Модель ко-культивирования с использованием двух типов адгезивных клеточных линий

Протокол демонстрирует новую экспериментальную модель in vitro , которая может резюмировать биологию двух видов адгезивных клеточных линий с помощью трехмерного (3D) печатного каркаса. Описывается построение этой модели и операционные процедуры, от подготовки клеток и культивирования клеток до анализа и оценки.

На имплантацию эмбриона влияют взаимодействия между различными типами клеток в интерфейсе мать-эмбрион. Прямые и косвенные связи между различными типами клеток в децидуальной кости имеют решающее значение для регуляции рецептивности эндометрия; Однако молекулярные механизмы, опосредующие это взаимодействие, до сих пор неясны. В связи с этим необходима модель для изучения процесса имплантации для создания комплексной модели in vitro , которая может резюмировать биологию взаимодействия эпителия эндометрия и стромы. Эта модель состоит из обычных пластин для клеточных культур и соответствующего каркаса, который создается с помощью трехмерной (3D) печати из недорогих материалов. В этой статье мы подробно описываем набор протоколов для построения модели, подготовки клеток, посева клеток, культивирования клеток, наблюдения и оценки. Кроме того, мы включили репрезентативные результаты с клетками, демонстрирующими хорошие условия роста под микроскопом. Это исследование было направлено на разработку моделей in vitro , которые имитировали бы взаимодействие между стромальными клетками эндометрия и эпителиальными клетками, а также между клетками трофобласта и клетками эндометрия.

Несмотря на обширные исследования беременности у человека, молекулярные механизмы на границе между матерью и плодом во время имплантации и ранней беременности остаются^{плохо изученными}. Эндометрий человека в основном состоит из двух типов клеток: эпителиальных клеток эндометрия (ЭЭК) и стромальных клеток эндометрия (ЭСК). Имплантация проходит через три этапа: аппозиция, прикрепление и инвазия, которые приводят к развитию компетентного эмбриона и рецептивного эндометрия². Учитывая этические ограничения исследований in vivo на людях, а также трудности в полном моделировании человеческого состояния у животных, построение моделей культуры эндометрия человека in vitro стало эффективным средством воспроизведения^{процессов} имплантации и ранней беременности. Эти модели ценны для исследования как нормальной, так и патологической беременности и обеспечивают основополагающую платформу для предварительного тестирования и валидации терапевтических вмешательств в трансляционной медицине.

Коммерческие камеры широко используются в клеточных биологических исследованиях. Эти камеры дают ценную информацию о миграции клеток и перекрестных помехах между различными типами клеток. Тем не менее, коммерческие камеры, как правило, являются одноразовыми и могут быть дорогостоящими⁴.

Большое количество моделей культуры человека in vitro, состоящих из эндометрия и бластоцисты, или суррогатов бластоцисты, было разработано для лучшего понимания подробного процесса имплантации. Эти модели, однако, все еще находятся на начальной стадии применения, поскольку 3D-структура представляет собой очень сложную экспериментальную установку, а некоторые специфические среды для дифференцировки^{стоят дорого.}

Использование доступного оборудования для 3D-печати и относительно короткие сроки изготовления позволяют подгонять конструкции под различные экспериментальные цели. Методы 3D-печати помогают сократить временные затраты и позволяют создавать сложные конструкции по индивидуальному заказу. Эта технология значительно ускоряет разработку и итерацию прототипов, что делает ее ценным инструментом для исследователей в различных областях, позволяя им выполнять свою работу более эффективно ^8,9,10.

Здесь мы представляем осуществимый и экономичный экспериментальный протокол для создания 3D-структуры и ее использования в качестве системы клеточной культуры, которая может моделировать взаимодействие между стромальными и эпителиальными клетками эндометрия для исследования рецептивности эндометрия во время имплантации эмбриона. Это обеспечивает настраиваемую и недорогую альтернативу коммерческим одноразовым материалам.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, используемые в этом протоколе, можно найти в Таблице материалов. Если не указано иное, перед использованием все среды были предварительно отбалансированы до 37 °C.

1. 3D печать строительных лесов и макета конструкции

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги здесь были выполнены в соответствии с инструкцией по эксплуатации коммерческой машины для 3D-печати металлом. Эти шаги кратко описаны ниже (Дополнительный файл 1).

1. Выравнивание печатной платформы
   1. Нажмите на значок меню на панели управления и перейдите в раздел «Утилиты». Выберите Bed Level (Уровень кровати ), чтобы начать процедуру выравнивания.
   2. Извлеките лист для печати со стола для печати и нажмите кнопку Готово. Печатная платформа поднимется на максимальную высоту для подготовки к выравниванию. Как только индикатор выполнения достигнет 100%, нажмите «Старт».
   3. Если принтер Metal X ранее не был выровнен, выберите «Сброс». Если это так, выберите «Пропустить » и перейдите непосредственно к шагу 1.1.5 (сканирование по 16 точкам).
   4. С помощью шестигранного ключа 2,5 мм поверните все выравнивающие винты с тремя станинами по часовой стрелке до упора. Затем ослабьте их, повернув против часовой стрелки на два полных оборота, чтобы установить их на средней высоте. Нажмите «Готово », чтобы продолжить.
   5. Принтер будет сканировать кровать в 16 обозначенных точках. Воздержитесь от прикосновений к кровати или каркасу во время этого процесса. Как только прогресс достигнет 100%, нажмите Далее.
2. Печать листового приложения
   1. Удалите остатки металла или мусор опоры. Переведите ползунок «Вакуум» в положение «Вкл.».
   2. Дайте кровати опуститься и нагреться, затем нажмите Далее. Поместите лист для печати на вакуумную сетку и нажмите кнопку «Далее».
   3. Расположите листовую печатную машину над листом печати, совместив его с Z-образными рельсами в задней части камеры.
   4. Подождите, пока вакуум войдет в срабатывание и создаст прочное уплотнение. Как только вакуум будет включен, нажмите кнопку «Готово».
3. Загрузка металлической нити накала
   1. Вручную расположите печатающую головку в центре области печати. Снимите крышку печатающей головки, сдвинув ее вверх и сняв с крепежных винтов.
   2. Коснитесь значка меню на доске параметров. Выберите Материалы из предложенных вариантов.
   3. Выберите Load Metal, чтобы начать процедуру загрузки. Выберите «Быстрая загрузка».
   4. Выберите конкретный тип металлического материала для загрузки (например, алюминий 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
   5. Наденьте катушку на держатель и нажмите кнопку «Далее». Закройте дверцу и дайте катушкам прогреться, затем нажмите «Далее».
   6. Вставьте материал в переднее входное отверстие печатающей головки (с маркировкой M) до тех пор, пока экструдер не начнет протягивать его.
4. Печать металлических деталей
   1. На панели «Параметры печати» нажмите кнопку «Экспортировать устройство». Сохраните файл на USB-накопителе, отформатированном в FAT32, и вставьте его в принтер.
   2. Выберите значок меню на доске. Перейдите в раздел «Хранилище» и выберите «Печать из хранилища». Выберите файл детали, чтобы начать печать.
5. Удаление металлической части
   1. Осторожно сдвиньте лист для печати и отпечатанные детали с печатной платформы. Аккуратно отсоедините детали от листа печати. Гибкий лист должен легко отслаиваться.

2. Подготовка к кокультуре клеток в 3D-модели

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать устойчивые к высоким температурам материалы в качестве расходных материалов для 3D-печати опор каркаса покровного стекла для 3D-печати, чтобы облегчить стерилизацию в автоклаве перед каждым использованием в экспериментах с клеточными культурами. В этом исследовании были использованы иммортализованные стромальные клетки эндометрия человека (HESC) и эпителиальные клетки эндометрия человека (Исикава). Ранее сообщалось о характеристике этих клеточных линий ^5,6.

1. Культивирование клеток и пассирование
   1. Приготовьте 50 мл комплементарной среды для hESC, добавив среду DMEM/F12 + 2 мМ L-глютамина + 10% сыворотку плода крупного рогатого скота (FBS) + 1% раствор пенициллина/стрептомицина.
   2. Приготовьте 50 мл дополнительной среды для Исикавы, добавив модифицированную среду Dulbecco Modified Eagle + 10% FBS + 1% раствор пенициллина/стрептомицина.
   3. Размораживание клеток
      ПРИМЕЧАНИЕ: Купленная клеточная линия была отгружена на сухом льду в замороженном состоянии. Его следует хранить в паровой фазе жидкого азота или при температуре ниже -130 °C.
      1. Подготовьте все необходимое стерилизованное оборудование и фермент диссоциации, а также подогрейте дополнительную среду до 37 °C.
      2. Быстро разморозьте клетки на водяной бане при температуре 37 °C с редкими легкими покачиваниями. Перенесите клеточную суспензию в пробирку, содержащую 5 мл базальной питательной среды, и центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут.
      3. Осторожно удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл приготовленной полной питательной среды и распределите ее по двум колбам для культур Т25. Культивируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5%_CO2.
2. Подготовка клеток с покровным стеклом
   1. Используйте квадратный покровный лист толщиной 18 мм в качестве поверхности клеточной культуры; Убедитесь, что покровное стекло чистое и стерильное.
   2. Покройте покровное стекло на дно 12-луночного планшета 200 мкл внеклеточного матрикса (ВКМ) в концентрации 200-300 мкг/мл. Держите тарелку при температуре 37 °C в течение 1 часа.
   3. Снимите ЭБУ с пластины. Осмотрите клетки на предмет соответствующей конфлюенции и убедитесь, что плотность обеих клеточных линий составляет около 70%-80%
   4. Удалите отработанную среду и промойте клетки 3 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) 2x.
   5. Добавьте 2 мл фермента диссоциации и культивируйте клетки при температуре 37 °C в течение 2 минут, чтобы отделить их.
   6. Нейтрализовать полной питательной средой и создать одноклеточную суспензию путем пипетирования вверх и вниз.
   7. Возьмите 100 мкл клеточной суспензии и смешайте с трипановым синим (коэффициент разбавления =2).
   8. Наденьте покровное стекло на камеру гемоцитометра. Заполните обе боковые камеры клеточной суспензией, содержащей трипановый синий.
   9. Посчитайте количество клеток в квадратах с обеих сторон под 20-кратным микроскопом и рассчитайте плотность клеток.
   10. Перенесите клетки в подготовленную тарелку со свежей средой и инкубируйте при 37 °C с 5%_CO2. Засейте hESC в лунку в концентрации 1 x 10⁵ клеток/мл в течение 24 ч.
   11. Для клеточной линии Исикавы на следующий день засейте ячейку в лунку без покровного стекла.

3. Сборка модели совместной культуры

1. Тщательно замочите каркасы этиловым спиртом и двойной дистиллированной водой (ДДВ) на 2 суток. Подмостки простерилизовать автоклавом при температуре 121 °C и высушить.
2. Добавьте около 2 мл комплементарной среды для клеточной линии Исикавы в лунку для культивирования Исикавы, следя за тем, чтобы уровень жидкости покрывал покровное стекло.
3. Перенесите защитное покрытие с hESC на строительные леса и держите боковую сторону ячейкой вниз. Вставьте строительные леса в хорошо возделываемую Исикаву. Для второго комплекта переверните эту схему, перенеся крышку покровного стекла с помощью Исикавы на строительные леса и вставив подмостки в хорошо культивируемый hESC. Используйте ячейки без каркаса для анализа роста клеток независимо друг от друга.
4. Инкубируйте систему совместного выращивания при 37 °C, 5%_CO2. Период сокультуры может варьироваться в зависимости от плана эксперимента, но обычно колеблется от 24 до 72 часов.

4. Получение изображения

1. Осторожно удалите питательную среду и осторожно промойте клетки стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS).
2. Удалите покровные листы с прикрепленными клетками с посуды для культур с помощью тонких щипцов или пинцета. По желанию поместите покровные листы в новую посуду с PBS, чтобы предотвратить высыхание во время переноса.
3. Возьмите чистое предметное стекло микроскопа и поместите каплю PBS. Аккуратно перенесите покровное стекло, содержащее ячейки, на каплю монтажной среды, расположив ячейки лицевой стороной вниз на предметном стекле.
4. Поместите подготовленное предметное стекло на предметный столик инвертированного микроскопа. Выберите подходящий объектив (например, 10x, 20x) и отрегулируйте фокусировку с помощью ручек грубой и тонкой фокусировки.
5. Установите параметры микроскопа, такие как интенсивность освещения и настройки камеры. С помощью программного обеспечения микроскопа можно получить изображения клеток с желаемым увеличением и полем зрения. Отрегулируйте время экспозиции и другие параметры изображения для оптимизации качества изображения.

5. Обработка изображений

1. Нажмите кнопку Открыть , чтобы открыть изображение, нажмите Обработка > Фильтры > Улучшение, чтобы > выбрать локальную коррекцию, и нажмите кнопку Применить.
2. Нажмите кнопку Редактировать > > Преобразовать в Шкалу Серого 8. Нажмите «Улучшить», выберите «Применить контраст».
3. Нажмите Подсчитывать и измерять объекты. Нажмите Вручную, выберите диапазон и настройте гистограмму, чтобы убедиться, что все ячейки покрыты.
4. Нажмите «Применить маску», закройте текущее окно, нажмите «Автоматические яркие объекты > измерения», выберите «Измерение» и выберите «Эра», «Дендрик», «Плотность» и «Размер».
5. Нажмите «Автоматические яркие объекты», затем нажмите «Подсчет». Нажмите «Экспортировать данные », чтобы экспортировать данные измерений в таблицу.

6. Забор клеток

1. Снимите покровные стекла со предметного стекла микроскопа и переложите их в чистую и сухую лунку.
2. Соберите клетку Исикавы с помощью реагента для выделения РНК для транскриптомного исследования или реагента для лизиса Ripa для протеомных исследований.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для hESC метод посева покровного стекла был более эффективным для получения изображений после иммунного окрашивания. В качестве альтернативы, hESC может быть собран с помощью реагента для выделения РНК или реагента для лизиса Ripa. Клеточные линии, культивируемые на покровном листе или поверхности пластины, могут быть заменены; Тем не менее, мы рекомендуем засевать клетки, подготовленные для визуализационного анализа, на покровном листе.

На рисунке 1 показан самодельный каркас для клеточных стекол, используемый в этом процессе, который включает в себя верхнее опорное кольцо, предназначенное для крепления к стандартным 12-луночным планшетам для клеточных культур, дополненное держателем предметного стекла базальных клеток с четырьмя L-образными стержневыми структурами.

Согласно рисунку 2, плотность обоих типов клеток в условиях кокультуры (рисунок 2A, B) оставалась низкой после 72 ч совместного культивирования; однако плотность обоих типов клеток, культивируемых независимо друг от друга, значительно выросла (рисунок 2C, D). Кроме того, продолжительность совместно культивируемого hESC была короче по сравнению с независимо культивируемым hESC (рисунок 2E-G).

Профиль клеток Исикавы и клеток hESC указывает на существование взаимодействий между двумя типами клеток. В то же время система позволяет нам продолжать проводить последующие эксперименты на отдельных клеточных линиях, включая иммунохимическое окрашивание и вестерн-блоттинг.

Рисунок 1: Напечатанный на 3D-принтере каркас покровного стекла, используемый в протоколе эксперимента. (A) Каркас в моноформе. (В) Скаффолд в двоичной форме. (C) Иллюстрация, демонстрирующая размещение покровного стекла на строительных лесах. (D) Иллюстрация, демонстрирующая размещение скаффолда в стандартной 12-луночной пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Профиль клеточных линий hESC и Исикавы, обработанных в течение 3 дней с различными состояниями. (A) Семена Исикавы на покровном листе, совместно культивируемые с hESC с помощью скаффолда (Bar=200 μm). (B) Семена hESC на покровном листе подвергаются совместному культивированию с Исикавой с использованием каркаса. (C) Клетки Исикавы культивировали в комплементарной среде с 10% FBS. (D) Клетки hESC культивировали в комплементарной среде с 10% FBS. (E) Клеточная плотность hESCs в условиях ко-культивирования значительно ниже, чем в условиях независимого культивирования. (F) Клеточная плотность клеток ISHIKAWA в условиях ко-культивирования значительно ниже, чем в условиях независимого культивирования. (G) Продолжительность hESC в условиях совместного культивирования значительно короче. N=3; , p<0.05, полоса ошибок показывает стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Файл кодирования для 3D-печати. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Описан упрощенный и экономически эффективный протокол для непрямого кокультивирования стромальных и эпителиальных клеток эндометрия. В этом методе используется самодельный каркас для клеточных стекол, который состоит из верхнего опорного кольца, предназначенного для крепления к стандартным 12-луночным планшетам для клеточных культур, дополненного держателем предметного стекла базальных клеток с четырьмя L-образными стержневыми структурами. Такая установка облегчает разделение стромальных и эпителиальных клеток эндометрия, обеспечивая их взаимодействие посредством обмена сигнальными молекулами в питательной среде. Одним из ключевых преимуществ этого подхода является существенное сокращение времени и затрат по сравнению с коммерчески доступными системами совместного выращивания¹¹. Самодельные леса сооружаются из легкодоступных материалов, что значительно снижает стоимость установки. Кроме того, его конструкция проста, что позволяет исследователям легко собирать и разбирать каркас, тем самым экономя время и усилия в лаборатории. Кроме того, самодельный каркас можно чистить и стерилизовать для многократного использования, что делает его устойчивым и экономичным вариантом для текущих исследований. Эта функция особенно полезна для долгосрочных исследований, где решающее значение имеют стабильные и надежные результаты.

Стромальные клетки эндометрия и эпителиальные клетки играют ключевую роль в содействии успешной имплантации эмбриона. В физиологических условиях эпителиальные клетки эндометрия и стромальные клетки в эндометрии, как правило, не имеют прямого контакта. Исследования децидуализации стромальных клеток эндометрия человека доказали, что эпителиальные клетки влияют на децидуальный процесс с помощью паракрина. Непосредственная близость эпителиальных и стромальных клеток обеспечивает эффективную коммуникацию посредством паракринной сигнализации¹². Это взаимодействие имеет жизненно важное значение для координации циклических изменений в эндометрии, включая подготовку к имплантации и последующее отторжение тканей, если имплантация не происходит¹¹. Как эпителиальные, так и стромальные клетки экспрессируют рецепторы эстрогена и прогестерона, которые регулируют их пролиферацию, дифференцировку и секреторную активность. Эпителиально-стромальные перекрестные помехи обеспечивают хорошую координацию этих реакций¹³. Таким образом, сложные перекрестные помехи между этими клетками остаются критически важной областью исследований, поскольку важно понимать сложные процессы, лежащие в основе рецептивности эндометрия и имплантации эмбриона^. Несмотря на значительные достижения в области репродуктивной биологии, детальные механизмы коммуникации между этими типами клеток во время имплантации до сих пор до конца не выяснены^.

Каркас обеспечивает удобный способ достижения совместного культивирования двух видов адгезивных клеток. Тем не менее, в процессе долгосрочного совместного культивирования покровные клетки продолжают расти и обновляться с течением времени, а мертвые клетки падают и вступают в контакт с клетками нижнего слоя, что может повлиять на клетки нижнего слоя. Кроме того, ячейки семян на покровном стекле размещаются лицевой стороной вниз на каркасе. Оказывает ли гравитация какое-либо влияние на состояние клеток, неизвестно. В этом исследовании для демонстрации использовались две клеточные линии, hESC и Ishikawa. Скаффолд может быть широко использован в кокультуре двух различных видов адгезивных клеточных линий. Кроме того, каркас также может использоваться в качестве платформы для других соединений или разделительных сред для лекарств, а также в качестве монтажной платформы для различных устройств, таких как люминесцентные, нагревательные и электродные устройства.

В данной работе мы представляем надежную и надежную систему культивирования клеток in vitro с использованием специфического скаффолда, который является полезным и удобным инструментом для дальнейшего изучения молекулярного механизма взаимодействий эмбриона и материнских клеток матки. Кроме того, мы охарактеризовали целесообразность использования созданного каркаса в качестве модели для исследований бластоцисты/трофобласта. Этот протокол позволяет создавать подходящие каркасы с помощью 3D-печати и выполнять их функцию в качестве 3D-структуры для платформ миграции или вторжения в небольших объемах (12-луночные планшеты), где различные факторы могут быть оценены с помощью систем количественной оценки изображений.

Использование клеточных линий позволяет стандартизировать модель для сравнения различных условий, что неприменимо при использовании свежих первичных ворсинчатых тканей. Тем не менее, любой из компонентов клеточной линии может быть заменен первичной культурой для валидации. Объединяя клетки и ткани, полученные от интересующих пациентов, предлагаемая модель может облегчить демонстрацию и моделирование различных заболеваний, которые, как известно, способствуют бесплодию и невынашиванию беременности.

Критические шаги
Во-первых, плотность клеток Исикавы для ко-культивирования должна быть ограничена, примерно 60%-70% конфлюенции. Во-вторых, покровная крышка с ячейками должна быть опущена. В-третьих, концентрация ВКМ должна быть менее 3 мг/мл во избежание образования геля. В-четвертых, уровень жидкости среды в системе совместного культивирования должен покрывать покровное стекло.

Ограничения
Упомянутая выше модель включает в себя эпителиальные клетки эндометрия и стромальные клетки; Одним из ограничений исследования было использование клеток аденокарциномы Исикавы в качестве суррогатов эпителиальных клеток вместо первичных клеток. Интеграция первичных эпителиальных и стромальных клеток одной и той же пациентки будет воспроизводить физиологические условия эндометрия человека. Для некоторых экспериментальных применений возможное ограничение связано с отсутствием других типов клеток, таких как эндотелиальные клетки и иммунные клетки, и в этой модели отсутствует характеристика структуры железы для оценки интерактивного влияния эндометриальных желез на другие типы клеток эндометрия. Однако в физиологических условиях эпителиальные клетки проявляют полярность, и этот характер вряд ли моделируется in vitro без просветной среды матки. Стромальные клетки эндометрия находятся под децидуальным процессом в менструальном цикле ^16,17. Однако молекулярный механизм децидуализации остается неясным. Несколько факторов, включая иммуноциты и эндотелиальные клетки, могут играть роль в децидуализации. Эта модель предоставляет ограниченный способ изучения непрямых перекрестных помех между стромальными и эпителиальными клетками во время децидуального процесса. Кроме того, уровни и роль биологических маркеров во время децидуализации до сих пор неясны, что требует дальнейшего изучения

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Мы хотим поблагодарить всех участников, участвующих в этом исследовании. Мы также высоко ценим помощь в области визуализации со стороны компании Light Innovation Technology Ltd, Шэньчжэнь. Данное исследование было поддержано Фондом естественных наук Китая (грант No 82201851), Шэньчжэньской научно-технической программой (грант No. JCYJ20210324141403009, RCYX20210609104608036), Шэньчжэньский фонд строительства ключевых медицинских дисциплин (грант No. SZXK028) и Шэньчжэньской женской и детской больнице Баоань (грант No. БАФИ 2023003).