2種類の接着細胞株を用いた共培養モデル

このプロトコルは、3次元(3D)プリントされた足場を使用して2種類の接着細胞株の生物学を再現できる新しい in vitro 実験モデルを示しています。このモデルの構築と、細胞調製と細胞培養から分析と評価までの操作手順について説明します。

胚着床は、母体-胚界面における異なる細胞タイプ間の相互作用の影響を受けます。脱落膜内のさまざまな細胞タイプ間の直接的および間接的なコミュニケーションは、子宮内膜の受容性を調節するために重要です。しかし、この相互作用を媒介する分子メカニズムはまだ不明です。この点で、子宮内膜上皮と間質の相互作用の生物学を再現できる包括的な in vitro モデルを確立するためには、移植プロセスを研究するためのモデルが必要です。このモデルは、通常の細胞培養プレートと、低コストの材料から3次元(3D)プリンティングによって生成されたマッチングスキャフォールドで構成されています。ここでは、モデル構築、細胞調製、細胞播種、細胞培養、観察、評価のための一連のプロトコルについて詳しく説明します。さらに、顕微鏡下で良好な増殖条件を示す細胞の代表的な結果を含めました。この研究は、子宮内膜間質細胞と上皮細胞間質細胞間、および栄養膜細胞と子宮内膜細胞との間の相互作用を模倣する in vitro モデルの開発を目的としています。

ヒトの妊娠に関する広範な研究にもかかわらず、着床および妊娠初期の母体と胎児の界面における分子メカニズムは、まだ十分に理解されていない^{ままです1}。ヒトの子宮内膜は、主に子宮内膜上皮細胞(EEC)と子宮内膜間質細胞(ESC)の2種類の細胞で構成されています。着床は、同位、付着、浸潤の3つの段階を経て進行し、有能な胚と受容性子宮内膜²の発生につながります。ヒトを対象とした in vivo 研究の倫理的制約、および動物におけるヒトの状態を完全にシミュレートすることの難しさを考慮すると、 in vitro ヒト子宮内膜培養モデルの構築は、着床および妊娠^{初期のプロセスを再現}する効果的な手段となっている3。これらのモデルは、正常妊娠と病理妊娠の両方を調査する上で価値があり、トランスレーショナルメディシンにおける治療的介入の予備試験と検証のための基盤となるプラットフォームを提供します。

市販のチャンバーは、細胞生物学の研究に広く利用されています。これらのチャンバーは、細胞遊走と異なるタイプの細胞間のクロストークに関する貴重な洞察を提供します。ただし、市販のチャンバーは通常、使い捨てであり、費用がかかる可能性があります⁴。

子宮内膜と胚盤胞、または胚盤胞の代理からなる多数のin vitroヒト培養モデルが開発され、着床の詳細なプロセスをよりよく理解しています。しかし、これらのモデルは、3D構造が非常に複雑な実験設定であり、特定の分化媒体が高価であるため、まだ適用の初期段階にあります^5,6,7。

手頃な価格の3Dプリンティングハードウェアを使用し、製造期間が比較的短いため、さまざまな実験目的をターゲットにした構造を適合させることができます。3Dプリンティング技術は、時間コストを削減し、複雑でカスタマイズされた構造の作成を可能にします。このテクノロジーは、プロトタイプの設計と反復を大幅に加速し、さまざまな分野の研究者にとって貴重なツールとなり、より効率的に作業を完了することができます^8,9,10。

ここでは、3D構造の構築と細胞培養システムとしての使用のための実行可能で経済的な実験プロトコルを提示します。これにより、胚移植中の子宮内膜受容性を調査するための子宮内膜間質細胞と上皮細胞の間の相互作用をシミュレートできます。これにより、市販の使い捨て材料に代わるカスタマイズ可能で低コストの代替品が提供されます。

注:このプロトコルで使用されるすべての試薬は、 材料の表に記載されています。特に指定のない限り、すべての培地は使用前に 37 °C に事前に平衡化しました。

足場の印刷や模型製作1. 3D

注:ここでの手順は、商用3D金属印刷機のマニュアルブックに従って実行されました。以下に、手順を簡単に説明します(補足ファイル1)。

1. プリントベッドレベリング
   1. ダッシュボードの メニュー アイコンをタップし、[ユーティリティ]に移動します。 ベッドレベル を選択して、レベリングルーチンを開始します。
   2. プリントベッドからプリントシートを取り出し、[ 完了]を選択します。プリントベッドは、レベリングの準備として最大の高さまで上昇します。プログレスバーが100%に達したら 、[開始]を押します。
   3. Metal Xプリンタが以前に水平調整されていない場合は、[ リセット]を選択します。その場合は、[ スキップ] を選択し、ステップ 1.1.5 (16 ポイントスキャン) に直接進みます。
   4. 2.5 mmの六角レンチを使用して、すべての3ベッドレベリングネジを時計回りに締めるまで回します。次に、反時計回りに2回転させて緩め、中間点の高さに設定します。 続行するには、[完了] を押します。
   5. プリンターは、指定された16か所でベッドをスキャンします。この間、ベッドやフレームに触れないでください。進行状況が 100% に達したら、[ 次へ] を押します。
2. 印刷シートアプリケーション
   1. 残っている金属やサポートの破片をすべて取り除きます。バキュームスライダーを オンに切り替えます。
   2. ベッドを下げて温めてから、 次へを押します。印刷シートをバキュームグリッドの上に置き、 次へを押します。
   3. シートプレスをプリントシートの上に置き、チャンバー後部のZレールに合わせます。
   4. バキュームがかみ合うのを待ち、安定したシールを作成します。バキュームがかみ合ったら、 Doneを押します。
3. 金属フィラメントのローディング
   1. プリントヘッドを印刷領域の中央に手動で配置します。プリントヘッドカバーを上にスライドさせて取り付けネジから外して取り外します。
   2. オプションボードの メニュー アイコンをタップします。オプションから [マテリアル ]を選択します。
   3. [Load Metal] を選択して、ロード ルーチンを開始します。[Quick Load] を選択します。
   4. ロードする金属材料の特定のタイプを選択します(例:アルミニウム6061-T6 | 3.3211 | 65028 |AlMg1SiCu)です。
   5. スプールをホルダーに置き、 次へを押します。ドアを閉じてスプールが温まるのを待ってから、[ 次へ]を押します。
   6. エクストルーダーが材料を引き抜き始めるまで、プリントヘッド(Mとラベル付け)の前面インレットに材料を挿入します。
4. 金属部品印刷
   1. 印刷設定パネルで、「 Export Build」をクリックします。FAT32にフォーマットされたUSBドライブにファイルを保存し、プリンターに挿入します。
   2. ボード上の メニュー アイコンを選択します。[ストレージ]に移動し、[ ストレージから印刷]を選択します。印刷を開始するパーツファイルを選択します。
5. 金属部品の除去
   1. プリントシートとプリントパーツをプリントベッドから慎重にスライドさせます。プリントシートからパーツをそっと取り外します。柔軟なシートは簡単に剥がれるはずです。

2. 3Dモデルでの細胞共培養の準備

注:細胞培養実験で使用するたびにオートクレーブ滅菌を容易にするために、3Dプリントの細胞カバースリップ足場サポートの消耗品として高温耐性材料を使用することをお勧めします。この研究では、不死化ヒト子宮内膜間質細胞(HESC)とヒト子宮内膜上皮細胞(石川)を使用しました。これらの細胞株の特性評価は以前に報告されています^5,6。

1. 細胞培養と継代
   1. DMEM/F12培地 + 2 mM L-グルタミン + 10% 炭除去ウシ胎児血清 (FBS) + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加して、hESC 用の 50 mL の相補培地を調製します。
   2. 石川用培地50mLにダルベッコ改変イーグル培地+10%FBS+1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を加えて調製します。
   3. 細胞の解凍
      注:購入した細胞株は、凍結した状態でドライアイスで出荷されました。液体窒素の気相または-130°C未満で保存する必要があります。
      1. 必要なすべての滅菌機器と解離酵素を準備し、補体培地を37°Cに温めます。
      2. 細胞を37°Cの水浴で急速に解凍し、時折穏やかに揺らします。細胞懸濁液を5 mLの基礎培地を含むチューブに移し、200 x g で5分間遠心分離します。
      3. 上清を慎重に取り除きます。調製した5 mLの完全培地に細胞ペレットを再懸濁し、2つのT25培養フラスコに分注します。インキュベーター内で細胞を37°Cおよび5%CO₂で培養します。
2. カバースリップによる細胞の調製
   1. 細胞培養の表面として18mm角のカバースリップを使用します。カバースリップが清潔で滅菌されていることを確認してください。
   2. 12ウェルプレートの底部にカバーガラスを200 μLの細胞外マトリックス(ECM)を200〜300 μg/mLの濃度でコーティングします。プレートを37°Cに1時間保ちます。
   3. ECMをプレートから取り外します。細胞の適切なコンフルエンシーを検査し、両方の細胞株の密度が約70%〜80%であることを確認します
   4. 使用済みの培地を取り出し、3 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回洗浄します。
   5. 解離酵素2mLを加え、細胞を37°Cで2分間培養して細胞を剥離させます。
   6. 完全培地で中和し、ピペッティングで上下させて単一細胞懸濁液を作製します。
   7. 細胞懸濁液100μLを取って、トリパンブルー(希釈係数=2)と混合します。
   8. カバースリップを血球計算盤のチャンバー上にスライドさせます。両側のチャンバーにトリパンブルーを含む細胞懸濁液を充填します。
   9. 20倍顕微鏡で両側の正方形の細胞の数を数え、細胞の密度を計算します。
   10. 細胞を新鮮な培地で調製したプレートに移し、5% CO₂で37°Cでインキュベートします。hESCを1 x 10⁵ 細胞/mLでウェルに播種し、24時間。
   11. 石川細胞株の場合は、翌日、カバースリップなしで細胞をウェルに播種します。

3. 共培養モデルの組み立て

1. 足場をエチルアルコールと二重蒸留水(ddw)に2日間完全に浸します。足場をオートクレーブで121°Cで滅菌し、乾燥させます。
2. 石川細胞株用の相補培地を約2 mLのウェル培養石川に加え、液面がカバーガラスを覆うようにします。
3. hESC付きのカバースリップカバーを足場に移し、セルを下にして面を保ちます。足場をよく養殖する石川に差し込みます。2セット目は、石川製のカバースリップカバーを足場に移し、足場をよく培養したhESCに差し込むことで、この配置を逆転させます。足場のない細胞は、独立して増殖する細胞増殖解析に使用します。
4. 共培養システムを37°C、5%CO₂でインキュベートします。共培養期間は実験デザインによって異なりますが、通常は24〜72時間の範囲です。

4. 画像取得

1. 培地を慎重に取り出し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかにすすいでください。
2. 細胞が付着したカバースリップを培養皿から細い鉗子またはピンセットで取り除きます。必要に応じて、PBSを使用した新しい皿にカバースリップを置き、転写中の乾燥を防ぎます。
3. きれいな顕微鏡スライドを取り、PBSを一滴垂らします。細胞を含むカバーガラスを封入剤の滴上に静かに移し、細胞がスライド上に下向きになるようにします。
4. 準備したスライドを倒立顕微鏡のステージに置きます。適切な対物レンズ(10倍、20倍など)を選択し、粗いフォーカスノブと細かいフォーカスノブを使用してフォーカスを調整します。
5. 照明強度やカメラ設定などの顕微鏡パラメータを設定します。顕微鏡ソフトウェアを使用して、目的の倍率と視野で細胞の画像をキャプチャします。露光時間やその他の画像設定を調整して、画質を最適化します。

5. 画像処理

1. [開く] をクリックして画像を開き、[処理] > [フィルター] > [エンハンスメント] の順にクリック> [ローカル イコライゼーション] を選択し、[適用] をクリックします。
2. 「編集」をクリックして>「グレースケール 8 に変換」>をクリックします。「拡張」をクリックし、「コントラストを適用」を選択します。
3. [ Count and measure subjects] をクリックします。 [手動] をクリックし、範囲を選択し、ヒストグラムを調整して、すべてのセルがカバーされるようにします。
4. 「 マスクの適用」をクリックし、現在のウィンドウを閉じ、「 自動明るいオブジェクト」をクリックして、「測定>自動ブライトオブジェクト 」、「 測定を選択」をクリックし、「 Aera」、「Dendric」、「Density」、および「Size」を選択します。
5. 「自動ブライトオブジェクト」をクリックし、「カウント」をクリックします。「データのエクスポート」をクリックして、測定データをスプレッドシートにエクスポートします。

6.細胞回収

1. 顕微鏡スライドからカバースリップを取り外し、清潔で乾燥したウェルに移します。
2. 石川細胞をトランスクリプトーム用のRNA単離試薬、またはプロテオミクス研究用のRipa溶解試薬で回収します。
   注:hESCの場合、免疫染色後の画像キャプチャには、カバースリップ培養法がより効果的でした。あるいは、RNA単離試薬またはRipa溶解試薬でhESCを回収することもできます。カバーガラスまたはプレートの表面で培養された細胞株を交換することができました。ただし、イメージング解析用に調製した細胞は、カバーガラス上に播種することをお勧めします。

図1は、このプロセスで使用される細胞スライド用の自家製足場を示しており、標準的な12ウェル細胞培養プレートに取り付けるための上部サポートリングと、4つのL字型ロッド状構造を特徴とする基底細胞スライドホルダーで構成されています。

図2によれば、共培養条件(図2A、B)における両細胞型の密度は、共培養の72時間後も低いままであった。しかし、独立して培養した両方の細胞タイプの密度は有意に増加しました(図2C、D)。また、共培養したhESCは、独立して培養したhESCに比べて長さが短かった(図2E-G)。

石川細胞とhESC細胞のプロファイルは、2種類の細胞間に相互作用が存在することを示しています。同時に、このシステムにより、免疫化学染色やウェスタンブロットなど、別々の細胞株でのフォローアップ実験を継続することができます。

図1:実験プロトコルで利用された3Dプリントされたカバースリップ足場(A)モノフォームの足場。(B)バイナリ形式のスキャフォールド。(C)足場上のカバースリップの配置を示すイラスト。(D)標準的な12ウェルプレートに足場を配置する様子を示す図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:hESC細胞株と石川細胞株を異なる条件で3日間処理したプロファイル。 (A)カバースリップに付着した石川種をhESCと足場(Bar=200μm)で共培養した。(B)カバースリップに付着したhESCシードを石川と足場で共培養。(C)石川細胞を10%FBSの相補培地で培養した。(D)hESC細胞を10%FBSの相補培地で培養した。(E)共培養条件下でのhESCの細胞密度は、独立培養条件下での細胞密度よりも有意に低い。(F)共培養条件下でのISHIKAWA細胞の細胞密度は、独立した培養条件下での細胞密度よりも有意に低い。(G)共培養条件下でのhESCの長さは有意に短い。N=3;、p<0.05の場合、エラーバーは標準誤差を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:3Dプリントコーディングファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

簡略化された費用対効果の高いプロトコールが、子宮内膜の間質細胞および上皮細胞の間接的共培養について説明されています。この方法では、標準的な12ウェル細胞培養プレートに取り付けるための上部サポートリングと、4つのL字型ロッド状構造を特徴とする基底細胞スライドホルダーを備えたセルスライドホルダーを備えた、セルスライド用の自家製足場を利用しています。このセットアップにより、子宮内膜細胞と上皮細胞の分離が促進され、培養培地中のシグナル伝達分子の交換を通じてそれらの相互作用が可能になります。このアプローチの主要な利点の一つは、市販の共培養システム¹¹と比較して、時間と支出の両方が大幅に削減されることである。自家製の足場は、すぐに入手できる材料で作られているため、セットアップのコストが大幅に削減されます。さらに、その設計は簡単で、研究者は足場を簡単に組み立てたり分解したりできるため、実験室での時間と労力を節約できます。さらに、自家製の足場は、複数の用途で洗浄および滅菌できるため、継続的な研究のための持続可能で経済的なオプションになります。この機能は、一貫性のある信頼性の高い結果が重要な長期研究に特に有益です。

子宮内膜間質細胞と上皮細胞は、胚の着床を成功させる上で極めて重要な役割を果たします。生理学的条件下では、子宮内膜の上皮細胞と子宮内膜の間質細胞は通常、直接接触しません。ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化に関する研究は、上皮細胞がパラクリンによる脱落膜プロセスに影響を与えることを証明しました。上皮細胞と間質細胞が近接しているため、パラクリンシグナル伝達による効果的なコミュニケーションが可能になります¹²。この相互作用は、着床の準備や、着床が起こらない場合のその後の組織の脱落など、子宮内膜の周期的な変化を調整するために不可欠です¹¹。上皮細胞と間質細胞はどちらもエストロゲンとプロゲステロンの受容体を発現し、増殖、分化、分泌活性を調節します。上皮-間質クロストークは、これらの応答が適切に調整されていることを確実にします¹³。したがって、これらの細胞間の複雑なクロストークは、子宮内膜の受容性と胚の着床の根底にある複雑なプロセスを理解することが不可欠であるため、依然として重要な研究領域である¹⁴。生殖生物学の著しい進歩にもかかわらず、着床中のこれらの細胞タイプ間のコミュニケーションの詳細なメカニズムはまだ完全には解明されていません¹⁵。

足場は、2種類の接着細胞の共培養を達成するための便利な方法を提供します。しかし、長期の共培養の過程で、カバースリップ細胞は時間の経過とともに増殖および更新され続け、死んだ細胞は落下して下層細胞と接触し、下層細胞に影響を与える可能性があります。さらに、カバーガラス上の細胞シードは、足場に伏せて置かれます。重力が細胞の状態に影響を与えるかどうかは不明です。本研究では、hESCとIshikawaの2つの細胞株をデモンストレーションに用いました。この足場は、2種類の接着細胞株の共培養に広く使用できます。また、この足場は、他の化合物や医薬品の離型媒体のプラットフォームとして、また、発光、加熱、電極デバイスなどの各種デバイスの実装プラットフォームとしても使用できます。

ここでは、胚-母体子宮細胞相互作用の分子メカニズムをさらに研究するための有用で便利なツールである、特異的な足場を利用した信頼性と堅牢性に優れた in vitro 細胞培養システムを紹介します。さらに、確立された足場の実現可能性を、胚盤胞/栄養膜研究のモデルとして特徴付けました。このプロトコルにより、3Dプリンティングによる適切な足場の構築と、少量(12ウェルプレート)の移動または侵入プラットフォームの3D構造としての役割を果たすことができ、イメージング定量化システムを使用してさまざまな要因を評価できます。

細胞株を使用すると、モデルの標準化により、新鮮な初代絨毛組織では適用できないさまざまな条件を比較できます。ただし、細胞株の成分はいずれも、検証のために初代培養物に置き換えることができます。提案されたモデルは、関心のある患者に由来する細胞および組織を組み込むことにより、不妊症および妊娠失敗に寄与することが知られているさまざまな疾患の実証およびモデリングを容易にする可能性がある。

重要なステップ
まず、共培養用の石川細胞の密度は、約60%〜70%の密度に制限する必要があります。次に、セル付きのカバースリップカバーを下げておく必要があります。第三に、ゲルの形成を避けるために、ECMの濃度は3 mg / mL未満である必要があります。第四に、共培養システム内の培地の液面がカバーガラスを覆う必要があります。

制限
上記のモデルは、子宮内膜上皮細胞と間質細胞で構成されています。この研究の1つの制限は、初代細胞の代わりに上皮細胞の代理として腺癌石川細胞を使用することでした。同じ患者の初代上皮細胞と間質細胞を統合すると、ヒト子宮内膜の生理学的状態が再現されます。一部の実験的アプリケーションでは、内皮細胞や免疫細胞などの他の細胞タイプが存在しないことに制限が生じる可能性があり、このモデルでは、他の子宮内膜細胞タイプに対する子宮内膜の相互作用の影響を評価するための腺構造の特性評価はありません。しかし、生理学的条件下では、上皮細胞は極性を示し、この特性は子宮管腔環境なしではin vitro条件をほとんどシミュレートしません。子宮内膜間質細胞は、月経周期^16,17の脱落膜過程にあります。しかし、脱落膜化の分子メカニズムは不明のままです。免疫細胞や内皮細胞など、いくつかの因子が脱落膜化に関与している可能性があります。このモデルは、脱落膜プロセス中の間質細胞と上皮細胞の間の間接的なクロストークを調べるための限られた方法を提供します。さらに、脱落膜化中の生物学的マーカーのレベルと役割はまだ不明であり、さらなる調査が必要です

著者は、利益相反がないことを宣言します。

この研究に関わったすべての被験者に感謝したいと思います。また、深センのLight Innovation Technology Ltdによるイメージング支援にも感謝しています。本研究は、中国自然科学基金(助成第82201851号)、深セン科学技術プログラム(助成第1号)の支援を受けて行われました。JCYJ20210324141403009、RCYX20210609104608036)、深セン重点医療規律建設基金(助成金番号。SZXK028)、および深セン宝安女性小児病院(助成金番号。BAFYの2023003)。