных и полисомальных РНК. В этой таблице были проанализированы содержание и свойства РНК. Содержание РНК нормализовали после экстракции модифицированными методами.
В этом протоколе изложен простой и стандартизированный метод измерения эффективности трансляции сеянцев арабидопсиса. Важнейшими этапами этого протокола являются обеспечение стабильности РНК с помощью вторичного центрифугирования и экстракции РНК реагентом, а также тщательная подготовка градиента сахарозы. Кроме того, мы предлагаем критические шаги для нормализации и количественного определения неполисомальной и полисомальной РНК с помощью метода нормализации спайков. Очень важно, что все процедуры должны проводиться на льду с использованием буферов и инструментов, не содержащих РНКазы. Кроме того, обеспечьте точное приготовление концентрации сахарозы и сведите к минимуму встряхивание, чтобы уменьшить ее влияние на градиент. В предыдущих исследованиях 24,25,26 исследования реакций на стресс в основном были сосредоточены на транскрипционном и фенотипическом анализе. С помощью анализа полисомного профиля мы можем дополнительно исследовать регуляцию трансляционных процессов в растениях в условиях стресса или других раздражителей окружающей среды.
Понимание трансляционных процессов включает в себя не только проведение экспериментов по профилированию полисом, но и дополнение их экспериментами по мечению азидогомоаланином (AHA). Мечение AHA-кислотами используется для исследования синтеза белка и трансляционной активности27. Метод заменяет остатки метионина во вновь синтезированных белках на AHA, аналог метионина, содержащий азидную группу. Клетки интегрируют AHA-кислоту во вновь синтезированные белки во время трансляции. Впоследствии, используя методы, основанные на химии азидов, такие как клик-химия, белки, содержащие AHA, могут быть селективно помечены и обнаружены, что позволяет проводить количественный анализ и визуализацию активно транслирующихся белков28. Комбинируя мечение AHA-кислот с профилированием полисом, исследователи могут получить более глубокое представление о динамике синтеза белка врастительных клетках.
С помощью этого метода выделения полисомальных РНК и нормализации спайков мы также можем использовать выделенную РНК для анализа секвенирования РНК. Анализируя полисомно-связанную мРНК, мы можем определить, какие мРНК активно претерпевают трансляцию. Кроме того, сравнение стационарной мРНК с мРНК, связанной с полисомами, позволяет нам идентифицировать гены, которые сверхэкспрессируются на уровне трансляции или транскрипции. Уровень экспрессии стационарной мРНК отражает транскрипционную активность, в то время как связанная с полисомами мРНК указывает на гены, активно претерпевающие трансляцию. На эффективность перевода влияют раздражители окружающей среды и посттрансляционные модификации 7,8,9,16. Таким образом, данный метод обеспечивает всестороннее понимание того, является ли целевой белок, представляющий интерес, эффективной трансляцией. Однако предел этого метода заключается в том, что во время процедуры экстракции все равно произойдет потеря РНК. Относительная экспрессия РНК с шипами, полученная с помощью qRT-PCR, также может привести к небольшим ошибкам измерения. Необходимы дальнейшие исследования и валидация с использованием протеомики или вестерн-блоттинга для изучения функциональных аспектов целевого белка.
Подводя итог, можно сказать, что этот протокол представляет собой простой метод, который обеспечивает простой подход с четкими результатами для оценки эффективности перевода. Важно отметить, что его применимость выходит за рамки рассады, подвергшейся термическому стрессу, и распространяется на рассаду, подвергшуюся воздействию различных других раздражителей окружающей среды.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Мы выражаем признательность за услуги по техническим исследованиям в области ультрацентрифуг от Technology Commons в Колледже естественных наук и Центра приборов, спонсируемого Министерством науки и технологий Национального университета Тайваня (Тайвань). Мы также благодарим Юй-Лин Ляна за техническую поддержку и сотрудников лаборатории Ченга за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана Программой стипендий для молодых ученых Эйнштейна от Национального совета по науке и технике Тайваня в рамках грантов. NSTC 113-2636-B-002-007 в M.-C.C. M.-C.C. выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Национального университета Тайваня.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL eppendorf tube | Labcon | 3012-870-000-9 | RNA extraction |
13.2 mL centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | ultracentrifugation |
Bromophenol blue | Honeywell | 32712 | Polysome profile |
Chloroform | Honeywell | 32211 | RNA extraction |
Cycloheximide (CHX) | Sigma-Aldrich | SI-C7698 | Polysome profile |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | RNA extraction |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | RNA extraction |
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit | Invitrogen | 900433 | Normalization |
Glycerol | Honeywell | 15523 | Normalization |
Heparin | Sigma-Aldrich | SI-H3149 | Polysome profile |
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit | Vazyme | R323-01 | Normalization |
KCl | J.T.Baker | 3040-01 | Polysome profile |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | SI-M8266 | Polysome profile |
MS basal medium | Phyto | M524 | Plant culture |
Peak Chart Syringe Pump | Brandel | SYN4007LS | Polysome profile |
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE) | Sigma-Aldrich | P2393 | Polysome profile |
RNasin | Promega | N251B | Polysome profile |
Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | SI-D6750 | Polysome profile |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5391 | Polysome profile |
SYBR Green Supermix | Bio-Rad | BP170-8882 | Normalization |
TRI reagent | MRC | TR118 | RNA extraction |
Tris-HCl | J.T.Baker | 4109-06 | Polysome profile |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100K | ultracentrifugation |
UV/VISDETECTOR | Brandel | UA-6 | Polysome profile |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены