Modèle de co-culture utilisant deux types de lignées cellulaires adhérentes

Le protocole présente un nouveau modèle expérimental in vitro capable de récapituler la biologie de deux types de lignées cellulaires adhérentes avec un échafaudage imprimé en trois dimensions (3D). La construction de ce modèle et les procédures opératoires, de la préparation et de la culture cellulaires à l’analyse et à l’évaluation, sont décrites.

L’implantation de l’embryon est affectée par les interactions entre les différents types de cellules dans l’interface mère-embryon. Les communications directes et indirectes entre les différents types de cellules au sein de la décidue sont cruciales pour réguler la réceptivité de l’endomètre ; Cependant, les mécanismes moléculaires qui interviennent dans cette interaction ne sont pas encore clairs. À cet égard, un modèle d’étude du processus d’implantation est nécessaire pour établir un modèle in vitro complet capable de récapituler la biologie de l’interaction épithélium-stroma de l’endomètre. Ce modèle est composé de plaques de culture cellulaire régulières et d’un échafaudage correspondant, qui est généré par impression tridimensionnelle (3D) à partir de matériaux à faible coût. Ici, nous détaillons un ensemble de protocoles pour la construction de modèles, la préparation cellulaire, l’ensemencement cellulaire, la culture cellulaire, l’observation et l’évaluation. De plus, nous avons inclus des résultats représentatifs avec des cellules présentant de bonnes conditions de croissance au microscope. Cette étude visait à développer des modèles in vitro qui imiteraient l’interaction entre les cellules stromales de l’endomètre et les cellules épithéliales, ainsi qu’entre les cellules trophoblastiques et les cellules endométriales.

Malgré des recherches approfondies sur la grossesse humaine, les mécanismes moléculaires à l’interface mère-fœtus lors de l’implantation et au début de la grossesse restent mal compris¹. L’endomètre humain est principalement composé de deux types de cellules : les cellules épithéliales de l’endomètre (EEC) et les cellules stromales de l’endomètre (ESC). L’implantation progresse en trois étapes : l’apposition, l’attachement et l’invasion, qui conduisent au développement d’un embryon compétent et d’un endomètre^{réceptif 2}. Compte tenu des contraintes éthiques des études in vivo sur des sujets humains, ainsi que des difficultés à simuler complètement la condition humaine chez l’animal, la construction de modèles de culture d’endomètre humain in vitro est devenue un moyen efficace de reproduire les processus d’implantation et de grossesse^{précoce 3}. Ces modèles sont précieux pour l’étude des grossesses normales et pathologiques et fournissent une plate-forme fondamentale pour les essais préliminaires et la validation des interventions thérapeutiques en médecine translationnelle.

Les chambres commerciales ont été largement utilisées dans la recherche en biologie cellulaire. Ces chambres offrent des informations précieuses sur la migration cellulaire et l’interaction entre les différents types de cellules. Cependant, les chambres commerciales sont généralement à usage unique et peuvent être coûteuses⁴.

Un grand nombre de modèles de culture humaine in vitro composés d’endomètre et de blastocyste, ou de substituts de blastocyste, ont été développés pour mieux comprendre le processus détaillé d’implantation. Ces modèles, cependant, en sont encore à leur stade initial d’application car la structure 3D est un dispositif expérimental très compliqué, et certains supports de différenciation spécifiques sont coûteux ^5,6,7.

L’utilisation de matériel d’impression 3D abordable et une période de fabrication relativement courte permettent d’ajuster les structures pour cibler différentes fins expérimentales. Les techniques d’impression 3D permettent de réduire les coûts de temps et de créer des structures complexes et personnalisées. Cette technologie accélère considérablement la conception et l’itération des prototypes, ce qui en fait un outil précieux pour les chercheurs de divers domaines, leur permettant de mener à bien leur travail plus efficacement ^8,9,10.

Ici, nous présentons un protocole expérimental réalisable et économique pour la construction de la structure 3D et son utilisation comme système de culture cellulaire, qui peut simuler l’interaction entre les cellules stromales et épithéliales de l’endomètre pour l’étude de la réceptivité de l’endomètre lors de l’implantation de l’embryon. Il s’agit d’une alternative personnalisable et peu coûteuse aux matériaux jetables commerciaux.

REMARQUE : Tous les réactifs utilisés dans ce protocole se trouvent dans la Table des matériaux. Sauf indication contraire, tous les fluides ont été pré-équilibrés à 37 °C avant utilisation.

1. 3D’impression de l’échafaudage et de la construction du modèle

REMARQUE : Les étapes ici ont été effectuées conformément au manuel de la machine d’impression 3D métal commerciale. Les étapes sont brièvement décrites ci-dessous (Fichier supplémentaire 1).

1. Imprimer la mise à niveau du lit
   1. Appuyez sur l’icône Menu sur le tableau de bord et accédez à Utilitaires. Sélectionnez Niveau du lit pour lancer la routine de mise à niveau.
   2. Retirez la feuille d’impression du lit d’impression et sélectionnez Terminé. Le lit d’impression montera à sa hauteur maximale en préparation du nivellement. Une fois que la barre de progression atteint 100 %, appuyez sur Démarrer.
   3. Si l’imprimante Metal X n’a pas été mise à niveau auparavant, sélectionnez Réinitialiser. Si c’est le cas, choisissez Skip (Ignorer ) et passez directement à l’étape 1.1.5 (balayage en 16 points).
   4. À l’aide d’une clé hexagonale de 2,5 mm, tournez toutes les vis de nivellement à trois lits dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce qu’elles soient bien serrées. Ensuite, desserrez-les en tournant deux rotations complètes dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour les régler à une hauteur médiane. Appuyez sur Terminé pour continuer.
   5. L’imprimante scannera le lit à 16 points désignés. Évitez de toucher le lit ou le cadre pendant ce processus. Une fois que la progression atteint 100 %, appuyez sur Suivant.
2. Application de feuille d’impression
   1. Retirez tout débris de métal ou de support résiduel. Basculez le curseur Aspirateur sur Activé.
   2. Laissez le lit s’abaisser et se réchauffer, puis appuyez sur Suivant. Placez la feuille d’impression sur la grille d’aspiration et appuyez sur Suivant.
   3. Placez la presse à feuilles sur la feuille d’impression, en l’alignant avec les rails en Z à l’arrière de la chambre.
   4. Attendez que le vide s’engage et créez un joint stable. Une fois l’aspirateur engagé, appuyez sur Terminé.
3. Chargement des filaments métalliques
   1. Positionnez manuellement la tête d’impression au centre de la zone d’impression. Retirez le couvercle de la tête d’impression en le faisant glisser vers le haut et en le décollant des vis de montage.
   2. Appuyez sur l’icône Menu sur le tableau des options. Sélectionnez Matériaux dans les options.
   3. Choisissez Charger Metal pour démarrer la routine de chargement. Choisissez Chargement rapide.
   4. Sélectionnez le type spécifique de matériau métallique à charger (par exemple, aluminium 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
   5. Placez la bobine sur le support et appuyez sur Suivant. Fermez la porte et laissez les bobines se réchauffer, puis appuyez sur Suivant.
   6. Insérez le matériau dans l’entrée avant de la tête d’impression (étiquetée M) jusqu’à ce que l’extrudeur commence à l’aspirer.
4. Impression de pièces métalliques
   1. Dans le panneau Paramètres d’impression, cliquez sur Exporter le bâtiment. Enregistrez le fichier sur une clé USB formatée en FAT32 et insérez-le dans l’imprimante.
   2. Sélectionnez l’icône Menu sur le tableau. Accédez à Stockage et sélectionnez Imprimer à partir du stockage. Choisissez le fichier pièce pour commencer l’impression.
5. Enlèvement de pièces métalliques
   1. Faites glisser avec précaution la feuille d’impression et les pièces imprimées hors du lit d’impression. Détachez délicatement les pièces de la feuille d’impression. La feuille flexible doit se décoller facilement.

2. Préparation à la co-culture cellulaire dans le modèle 3D

REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des matériaux résistants aux hautes températures comme consommables pour l’impression 3D, des supports d’échafaudage de lamelles de cellule afin de faciliter la stérilisation en autoclave avant chaque utilisation dans des expériences de culture cellulaire. Des cellules stromales de l’endomètre humain immortalisées (HESC) et des cellules épithéliales de l’endomètre humain (Ishikawa) ont été utilisées dans cette étude. La caractérisation de ces lignées cellulaires a déjà été rapportée ^5,6.

1. Culture cellulaire et passage
   1. Préparez 50 ml de milieu complémentaire pour les CSEh en ajoutant du milieu DMEM/F12 + 2 mM de L-Glutamine + 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) décapé de charbon de bois + 1 % de solution de pénicilline/streptomycine.
   2. Préparez 50 ml de milieu complémentaire pour Ishikawa en ajoutant le milieu Eagle modifié de Dulbecco + 10 % de FBS + 1 % de solution de pénicilline/streptomycine.
   3. Décongélation cellulaire
      REMARQUE : La lignée cellulaire achetée a été expédiée sur de la glace sèche à l’état congelé. Il doit être stocké en phase vapeur d’azote liquide ou à une température inférieure à -130 °C.
      1. Préparez tout le matériel stérilisé et l’enzyme de dissociation nécessaires, et réchauffez le milieu complémentaire à 37 °C.
      2. Décongelez rapidement les cellules dans un bain d’eau à 37 °C avec un léger balancement occasionnel. Transvaser la suspension cellulaire dans un tube contenant 5 mL de milieu de culture basal et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
      3. Retirez délicatement le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu de culture complet préparé et la distribuer dans deux flacons de culture T25. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Préparation des cellules à l’aide d’une lamelle
   1. Utilisez une lamelle carrée de 18 mm comme surface de la culture cellulaire ; Assurez-vous que la lamelle est propre et stérile.
   2. Enduisez la lamelle au fond d’une plaque à 12 puits avec 200 μL de matrice extracellulaire (MEC) à une concentration de 200 à 300 μg/mL. Maintenez la plaque à 37 °C pendant 1 h.
   3. Retirez l’ECM de la plaque. Inspectez les cellules pour une confluence appropriée et assurez-vous que la densité des deux lignées cellulaires est d’environ 70 à 80 %
   4. Retirez le milieu épuisé et lavez les cellules avec 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 2x.
   5. Ajouter 2 mL d’enzyme de dissociation et cultiver les cellules à 37 °C pendant 2 min pour les détacher.
   6. Neutraliser avec un milieu de culture complet et créer une suspension unicellulaire en pipetant de haut en bas.
   7. Prélever 100 μL de suspension cellulaire et mélanger avec du bleu de trypan (facteur de dilution = 2).
   8. Faites glisser la lamelle sur la chambre de l’hémocytomètre. Remplissez les deux chambres latérales avec la suspension cellulaire contenant du bleu trypan.
   9. Comptez le nombre de cellules en carrés des deux côtés à l’aide d’un microscope 20x et calculez la densité des cellules.
   10. Transférez les cellules dans la plaque préparée avec un milieu frais et incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂. Semez dans le puits à raison de 1 x 10⁵ cellules/mL pendant 24 h.
   11. Pour la lignée cellulaire Ishikawa, ensemencez la cellule dans le puits sans lamelle le lendemain.

3. Montage du modèle de co-culture

1. Trempez soigneusement les échafaudages avec de l’alcool éthylique et de l’eau doublement distillée (ddw) pendant 2 jours. Stérilisez les échafaudages à l’aide d’un autoclave à 121 °C et séchez-les.
2. Ajouter environ 2 mL de milieu complémentaire pour la lignée cellulaire d’Ishikawa à l’Ishikawa en bonne culture, en s’assurant que le niveau de liquide recouvre la lamelle.
3. Transférez le couvercle avec hESC sur l’échafaudage et maintenez le côté avec la cellule vers le bas. Branchez l’échafaudage dans l’Ishikawa bien cultivé. Pour la deuxième série, inversez cette disposition en transférant la couverture de lamelle avec Ishikawa sur l’échafaudage et en branchant l’échafaudage dans le hESC de bonne culture. Utilisez les cellules sans la configuration d’échafaudage pour une analyse de croissance cellulaire en croissance indépendante.
4. Incuber le système de co-culture à 37 °C, 5 % CO₂. La période de co-culture peut varier en fonction de la conception expérimentale, mais elle varie généralement de 24 à 72 h.

4. Acquisition d’images

1. Retirez délicatement le milieu de culture et rincez doucement les cellules avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
2. Retirez les lamelles avec les cellules attachées des boîtes de culture à l’aide d’une pince fine ou d’une pince à épiler. En option, placez les lamelles dans un nouveau plat avec du PBS pour éviter le dessèchement pendant le transfert.
3. Prenez une lame de microscope propre et placez une goutte de PBS. Transférez doucement la lamelle contenant les cellules sur la goutte du support de montage, en vous assurant que les cellules sont orientées vers le bas sur la lame.
4. Placez la lame préparée sur la platine du microscope inversé. Sélectionnez l’objectif approprié (par exemple, 10x, 20x) et ajustez la mise au point à l’aide de boutons de mise au point grossiers et fins.
5. Réglez les paramètres du microscope tels que l’intensité de l’éclairage et les paramètres de la caméra. À l’aide du logiciel du microscope, capturez des images des cellules aux grossissements et aux champs de vision souhaités. Ajustez le temps d’exposition et d’autres paramètres d’imagerie pour optimiser la qualité de l’image.

5. Traitement d’image

1. Cliquez sur Ouvrir pour ouvrir l’image, cliquez sur Traiter > filtres > Amélioration afin > choisir Égalisation locale, puis cliquez sur Appliquer.
2. Cliquez sur Modifier > Convertir en > Échelle de gris 8. Cliquez sur Améliorer, choisissez Appliquer le contraste.
3. Cliquez sur Compter et mesurer les sujets. Cliquez sur Manuel, sélectionnez une plage et ajustez l’histogramme pour vous assurer que toutes les cellules sont couvertes.
4. Cliquez sur Appliquer un masque, fermez la fenêtre active, cliquez sur Objets lumineux automatiques > mesurer, sélectionnez Mesure, puis choisissez Aera, Dendric, Density et Size.
5. Cliquez sur Objets lumineux automatiques, puis sur Compter. Cliquez sur Exporter les données pour exporter les données de mesure dans une feuille de calcul.

6. Prélèvement cellulaire

1. Retirez les lamelles de la lame de microscope et transférez-les dans un puits propre et sec.
2. Récoltez la cellule d’Ishikawa avec le réactif d’isolement de l’ARN pour la recherche transcriptomique ou le réactif de lyse Ripa pour la recherche protéomique.
   REMARQUE : Pour les CSEh, la méthode de culture sur lamelles s’est avérée plus efficace pour la capture d’images après coloration immunitaire. Alternativement, la CSEh pourrait être récoltée avec un réactif d’isolement d’ARN ou un réactif de lyse Ripa. Les lignées cellulaires cultivées sur la lamelle ou à la surface de la plaque ont pu être échangées ; Cependant, nous recommandons que les cellules préparées pour l’analyse d’imagerie soient ensemencées sur la lamelle.

La figure 1 montre l’échafaudage fait maison pour les lames de cellules utilisé dans ce processus, qui comprend un anneau de support supérieur conçu pour être fixé à des plaques de culture cellulaire standard à 12 puits, complété par un support de lame de cellule basale doté de quatre structures en forme de tige en forme de L.

Selon la figure 2, la densité des deux types de cellules dans les conditions de co-culture (Figure 2A,B) est restée faible après 72 h de co-culture ; cependant, la densité des deux types de cellules cultivées indépendamment a augmenté de manière significative (Figure 2C,D). De plus, la durée des CSEh co-cultivées était plus courte que celle des CSEh cultivées indépendamment (Figure 2E-G).

Le profil des cellules d’Ishikawa et des cellules hESC indique l’existence d’interactions entre les deux types de cellules. En même temps, le système nous permet de continuer à effectuer des expériences de suivi sur les lignées cellulaires distinctes, y compris la coloration immunochimique et le western blot.

Figure 1 : Échafaudage à lamelles imprimé en 3D utilisé dans le protocole expérimental. (A) Échafaudage en monoforme. (B) Échafaudage sous forme binaire. (C) Illustration montrant l’emplacement de la lamelle sur l’échafaudage. (D) Illustration montrant l’emplacement d’un échafaudage dans une plaque standard à 12 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Profil des lignées cellulaires hESC et Ishikawa traitées pendant 3 jours avec différentes conditions. (A) La graine d’Ishikawa sur la lamelle co-cultivée avec l’hESC par échafaudage (Bar = 200 μm). (B) La graine de CSEh sur la lamelle de couverture co-cultivée avec Ishikawa à l’aide d’un échafaudage. (C) Les cellules d’Ishikawa ont été cultivées dans un milieu complémentaire avec 10 % de FBS. (D) Les cellules hESC ont été cultivées dans un milieu complémentaire avec 10 % de FBS. (E) La densité cellulaire des CSEh dans des conditions de co-culture est significativement inférieure à celle dans des conditions de culture indépendante. (F) La densité cellulaire des cellules ISHIKAWA dans des conditions de co-culture est significativement inférieure à celle dans des conditions de culture indépendante. (G) La durée des CSEh dans des conditions de co-culture est nettement plus courte. N = 3 ; , p<0.05, la barre d’erreur indique l’erreur type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Fichier de codage d’impression 3D. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Un protocole simplifié et rentable est décrit pour la co-culture indirecte de cellules stromales et épithéliales de l’endomètre. Cette méthode utilise un échafaudage fait maison pour les lames de cellules, qui comprend un anneau de support supérieur conçu pour la fixation à des plaques de culture cellulaire standard à 12 puits, complété par un support de lame de cellule basale doté de quatre structures en forme de tige en forme de L. Cette configuration facilite la séparation des cellules stromales et épithéliales de l’endomètre tout en permettant leur interaction par l’échange de molécules de signalisation dans le milieu de culture. L’un des principaux avantages de cette approche est la réduction substantielle du temps et des dépenses par rapport aux systèmes de coculture disponibles dans le commerce¹¹. L’échafaudage fait maison est construit à partir de matériaux facilement disponibles, ce qui réduit considérablement le coût de l’installation. De plus, sa conception est simple, ce qui permet aux chercheurs d’assembler et de démonter facilement l’échafaudage, ce qui permet d’économiser du temps et des efforts en laboratoire. De plus, l’échafaudage fait maison peut être nettoyé et stérilisé pour de multiples utilisations, ce qui en fait une option durable et économique pour la recherche en cours. Cette caractéristique est particulièrement bénéfique pour les études à long terme, où des résultats cohérents et fiables sont cruciaux.

Les cellules stromales de l’endomètre et les cellules épithéliales jouent un rôle central dans la réussite de l’implantation de l’embryon. Dans des conditions physiologiques, les cellules épithéliales de l’endomètre et les cellules stromales de l’endomètre n’ont généralement pas de contact direct. La recherche sur la décidualisation des cellules stromales de l’endomètre humain a prouvé que les cellules épithéliales influencent le processus décidual par la paracrine. La proximité des cellules épithéliales et stromales permet une communication efficace par le biais de la signalisation paracrine¹². Cette interaction est essentielle pour coordonner les changements cycliques de l’endomètre, y compris la préparation à l’implantation et l’élimination ultérieure des tissus si l’implantation ne se produit pas¹¹. Les cellules épithéliales et stromales expriment des récepteurs pour l’œstrogène et la progestérone, qui régulent leur prolifération, leur différenciation et leurs activités sécrétoires. La diaphonie épithéliale-stromale garantit que ces réponses sont bien coordonnées¹³. Ainsi, la diaphonie complexe entre ces cellules reste un domaine d’investigation critique, car il est essentiel de comprendre les processus complexes qui sous-tendent la réceptivité endométriale et l’implantation de l’embryon¹⁴. Malgré des progrès significatifs en biologie de la reproduction, les mécanismes détaillés de communication entre ces types de cellules lors de l’implantation ne sont pas encore entièrement élucidés¹⁵.

L’échafaudage offre un moyen pratique de réaliser la co-culture de deux types de cellules adhérentes. Cependant, dans le processus de co-culture à long terme, les cellules de lamelle continuent de croître et de se renouveler au fil du temps, et les cellules mortes tomberont et entreront en contact avec les cellules de la couche inférieure, ce qui peut avoir un impact sur les cellules de la couche inférieure. De plus, les cellules ensemencées sur la lamelle sont placées face vers le bas sur l’échafaudage. On ne sait pas si la gravité a un effet sur l’état des cellules. Dans cette recherche, deux lignées cellulaires, hESC et Ishikawa, ont été utilisées pour la démonstration. L’échafaudage peut être largement utilisé dans la co-culture de deux types différents de lignées cellulaires adhérentes. En outre, l’échafaudage peut également être utilisé comme plate-forme pour d’autres composés ou milieux de libération de médicaments et comme plate-forme de montage pour divers dispositifs tels que les dispositifs de luminescence, de chauffage et d’électrodes.

Ici, nous présentons un système de culture cellulaire in vitro fiable et robuste utilisant l’échafaudage spécifique, qui est un outil utile et pratique pour étudier davantage le mécanisme moléculaire des interactions entre les cellules utérines embryonnaires et maternelles. De plus, nous avons caractérisé la faisabilité de l’échafaudage établi comme modèle pour les études de blastocyste/trophoblaste. Ce protocole permet la construction d’échafaudages appropriés par impression 3D et leur fonction de structure 3D pour les plates-formes de migration ou d’invasion en petits volumes (plaques de 12 puits), où différents facteurs peuvent être évalués à l’aide de systèmes de quantification par imagerie.

L’utilisation de lignées cellulaires permet de standardiser le modèle pour comparer différentes conditions, ce qui n’est pas applicable avec des tissus primaires de villosités frais. Cependant, n’importe lequel des composants de la lignée cellulaire peut être remplacé par une culture primaire pour validation. En incorporant les cellules et les tissus dérivés de patients d’intérêt, le modèle proposé peut faciliter la démonstration et la modélisation de différentes maladies connues pour contribuer à l’infertilité et à l’échec de la grossesse.

Étapes critiques
Tout d’abord, la densité de cellules d’Ishikawa pour la co-culture devrait être limitée, environ 60 % à 70 % de confluence. Deuxièmement, le couvercle de lamelle avec les cellules doit être maintenu vers le bas. Troisièmement, la concentration de l’ECM doit être inférieure à 3 mg/mL pour éviter la formation d’un gel. Quatrièmement, le niveau de liquide du milieu dans le système de co-culture doit couvrir la lamelle.

Limitations
Le modèle mentionné ci-dessus comprend les cellules épithéliales de l’endomètre et les cellules stromales ; l’une des limites de l’étude était l’utilisation de cellules d’Ishikawa d’adénocarcinome comme substituts de cellules épithéliales au lieu de cellules primaires. L’intégration de cellules épithéliales et stromales primaires d’un même patient reproduirait les conditions physiologiques de l’endomètre humain. Pour certaines applications expérimentales, une limitation possible concerne l’absence d’autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales et les cellules immunitaires, et il n’y a pas de caractérisation de la structure glandulaire dans ce modèle pour évaluer l’impact interactif des glandes endométriales sur d’autres types de cellules endométriales. Cependant, dans des conditions physiologiques, les cellules épithéliales révèlent la polarité, et ce caractère simule à peine des conditions in vitro sans un environnement luminal utérin. Les cellules stromales de l’endomètre sont sous le processus décidual dans le cycle menstruel ^16,17. Cependant, le mécanisme moléculaire de la décidualisation reste incertain. Plusieurs facteurs, dont les immunocytes et les cellules endothéliales, pourraient jouer un rôle dans la décidualisation. Ce modèle fournit un moyen limité d’examiner la diaphonie indirecte entre les cellules stromales et épithéliales au cours du processus décidual. De plus, les niveaux et les rôles des marqueurs biologiques au cours de la décidualisation ne sont pas encore clairs, ce qui justifie une exploration plus approfondie

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Nous tenons à remercier tous les sujets impliqués dans cette étude. Nous apprécions également l’aide à l’imagerie de Light Innovation Technology Ltd, Shenzhen. Cette étude a été financée par Natural Science Funding of China (subvention n° 82201851), le programme de science et de technologie de Shenzhen (subvention n° . JCYJ20210324141403009, RCYX20210609104608036), Fonds de construction de la discipline médicale clé de Shenzhen (subvention n°. SZXK028) et l’hôpital pour femmes et enfants de Shenzhen Baoan (subvention n°. BAFY 2023003).