نموذج الزراعة المشتركة باستخدام نوعين من خطوط الخلايا الملتصقة

يظهر البروتوكول نموذجا تجريبيا جديدا في المختبر يمكنه تلخيص بيولوجيا نوعين من خطوط الخلايا الملتصقة بسقالة مطبوعة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). يتم وصف بناء هذا النموذج وإجراءات التشغيل ، من تحضير الخلايا وزراعة الخلايا إلى التحليل والتقييم.

يتأثر زرع الجنين بالتفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة في واجهة الأم والجنين. الاتصالات المباشرة وغير المباشرة بين أنواع الخلايا المختلفة داخل الترس ضرورية لتنظيم تقبل بطانة الرحم. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي تتوسط هذا التفاعل لا تزال غير واضحة. في هذا الصدد ، هناك حاجة إلى نموذج لدراسة عملية الزرع لإنشاء نموذج شامل في المختبر يمكنه تلخيص بيولوجيا تفاعل ظهارة بطانة الرحم والسدى يتكون هذا النموذج من ألواح زراعة الخلايا العادية وسقالة مطابقة ، والتي يتم إنشاؤها عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد (3D) من مواد منخفضة التكلفة. هنا ، نقوم بتفصيل مجموعة من البروتوكولات لبناء النموذج ، وإعداد الخلايا ، وبذر الخلايا ، وزراعة الخلايا ، والمراقبة ، والتقييم. علاوة على ذلك ، قمنا بتضمين نتائج تمثيلية مع الخلايا التي تظهر ظروف نمو جيدة تحت المجهر. تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نماذج في المختبر من شأنها أن تحاكي التفاعل بين الخلايا اللحمية بطانة الرحم والخلايا الظهارية ، وكذلك بين خلايا الأرومة الغاذية وخلايا بطانة الرحم.

على الرغم من الأبحاث المكثفة حول الحمل البشري ، إلا أن الآليات الجزيئية في الواجهة بين الأم والجنين أثناء الزرع والحمل المبكر لا تزال غير مفهومة جيدا¹. يتكون بطانة الرحم البشرية بشكل أساسي من نوعين من الخلايا: الخلايا الظهارية بطانة الرحم (EECs) والخلايا اللحمية بطانة الرحم (ESCs). يتقدم الزرع عبر ثلاث مراحل: التثبيت ، والتعلق ، والغزو ، مما يؤدي إلى تطوير جنين كفء وبطانة الرحم المستقبلية². بالنظر إلى القيود الأخلاقية للدراسات في الجسم الحي على البشر ، بالإضافة إلى الصعوبات في محاكاة الحالة البشرية في تماما ، أصبح بناء نماذج زراعة بطانة الرحم البشرية في المختبر وسيلة فعالة لتكرار عمليات الزرع والحمل المبكر³. هذه النماذج ذات قيمة في التحقيق في كل من حالات الحمل الطبيعية والمرضية وتوفر منصة تأسيسية للاختبار الأولي والتحقق من صحة التدخلات العلاجية في الطب الانتقالي.

تم استخدام الغرف التجارية على نطاق واسع في البحوث البيولوجية الخلوية. تقدم هذه الغرف رؤى قيمة حول هجرة الخلايا والحديث المتبادل بين أنواع مختلفة من الخلايا. ومع ذلك ، عادة ما تكون الغرف التجارية ذات استخدام واحد ويمكن أن تكون^{مكلفة 4}.

تم تطوير عدد كبير من نماذج الثقافة البشرية في المختبر التي تتكون من بطانة الرحم والكيسة الأريمية ، أو بدائل الكيسة الأريمية ، لفهم عملية الزرع التفصيلية بشكل أفضل. ومع ذلك ، لا تزال هذه النماذج في مرحلتها الأولى من التطبيق نظرا لأن الهيكل ثلاثي الأبعاد عبارة عن إعداد تجريبي معقد للغاية ، وبعض وسائط التمايز المحددة باهظة الثمن^5،6،7.

يتيح استخدام أجهزة الطباعة ثلاثية الأبعاد ذات الأسعار المعقولة وفترة التصنيع القصيرة نسبيا ملاءمة الهياكل لاستهداف أغراض تجريبية مختلفة. تساعد تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد على تقليل تكاليف الوقت وتمكين إنشاء هياكل معقدة ومخصصة. تعمل هذه التقنية على تسريع تصميم النموذج الأولي وتكراره بشكل كبير ، مما يجعله أداة قيمة للباحثين في مختلف المجالات ، مما يسمح لهم بإكمال عملهم بشكل أكثر كفاءة^8،9،10.

هنا ، نقدم بروتوكولا تجريبيا مجديا واقتصاديا لبناء الهيكل ثلاثي الأبعاد واستخدامه كنظام لزراعة الخلايا ، والذي يمكنه محاكاة التفاعل بين الخلايا اللحمية والخلايا الظهارية في بطانة الرحم للتحقيق في تقبل بطانة الرحم أثناء زرع الجنين. يوفر هذا بديلا قابلا للتخصيص ومنخفض التكلفة للمواد التجارية التي تستخدم لمرة واحدة.

ملاحظة: يمكن العثور على جميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. ما لم ينص على خلاف ذلك ، تم موازنة جميع الوسائط مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

1. 3D الطباعة للسقالة وبناء النموذج

ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات هنا وفقا للكتاب اليدوي لآلة الطباعة المعدنية ثلاثية الأبعاد التجارية. الخطوات موصوفة بإيجاز أدناه (الملف التكميلي 1).

1. طباعة تسوية السرير
   1. اضغط على أيقونة القائمة على لوحة القيادة وانتقل إلى الأدوات المساعدة. حدد مستوى السرير لبدء روتين التسوية.
   2. قم بإزالة ورقة الطباعة من طبقة الطباعة وحدد تم. سيرتفع سرير الطباعة إلى أقصى ارتفاع له استعدادا للتسوية. بمجرد أن يصل شريط التقدم إلى 100٪، اضغط على ابدأ.
   3. إذا لم يتم تسوية طابعة Metal X مسبقا، فحدد إعادة تعيين. إذا كان الأمر كذلك ، فاختر تخطي وانتقل مباشرة إلى الخطوة 1.1.5 (المسح الضوئي المكون من 16 نقطة).
   4. استخدم مفتاحا سداسيا مقاس 2.5 مم لتدوير جميع براغي التسوية ذات الأسرة الثلاثة في اتجاه عقارب الساعة حتى تصبح مشدودة. بعد ذلك ، قم بفكها عن طريق تدوير عكس اتجاه عقارب الساعة دورتين كاملتين لضبطها على ارتفاع منتصف النقطة. اضغط على تم للمتابعة.
   5. ستقوم الطابعة بمسح السرير ضوئيا عند 16 نقطة محددة. الامتناع عن لمس السرير أو الإطار أثناء هذه العملية. بمجرد أن يصل التقدم إلى 100٪ ، اضغط على التالي.
2. تطبيق ورقة الطباعة
   1. قم بإزالة أي بقايا معدنية أو حطام دعم. قم بتبديل شريط تمرير الفراغ إلى تشغيل.
   2. اترك السرير ينخفض ويسخن ، ثم اضغط على التالي. ضع ورقة الطباعة فوق شبكة التفريغ واضغط على التالي.
   3. ضع مكبس الورقة فوق ورقة الطباعة، وقم بمحاذاة القضبان Z في الجزء الخلفي من الغرفة.
   4. انتظر حتى يتم تعشيق الفراغ وإنشاء ختم مستقر. بمجرد تعشيق المكنسة الكهربائية ، اضغط على تم.
3. تحميل خيوط معدنية
   1. ضع رأس الطباعة يدويا في منتصف منطقة الطباعة. قم بإزالة غطاء رأس الطباعة عن طريق تحريكه لأعلى وبعيدا عن مسامير التثبيت.
   2. اضغط على أيقونة القائمة على لوحة الخيارات. حدد المواد من الخيارات.
   3. اختر تحميل معدني لبدء روتين التحميل. اختر التحميل السريع.
   4. حدد النوع المحدد من المواد المعدنية المراد تحميلها (على سبيل المثال ، الألومنيوم 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
   5. ضع البكرة على الحامل واضغط على التالي. أغلق الباب واترك البكرات تسخن ، ثم اضغط على التالي.
   6. أدخل المادة في المدخل الأمامي لرأس الطباعة (المسمى M) حتى يبدأ الطارد في سحبها.
4. طباعة الأجزاء المعدنية
   1. في لوحة Printing Settings، انقر فوق Export Build. احفظ الملف على محرك أقراص USB مهيأ إلى FAT32 وأدخله في الطابعة.
   2. حدد أيقونة القائمة على اللوحة. انتقل إلى التخزين وحدد طباعة من التخزين. اختر ملف الجزء لبدء الطباعة.
5. إزالة الجزء المعدني
   1. حرك ورقة الطباعة والأجزاء المطبوعة بعناية من سرير الطباعة. افصل الأجزاء برفق عن ورقة الطباعة. يجب أن تتقشر الورقة المرنة بسهولة.

2. التحضير للزراعة المشتركة للخلية في النموذج ثلاثي الأبعاد

ملاحظة: يوصى باستخدام مواد مقاومة لدرجات الحرارة العالية كمواد استهلاكية لدعم سقالة غطاء خلية الطباعة ثلاثية الأبعاد لتسهيل تعقيم الأوتوكلاف قبل كل استخدام في تجارب زراعة الخلايا. تم استخدام الخلايا اللحمية بطانة الرحم البشرية الخالدة (HESC) والخلايا الظهارية لبطانة الرحم البشرية (إيشيكاوا) في هذه الدراسة. تم الإبلاغ سابقا عن توصيف خطوط الخلايا^{هذه 5,6}.

1. زراعة الخلايا والمرور
   1. تحضير 50 مل من الوسط التكميلي ل hESC عن طريق إضافة DMEM / F12 متوسط + 2 ملي لجلوتامين + 10٪ مصل بقري جنين مجريد من الفحم (FBS) + 1٪ محلول بنسلين / ستربتومايسين.
   2. قم بإعداد 50 مل من الوسط التكميلي لإيشيكاوا عن طريق إضافة Dulbecco's Modified Eagle Medium + 10٪ FBS + 1٪ محلول البنسلين / الستربتومايسين.
   3. ذوبان الخلايا
      ملاحظة: تم شحن خط الخلية الذي تم شراؤه على الثلج الجاف في حالة تجميد. يجب تخزينه في مرحلة بخار النيتروجين السائل أو أقل من -130 درجة مئوية.
      1. قم بإعداد جميع المعدات المعقمة اللازمة وإنزيم التفكك ، وقم بتسخين الوسط التكميلي إلى 37 درجة مئوية.
      2. قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع تأرجح لطيف من حين لآخر. انقل معلق الخلية إلى أنبوب يحتوي على 5 مل من وسط الاستزراع القاعدي وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
      3. قم بإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط الاستزراع الكامل المحضر وقم بتوزيعه في قارورتين للثقافة T25. استزراع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. تحضير الخلايا مع غطاء
   1. استخدم غطاء مربع 18 مم كسطح لثقافة الخلية ؛ تأكد من أن الغطاء نظيف ومعقم.
   2. قم بتغطية الغطاء في قاع صفيحة مكونة من 12 بئرا ب 200 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية (ECM) بتركيز 200-300 ميكروغرام / مل. احتفظ باللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   3. قم بإزالة ECM من اللوحة. افحص الخلايا بحثا عن التقاء مناسب ، وتأكد من أن كثافة كلا خطي الخلايا حوالي 70٪ -80٪
   4. قم بإزالة الوسط المستهلك واغسل الخلايا ب 3 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) 2x.
   5. أضف 2 مل من إنزيم التفكك وزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين لفصلها.
   6. قم بتحييد التركيب باستخدام وسط ثقافة كامل وإنشاء تعليق أحادي الخلية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
   7. خذ 100 ميكرولتر من تعليق الخلية واخلطه مع التريبان الأزرق (عامل التخفيف = 2).
   8. حرك الغطاء فوق حجرة مقياس كثافة الدم. املأ كلا الحجرتين الجانبيتين بتعليق الخلية الذي يحتوي على التريبان الأزرق.
   9. احسب عدد الخلايا في المربعات على كلا الجانبين تحت مجهر 20x واحسب كثافة الخلايا.
   10. انقل الخلايا إلى اللوحة المحضرة بوسط طازج واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. قم بزرع hESC في البئر عند 1 × 10⁵ خلايا / مل لمدة 24 ساعة.
   11. بالنسبة لخط خلية إيشيكاوا ، قم بزرع الخلية في البئر بدون غطاء في اليوم التالي.

3. تجميع نموذج الثقافة المشتركة

1. نقع السقالات مع الكحول الإيثيلي والماء المقطر المزدوج (ddw) جيدا لمدة يومين. عقم السقالات بالأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية وجففها.
2. أضف حوالي 2 مل من الوسط التكميلي لخط خلايا إيشيكاوا إلى زراعة البئر إيشيكاوا ، مما يضمن أن مستوى السائل يغطي الغطاء.
3. انقل غطاء الغطاء مع hESC على السقالة واحتفظ بالجانب مع الخلية لأسفل. قم بتوصيل السقالة في إيشيكاوا جيدة التزريع. بالنسبة للمجموعة الثانية ، اقلب هذا الترتيب عن طريق نقل غطاء الغطاء مع Ishikawa على السقالة وتوصيل السقالة ب hESC جيد التزريع. استخدم الخلايا بدون إعداد السقالة لتحليل نمو الخلايا المتنامي بشكل مستقل.
4. احتضان نظام الاستزراع المشترك عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. يمكن أن تختلف فترة الاستزراع المشترك اعتمادا على التصميم التجريبي ولكنها تتراوح عادة من 24-72 ساعة.

4. الحصول على الصور

1. قم بإزالة وسط المزرعة بعناية واشطف الخلايا برفق باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
2. قم بإزالة أغطية الخلايا المرفقة من أطباق الاستزراع باستخدام ملقط أو ملاقط دقيقة. اختياريا ، ضع أغطية في طبق جديد مع PBS لمنع الجفاف أثناء النقل.
3. خذ شريحة مجهرية نظيفة وضع قطرة من PBS. انقل الخلايا المحتوية على الغطاء برفق على قطرة وسط التثبيت ، مع التأكد من أن الخلايا متجهة لأسفل على الشريحة.
4. ضع الشريحة المعدة على مسرح المجهر المقلوب. حدد عدسة الهدف المناسبة (على سبيل المثال، 10x و20x) واضبط التركيز البؤري باستخدام مقابض التركيز البؤري الخشنة والدقيقة.
5. قم بتعيين معلمات المجهر مثل شدة الإضاءة وإعدادات الكاميرا. باستخدام برنامج المجهر ، التقط صورا للخلايا بالتكبير المطلوب ومجالات الرؤية. اضبط وقت التعرض وإعدادات التصوير الأخرى لتحسين جودة الصورة.

5. معالجة الصور

1. انقر فوق Open لفتح الصورة، وانقر فوق Process > Filters > Enhancement ل>اختيار المعادلة المحلية، وانقر فوق Apply.
2. انقر فوق تحرير > تحويل إلى > مقياس رمادي 8. انقر فوق تحسين ، واختر تطبيق التباين.
3. انقر فوق عدد وقياس الموضوعات. انقر فوق يدوي، وحدد نطاقا، واضبط الرسم البياني للتأكد من تغطية جميع الخلايا.
4. انقر فوق Apply Mask، وأغلق النافذة الحالية، وانقر على Automatic Bright Objects > Measure، وحدد Measurement، واختر Aera وDendric وDensity وSize.
5. انقر على "الكائنات الساطعة التلقائية"، ثم انقر على "العدد". انقر على تصدير البيانات لتصدير بيانات القياس إلى جدول بيانات.

6. حصاد الخلايا

1. قم بإزالة أغطية الغطاء من شريحة المجهر وانقلها إلى بئر نظيف وجاف.
2. حصاد خلية إيشيكاوا مع كاشف عزل الحمض النووي الريبي لكاشف تحلل النسخ أو ريبا للأبحاث البروتينية.
   ملاحظة: بالنسبة إلى hESC ، كانت طريقة ثقافة الغطاء أكثر فاعلية لالتقاط الصور بعد التلوين المناعي. بدلا من ذلك ، يمكن حصاد hESC باستخدام كاشف عزل الحمض النووي الريبي أو كاشف تحلل Ripa. يمكن تبادل خطوط الخلايا المزروعة على الغطاء أو سطح اللوحة ؛ ومع ذلك ، نوصي بزرع الخلايا المعدة لتحليل التصوير على الغطاء.

يوضح الشكل 1 السقالة محلية الصنع لشرائح الخلايا المستخدمة في هذه العملية ، والتي تشتمل على حلقة دعم علوية مصممة للربط بألواح زراعة الخلايا القياسية المكونة من 12 بئرا ، تكملها حامل منزلق خلية قاعدية يتميز بأربعة هياكل تشبه القضيب على شكل حرف L.

وفقا للشكل 2 ، ظلت كثافة كلا النوعين من الخلايا في حالة الزراعة المشتركة (الشكل 2 أ ، ب) منخفضة بعد 72 ساعة من الزراعة المشتركة ؛ ومع ذلك ، نمت كثافة كلا النوعين من الخلايا المزروعة بشكل مستقل بشكل كبير (الشكل 2 ج ، د). علاوة على ذلك ، كان طول hESC المزروع المشترك أقصر مقارنة ب hESC المزروع بشكل مستقل (الشكل 2E-G).

يشير ملف تعريف خلايا إيشيكاوا وخلايا hESC إلى وجود تفاعلات بين نوعي الخلايا. في الوقت نفسه ، يمكننا النظام من الاستمرار في إجراء تجارب المتابعة على خطوط الخلايا المنفصلة ، بما في ذلك تلطيخ الكيمياء المناعية واللطخة الغربية.

الشكل 1: سقالة غطاء مطبوعة ثلاثية الأبعاد مستخدمة في البروتوكول التجريبي. (أ) سقالة أحادية الشكل. (ب) سقالة في الشكل الثنائي. (ج) رسم توضيحي يوضح وضع الغطاء على السقالة. (د) رسم توضيحي يوضح وضع السقالة في صفيحة قياسية من 12 بئرا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: ملف تعريف خطوط خلايا hESC و Ishikawa التي تمت معالجتها لمدة 3 أيام بظروف مختلفة. (أ) بذرة إيشيكاوا على الغطاء مستزرعة بشكل مشترك مع hESC بواسطة سقالة (بار = 200 ميكرومتر). (ب) بذرة hESC على الغطاء مستزرعة بالاشتراك مع إيشيكاوا باستخدام سقالة. (ج) تمت زراعة خلايا إيشيكاوا في وسط تكميلي بنسبة 10٪ FBS. (د) تمت زراعة خلايا hESC في وسط تكميلي بنسبة 10٪ FBS. (ه) كثافة خلايا الخلايا في الخلايا الكهرماسية الكهرومغناطيسية في ظل ظروف الزراعة المشتركة أقل بكثير من تلك الموجودة في ظل ظروف الاستزراع المستقل. (و) كثافة خلايا إيشيكاوا في ظل ظروف الزراعة المشتركة أقل بكثير من تلك الموجودة في ظل ظروف الاستزراع المستقل. (ز) طول hESC في ظل ظروف الاستزراع المشترك أقصر بكثير. ن = 3 ؛ ، p<0.05 ، يظهر شريط الخطأ خطأ قياسيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي 1: ملف ترميز طباعة ثلاثية الأبعاد. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

يتم وصف بروتوكول مبسط وفعال من حيث التكلفة للزراعة المشتركة غير المباشرة للخلايا اللحمية والظهارية في بطانة الرحم. تستخدم هذه الطريقة سقالة محلية الصنع لشرائح الخلايا ، والتي تشتمل على حلقة دعم علوية مصممة للربط بألواح زراعة الخلايا القياسية المكونة من 12 بئرا ، تكملها حامل منزلق للخلية القاعدية يتميز بأربعة هياكل تشبه القضيب على شكل حرف L. يسهل هذا الإعداد فصل الخلايا اللحمية والظهارية في بطانة الرحم مع السماح بتفاعلها من خلال تبادل جزيئات الإشارات في وسط الاستزراع. وتتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذا النهج في الانخفاض الكبير في الوقت والنفقات مقارنة بنظم الاستزراع المشترك المتاحة^{تجاريا 11}. السقالة محلية الصنع مصنوعة من مواد متاحة بسهولة ، مما يقلل بشكل كبير من تكلفة الإعداد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تصميمه واضح ومباشر ، مما يمكن الباحثين من تجميع وتفكيك السقالة بسهولة ، وبالتالي توفير الوقت والجهد في المختبر. علاوة على ذلك ، يمكن تنظيف السقالة محلية الصنع وتعقيمها لاستخدامات متعددة ، مما يجعلها خيارا مستداما واقتصاديا للبحث المستمر. هذه الميزة مفيدة بشكل خاص للدراسات طويلة الأمد ، حيث تكون النتائج المتسقة والموثوقة حاسمة.

تلعب الخلايا اللحمية بطانة الرحم والخلايا الظهارية أدوارا محورية في تسهيل زرع الأجنة بنجاح. في ظل الظروف الفسيولوجية ، لا يكون للخلايا الظهارية بطانة الرحم والخلايا اللحمية في بطانة الرحم اتصال مباشر عادة. أثبتت الأبحاث التي أجريت على تدمير الخلايا اللحمية في بطانة الرحم البشرية أن الخلايا الظهارية تؤثر على العملية المتساقطة عن طريق الباراكرين. يسمح القرب الشديد من الخلايا الظهارية واللحمية بالاتصال الفعال من خلال إشارات paracrine¹². هذا التفاعل حيوي لتنسيق التغييرات الدورية في بطانة الرحم ، بما في ذلك التحضير للزرع وتساقط الأنسجة اللاحق في حالة عدم حدوث الزرع¹¹. تعبر كل من الخلايا الظهارية واللحمية عن مستقبلات هرمون الاستروجين والبروجسترون ، والتي تنظم تكاثرها وتمايزها وأنشطتها الإفرازية. يضمن الحديث الظهاري اللحمي أن تكون هذه الاستجابات منسقة جيدا¹³. وبالتالي ، يظل الحديث المتبادل المعقد بين هذه الخلايا مجالا مهما للتحقيق ، حيث أنه من الضروري فهم العمليات المعقدة التي تكمن وراء تقبل بطانة الرحم وزرع الجنين¹⁴. على الرغم من التقدم الكبير في علم الأحياء التناسلي ، إلا أن الآليات التفصيلية للاتصال بين هذه الأنواع من الخلايا أثناء الزرع لا تزال غير موضحة بشكل كامل¹⁵.

توفر السقالة طريقة ملائمة لتحقيق الزراعة المشتركة لنوعين من الخلايا الملتصقة. ومع ذلك ، في عملية الزراعة المشتركة طويلة المدى ، تستمر خلايا الغطاء في النمو والتجدد بمرور الوقت ، وستسقط الخلايا الميتة وتلامس مع خلايا الطبقة السفلية ، مما قد يؤثر على خلايا الطبقة السفلية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وضع بذور الخلايا الموجودة على الغطاء ووجهها لأسفل على السقالة. ما إذا كانت الجاذبية لها أي تأثير على حالة الخلايا غير معروفة. في هذا البحث ، تم استخدام خطين خلويتين ، hESC و Ishikawa ، للتوضيح. يمكن استخدام السقالة على نطاق واسع في الزراعة المشتركة لنوعين مختلفين من خطوط الخلايا الملتصقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام السقالة كمنصة للمركبات الأخرى أو وسائط إطلاق الأدوية وكمنصة تركيب لأجهزة مختلفة مثل أجهزة التلألؤ والتدفئة والقطب الكهربائي.

هنا ، نقدم نظاما موثوقا وقويا لزراعة الخلايا في المختبر باستخدام السقالة المحددة ، وهي أداة مفيدة ومريحة لدراسة الآلية الجزيئية لتفاعلات خلايا الرحم بين الجنين والأمهات بشكل أكبر. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتمييز جدوى السقالة القائمة كنموذج لدراسات الكيسة الأريمية / الأرومة الغاذية. يسمح هذا البروتوكول ببناء سقالات مناسبة عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد ووظيفتها كهيكل ثلاثي الأبعاد لمنصات الهجرة أو الغزو بأحجام صغيرة (ألواح ذات 12 بئرا) ، حيث يمكن تقييم العوامل المختلفة باستخدام أنظمة القياس الكمي للتصوير.

يسمح استخدام خطوط الخلايا بتوحيد النموذج لمقارنة الظروف المختلفة ، وهو أمر لا ينطبق باستخدام أنسجة الزغابات الأولية الطازجة. ومع ذلك ، يمكن استبدال أي من مكونات خط الخلية بالثقافة الأولية للتحقق من الصحة. من خلال دمج الخلايا والأنسجة المشتقة من المرضى المهتمين ، قد يسهل النموذج المقترح عرض ونمذجة الأمراض المختلفة التي من المعروف أنها تساهم في العقم وفشل الحمل.

الخطوات الحاسمة
أولا ، يجب أن تكون كثافة خلايا إيشيكاوا للزراعة المشتركة محدودة ، حوالي 60٪ -70٪ التقاء. ثانيا ، يجب إبقاء غطاء الغطاء مع الخلايا لأسفل. ثالثا ، يجب أن يكون تركيز ECM أقل من 3 مجم / مل لتجنب تكوين مادة هلامية. رابعا ، يجب أن يغطي مستوى السائل للوسط في نظام الزراعة المشتركة الغطاء.

القيود
يتكون النموذج المذكور أعلاه من الخلايا الظهارية بطانة الرحم والخلايا اللحمة. كان أحد قيود الدراسة هو استخدام خلايا إيشيكاوا الغدية كبدائل للخلايا الظهارية بدلا من الخلايا الأولية. إن دمج الخلايا الظهارية واللحمية الأولية من نفس المريض من شأنه تكرار الظروف الفسيولوجية لبطانة الرحم البشرية. بالنسبة لبعض التطبيقات التجريبية ، يتعلق القيد المحتمل بنقص أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية والخلايا المناعية ، ولا يوجد توصيف للبنية الغدية في هذا النموذج لتقييم التأثير التفاعلي للغدد البطانية الرحمية على أنواع خلايا بطانة الرحم الأخرى. ومع ذلك ، في ظل الظروف الفسيولوجية ، تكشف الخلايا الظهارية عن القطبية ، وهذه الشخصية بالكاد تحاكي الظروف المختبرية بدون بيئة لمعية الرحم. تخضع الخلايا اللحمية بطانة الرحم للعملية العشرية في الدورة الشهرية^16،17. ومع ذلك ، لا تزال الآلية الجزيئية للإزالة غير واضحة. يمكن أن تلعب عدة عوامل ، بما في ذلك الخلايا المناعية والخلايا البطانية ، دورا في إزالة الأصوات. يوفر هذا النموذج طريقة محدودة لفحص الحديث المتبادل غير المباشر بين الخلايا اللحمية والخلايا الظهارية أثناء العملية المتساقطة. علاوة على ذلك ، لا تزال مستويات وأدوار العلامات البيولوجية أثناء الترس غير واضحة ، مما يستدعي مزيدا من الاستكشاف

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

نريد أن نشكر جميع الموضوعات المشاركة في هذه الدراسة. كما نقدر المساعدة التصويرية من قبل Light Innovation Technology Ltd ، شنتشن. تم دعم هذه الدراسة من قبل تمويل العلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82201851) ، وبرنامج شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة. JCYJ20210324141403009 ، RCYX20210609104608036) ، صندوق بناء الانضباط الطبي الرئيسي في شنتشن (رقم المنحة. SZXK028) ، ومستشفى شنتشن باوان للنساء والأطفال (رقم المنحة. BAFY 2023003).