Токсикологический и экотоксикологический анализ на основе подвижности гемоцитов мидий (Mytilus galloprovincialis)

В статье предложен новый in vitro метод быстрой и чувствительной оценки токсичности и экотоксичности загрязняющих веществ, основанный на подвижности гемоцитов Mytilus galloprovincialis . Этот метод призван внести вклад в разработку более этичных и чувствительных токсикологических и экотоксикологических тестов на воздействие.

Гемоциты являются циркулирующими иммунокомпетентными клетками у двустворчатых моллюсков и играют ключевую роль в нескольких важных функциях клеточно-опосредованного врожденного иммунитета. На ранних стадиях иммунного ответа гемоциты активно мигрируют к месту заражения. Эта врожденная подвижность является фундаментальной характеристикой этих клеток. Он представляет собой ключевую клеточную функцию, которая объединяет множество процессов, таких как клеточная адгезия, клеточная сигнализация, динамика цитоскелета и изменения объема клеток. Таким образом, изменения в подвижности клеток после воздействия лекарств или загрязняющих веществ могут служить полезной токсикологической конечной точкой. Несмотря на фундаментальную роль подвижности клеток в клеточной физиологии, она слабо изучена с токсикологической точки зрения. В данной работе предлагается новый метод in vitro для быстрой и чувствительной оценки токсичности и экотоксичности загрязнителей, основанный на оценке подвижности гемоцитов Mytilus galloprovincialis. Мы разработали анализ подвижности клеток на гемоцитах, прилипших к дну 96-луночного полистирольного микропланшета. После воздействия возрастающих концентраций лекарств траектории и скорости клеток были количественно оценены путем отслеживания клеток с помощью покадровой микроскопии, что позволило нам измерить влияние на подвижность гемоцитов. В связи с простотой сбора гемоцитов у животных относительно неинвазивным способом, предложенный метод предлагает альтернативный тест для скрининга эффектов и механизмов действия загрязняющих веществ и лекарственных препаратов. Он соответствует критериям 3R (Замена, Сокращение и Уточнение), решая этические проблемы и способствуя сокращению количества позвоночных in vivo на животных.

Методы, основанные на воздействии, такие как биотесты in vitro и in vivo, представляют собой инновационные инструменты для обнаружения воздействия химических загрязнителей окружающей среды на живые организмы и для их использования в качестве инструментов мониторинга окружающей среды и оценки рисков 1,2,3,4. Они дополняют классический аналитический химический подход, преодолевая некоторые его ограничения. Например, методы, основанные на воздействии, могут оценить биодоступность загрязнителей, их влияние на здоровье организма и комбинированное токсикологическое воздействие смесей. Эти комбинированные эффекты могут быть непредсказуемы только на основе химического анализа⁵.

В последние годы экотоксикология загрязнителей, вызывающих новую озабоченность (новые загрязнители), представляет собой область, в которой методы, основанные на воздействии, могут быть полезными инструментами для обнаружения воздействия и оценки воздействия на биоту ^1,5,6,7. В некоторых методах, основанных на эффектах, двустворчатые моллюски используются в качестве тестовых организмов при мониторинге и оценке окружающей среды ^8,9. Некоторые характеристики делают эти организмы пригодными для экотоксикологических исследований, такие как их широкое распространение, их фильтрующая природа, их сидячий образ жизни, способность к биоаккумуляции широкого спектра загрязнителей окружающей среды и к разработке обнаруживаемых реакций на загрязнители, возможность работы с различными стадиями жизни, а также для поддержания в лабораторных условиях^.. Они обладают высокой чувствительностью к воздействию загрязнения и проявляют различные реакции на токсичные загрязнители в зависимости от вида, стадии жизни и условий окружающей среды ^8,9,10. Поэтому в некоторых экологических руководствах в качестве стандартизированных тестовых веществ используются двустворчатые моллюски^10,11.

Среди двустворчатых моллюсков широко распространенный Mytilus galloprovincialis является одним из наиболее часто используемых видов в экотоксикологической области благодаря своей способности вырабатывать ранние обнаруживаемые реакции на воздействие химического загрязнения, включая индукцию металлотионеина, изменение антиоксидантных ферментов, дестабилизацию лизосомальной мембраны, перекисное окисление липидов, накопление липофуссцина, повышенную частоту микроядер, индукцию карбоангидразы 12,13,14^{, 15}. Гемоциты, иммунокомпетентные гемолимфатические клетки, широко используются для изучения токсикологического воздействия загрязнителей окружающей среды на двустворчатых моллюсков 4,13,16,17. Эти клетки имеют решающее значение для иммунного ответа организма, выполняя несколько важных функций клеточно-опосредованного врожденного иммунитета. К ним относятся элиминация микробов путем фагоцитоза и различные цитотоксические реакции, такие как высвобождение лизосомальных ферментов, антимикробных пептидов и производство метаболитов кислорода во время дыхательного взрыва 18,19,20. Гемоциты по своей природе являются подвижными клетками 21,22,23, способными мигрировать к месту инфекции на ранней стадии иммунного ответа организма. В целом, подвижность является фундаментальным свойством, характеризующим все иммунные клетки, поскольку она позволяет осуществлять иммунонадзор за этими клетками для^{защиты организма.} Исследования различных видов моллюсков показывают, что подвижность гемоцитов является важнейшим компонентом их иммунного ответа, заживления ран и взаимодействия с патогенами. Эта подвижность регулируется специфическими молекулярными путями, что подчеркивает сложность и специализацию функций гемоцитов у моллюсков 21,25,26,27.

Несмотря на фундаментальное значение подвижности в физиологии гемоцитов, чувствительность подвижности гемоцитов к химическим загрязнителям окружающей среды изучалось в очень немногих исследованиях 23,28,29,30. Недавно наша группа охарактеризовала спонтанное движение гемоцитов Mytilus galloprovincialis в микропланшете из полистирола 96 лунок, обработанной культурой тканей, и изучила чувствительность подвижности гемоцитов к воздействию парацетамола²³ in vitro. Гемоциты M. galloprovincialis продемонстрировали случайное движение клеток, основанное на ламеллиподиях и быстрых изменениях формы, как это ранее было обнаружено у другого вида мидий, Mytilus edulis 21,22,23,28^, и уже описано в иммунных клетках человека³¹. Недавно было продемонстрировано, что подвижность гемоцитов чувствительна к химическим стрессорам^23,28. Основываясь на этих предыдущих выводах, в данной работе предлагается новый метод in vitro для быстрой и чувствительной оценки токсичности и экотоксичности загрязнителей, основанный на оценке подвижности гемоцитов M. galloprovincialis и ее изменений посредством скоростного анализа подвижности клеток (количественная оценка средней скорости, мигрирующего расстояния, евклидова расстояния и прямоты). Метод дает возможность in vitro проводить скрининг токсичности нескольких веществ либо в краткосрочных анализах (продолжительностью 1-4 часа), либо в анализах длительного воздействия, продолжительностью 24-48 часов.

Все эксперименты проводились в соответствии с итальянским законодательством о защите животных (D.L.26/2014), которое имплементировало Директиву Совета Европейского комитета (2010/63 EEC). Mytilus galloprovincialis — двустворчатый моллюск, широко известный как средиземноморская мидия. Он произрастает в Средиземном море и на атлантическом побережье южной Европы. Он был интродуцирован и широко распространен в западной части Северной Америки, Азии и Южной Африке. Это важный коммерческий рыбный вид в нескольких частях мира. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление искусственной морской воды (ASTM) или отфильтрованной природной морской воды

1. Для приготовления искусственной морской воды ASW в соответствии с ASTM D1141-98 (2021)³² растворить в дистиллированной воде (г на 1 л) следующие соли: 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO₃, 3,33 MgCl₂· 6H₂O, 2,66 Na₂SO₄, 0,733 CaCl₂ · 2H₂O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H₃BO₃, 0,013 SrCl₂·6H₂O, 0,0019 NaF. Раствор ASW имеет pH 7,80.
2. Для приготовления отфильтрованной природной морской воды (ССО) фильтруется природная морская вода 37 PSU, собранная с участка, не подверженного воздействию антропогенной деятельности, с помощью фильтров 0,2 мкм.

2. Акклиматизация животных

1. Акклиматизируйте взрослые особи мидий (Mytilus galloprovincialis Lam.) в течение 24 часов в стационарных резервуарах (в условиях голодания), содержащих аэрированную ASW или FSW (1 л/животное) при 15 °C в термостатическом помещении перед экспериментальным использованием.

3. Реагентный препарат для оценки подвижности гемоцитов

1. Приготовьте отфильтрованную морскую воду (FSW), как указано выше, или стандартный физиологический раствор (SPS). Растворите HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоновую кислоту) 4,77 г, NaCl 25,48 г, MgSO₄ 13,06 г, KCl 0,75 г, CaCl₂ 1,47 г примерно в 800 мл дистиллированной воды, затем доведите до 1 л путем добавления большего количества дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 7,36 с помощью 1 М NaOH.
2. Приготовьте исходный раствор Neutral Red в концентрации 20 мг/мл в диметилсульфоксиде (ДМСО).
3. Приготовьте раствор для окрашивания Neutral Red: Добавьте 5 μL стокового раствора Neutral Red к 995 μL FSW или SPS.
4. Приготовьте FSW или SPS с добавлением 2 мМ L-глутамина, 40 МЕ/мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина следующим образом: Добавьте 100 мкл 2 мМ L-глутамина и 100 мкл смеси пенициллин/стрептомицин к 10 мл FSW/SPS.
5. Приготовьте 0,4% трипановый синий в FSW или SPS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтральный красный стоковый раствор был приготовлен в соответствии с Martínez-Gómez et ^al.33. Исходный раствор Neutral Red хранится около 2-3 недель при хранении при температуре 4 °C. Нейтральный красный красящий раствор и 0,4% трипановый синий следует готовить непосредственно перед анализом.

4. Забор гемолимфы

1. Предварительно наполните шприц 0,5 мл отфильтрованной морской воды FSW или стандартным физиологическим раствором SPS (при 15 °C).
2. Слегка и аккуратно раздвиньте створки по брюшной поверхности скальпелем. Удерживайте скальпель в нужном положении или используйте наконечник пипетки. Позвольте игле подкожного шприца войти в пространство между клапанами.
3. Аккуратно соберите 0,5 мл гемолимфы из задней приводящей мышцы с помощью предварительно заполненного шприца в соответствии с UNEP/RAMOGE³⁴.
4. Извлеките иглу из шприца и перенесите содержимое шприца в микротрубку.
5. Соберите гемолимфу из 3-4 мидий и объедините образцы гемолимфы в пробирке при температуре 15 °C, используя одинаковое соотношение между особями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное наполнение шприца используется для немедленного разбавления гемолимфы в соотношении 1:1 во время забора. Разведение гемолимфы с помощью FSW или SPS в соотношении 50:50 обычно используется для предотвращения агрегации гемоцитов, согласно Martínez-Gómez et ^al.33.

5. Гальванизация и бактериологическое исследование гемоцитов

1. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
2. Разведите гемолимфу в концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл с помощью FSW или SPS.
3. Оцените жизнеспособность гемоцитов в суспензии с помощью окрашивания трипановым синим: добавьте 100 мкл 0,4% растворенного в FSW или SPS трипанового синего в 100 мкл гемоцитарной суспензии. Выдерживать 5 минут при 15 °C.
4. Далее добавьте каплю суспензии в гемоцитометр и подсчитайте неокрашенные (жизнеспособные) и окрашенные (нежизнеспособные) клетки под наблюдением микроскопии.
5. Оценивают жизнеспособность гемоцитов как процент жизнеспособных клеток, рассчитанный на общее количество подсчитанных клеток³⁵.
6. Используйте следующую формулу для оценки жизнеспособности клеток³⁵:
   Жизнеспособные клетки (%) = [количество жизнеспособных клеток/общее количество клеток (жизнеспособные + нежизнеспособные)] x 100
7. Убедитесь, что жизнеспособность гемоцитов должна быть выше 95%, чтобы продолжить работу в протоколе.
8. Добавьте 50 мкл разведенной гемолимфы в каждую лунку клеточной культуры 96-луночного микропланшета с плоским дном из полистирола, обработанного ТС. Накройте тарелку своей крышкой.
9. Дайте гемоцитам прилипнуть к дну лунок в течение 30 минут при 15 °C для образования монослоя.
10. Удалите излишки гемолимфы путем легкой аспирации с помощью микропипетки.

6. Краткосрочный анализ

1. Для кратковременных анализов (в течение 1-4 ч) немедленно инкубируют клетки, прилипшие к дну лунок, со 100 мкл исследуемого вещества, растворенного в FSW или SPS в различных концентрациях при 15 °C. Используйте не менее трех лунок для трех повторных определений каждого экспериментального условия.
2. После инкубации оцените подвижность клеток после шага 8.

7. Анализ при длительном воздействии

1. Для длительной экспозиции, т.е. при проведении анализов экспозиции в течение 24-48 часов, культивируемые адгезивные клетки инкубируют с возрастающими концентрациями исследуемого вещества, растворенного в питательной среде (FSW или ASW) с добавлением 2 мМ L-глутамина (40 МЕ/мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина) при 15°С. Используйте не менее трех лунок для трех повторных определений каждого экспериментального условия.
2. После инкубации оцените подвижность клеток после шага 8.

8. Оценка подвижности клеток с помощью покадровой микроскопии

1. Вставьте многолуночный планшет, содержащий адгезивные живые гемоциты, в многорежимный считыватель.
2. Оцените подвижность адгезивных живых клеток с помощью визуализации в режиме реального времени на планшете с помощью покадровой микроскопии: сделайте снимки одной и той же области интереса (ROI) (размер используемого ROI: 720 мкм x 720 мкм) в каждой лунке со скоростью 1 изображение каждые 1 мин в течение 10 мин с помощью многорежимного ридера с 20-кратным увеличением и цветной визуализацией в светлом поле.
3. Для лучшей визуализации гемоцитов окрашивайте клетки жизненно важным красителем Neutral Red непосредственно перед покадровой микроскопией следующим образом:
   1. Удалите инкубационную среду из каждой лунки.
   2. Добавьте 100 мкл окрашивающего раствора нейтрального красного, растворенного в стандартном физиологическом растворе, содержащем интересующее вещество, в лунки планшета, содержащего адгезивные клетки.
   3. Инкубируйте клетки при температуре 15 °C в течение 15 минут. Смойте излишки красителя.
   4. Добавьте 100 мкл интересующего вещества, растворенного в FSW или SPS. Визуализируйте клетки для оценки подвижности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование многорежимного считывателя позволяет одновременно получать изображения из большого числа скважин, что позволяет одновременно обнаруживать подвижность всех экспериментальных условий и реплик, содержащихся в скважине. Нейтральный красный краситель сохраняется внутри лизосом, которые проявляются в виде маленьких оранжевых пятен в цитоплазме, в то время как ядро выглядит как полупрозрачное отверстие, поскольку ацидофильный жизненно важный краситель не окрашивает его. Получение изображения проводилось в течение 10 мин при комнатной температуре 20 °C.

9. Отслеживание ячеек и расчет скоростных параметров

1. Проанализируйте кадры одной и той же области интереса, полученные с помощью интервальной микроскопии с помощью Image J для каждой скважины.
2. Сохраните изображения в папке без пробелов в имени. Изображения могут быть как в формате JPEG, так и в формате PNG.
3. Откройте ImageJ. Нажмите « Файл» > «Импортировать > последовательность изображений».
4. Выполняйте отслеживание отдельных ячеек с помощью подключаемого модуля ручного отслеживания ImageJ. Положения отдельных ячеек отмечаются на последовательных изображениях, что позволяет отслеживать изменения положения с течением времени.
5. Анализируйте не менее 40 ячеек на лунку, исключая из анализа клетки, которые выходят за пределы записанного поля.
6. Импортируйте наборы данных из подключаемого модуля ImageJ «Ручное отслеживание» в бесплатное программное обеспечение Chemotaxis and Migration Tool.
7. Количественно оцените скоростные параметры, такие как средняя скорость, евклидово расстояние, мигрированное расстояние и прямота, используя программное обеспечение Chemotaxis and Migration Tool в соответствии с подробными инструкциями, приведенными в свободно доступном руководстве пользователя программного обеспечения³⁶, или с помощью следующих шагов:
   1. Импортируйте наборы данных из подключаемого модуля ImageJ "Manual Tracking" в программное обеспечение Chemotaxis and Migration Tool.
   2. Выберите желаемое количество срезов (например, количество изображений, используемых для отслеживания).
   3. Откалибруйте программное обеспечение, установив размер пикселя x/y и временной интервал. Калибровка x/y показывает длину края пикселя в мкм, а временной интервал представляет собой продолжительность между каждым срезом.
   4. После настройки значений и параметров нажмите на кнопку «Применить настройки».
   5. Построение графиков траекторий и экспорт в виде изображения. Нажмите на кнопку «Измеренные значения », чтобы увидеть измеренные значения. Сохраните его.
   6. Нажмите на кнопку «Статистика » и сохраните скорость и прямоту серии треков.
8. Сравните скоростные параметры, рассчитанные для контрольных клеток, с показателями гемоцитов, подвергшихся воздействию исследуемого вещества в различных концентрациях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние миграции (измеряется в μм) относится к длине пути миграции в течение периода наблюдения (10 минут). Евклидово расстояние (также измеряемое в μм) представляет собой расстояние по прямой между начальной и конечной точками клетки. Средняя скорость (выраженная в мкм ^мин-1) рассчитывается как отношение перенесенного расстояния к длительности слежения за ячейкой для каждой ячейки. Прямота определяется как отношение евклидова расстояния к накопленному расстоянию для каждой траектории.

В исследовании представлен новый метод in vitro для быстрой и чувствительной оценки токсичности и экотоксичности загрязнителей, использующий подвижность гемоцитов Mytilus galloprovincialis. На рисунке 1A-C показана репрезентативная покадровая визуализация гемоцитов после 30-минутного прикрепления к дну скважины. Клетки на рисунке были окрашены в нейтральный красный цвет непосредственно перед оценкой подвижности. Движения клеток контролировали с помощью оптической микроскопии со скоростью одно изображение в минуту в течение 10 мин при 20-кратном увеличении с помощью многорежимного считывателя. На рисунке 1A-C показаны три из 11 кадров, снятых из одной и той же области интереса (ROI) за 0 минут, 5 минут и 10 минут. Одни и те же клетки пронумерованы на всех трех рисунках, чтобы подчеркнуть их движение, и нумерация остается одинаковой на всех рисунках, чтобы четко проиллюстрировать их траектории.

Клетки демонстрируют одиночные движения на основе активности ламеллиподий и быстрых изменений формы. Клетки были помечены жизненно важным красителем Neutral red для улучшения их визуализации во время отслеживания. Нейтральный красный цвет является амфифильным и слабым катионным красителем, который может легко проникать через клеточную мембрану. Попадая внутрь клеток, краситель попадает в лизосомы из-за протонирования. Гемоциты мидий, особенно гранулоциты, демонстрируют хорошо развитую лизосомальную систему; поэтому они хорошо визуализируются с помощью окрашивания нейтральным красным цветом, при этом цитоплазма богата несколькими красными мечеными лизосомами, а ядро (не отмеченное красителем) выглядит как полупрозрачное отверстие.

Благодаря применению протокола можно наблюдать два основных морфотипа гемоцитов в соответствии с Udayan et ^al.23: (1) распространяющиеся клетки с биполярной формой бобов и иногда амебоидным контуром, а также меньшие клетки в форме круглых звезд (клетки n = 3 и 10). В обоих типах клеток движение характеризовалось непрерывными изменениями формы с продолжающимся расширением и втягиванием псевдоподий и филоподий.

Применение протокола позволяет успешно оценить подвижность гемоцитов путем построения графиков траекторий, как показано на рисунке 2, и расчета основных скоростных параметров, таких как средняя скорость и прямота. Они соответствовали соответственно 6,46 ± 0,2 мкм/мин и 0,56 ± 0,02 (среднее значение ± SEM) для спред-клеток и 5,18 ± 0,34 мкм/мин и 0,37 ± 0,03 для малых клеток, соответственно, в базальных физиологических условиях после 30 мин прикрепления к дну лунки. Таким образом, протокол позволяет классифицировать различные популяции гемоцитов на основе скоростных параметров.

Благодаря применению протокола могут быть обнаружены изменения скоростного параметра подвижности гемоцитов после воздействия лекарственных препаратов или загрязняющих веществ. На рисунке 3A-D представлены репрезентативные результаты in vitro воздействия гемоцитов мидий на парацетамол, который является одним из фармацевтических препаратов, выбрасываемых в окружающую среду (PiE) с самой высокой концентрацией и самой высокой частотой обнаружения в реках по всему миру³¹.

Согласно Udayan et ^al.23, в контрольных клетках значительное увеличение скорости с течением времени наблюдалось в обоих морфотипах клеток, что свидетельствует об активации гемоцитов в течение 24-часовой культуры, предположительно вызывающей воспалительную реакцию, экспериментально вызванную отменой и осаждением в культуральной среде. Когда клетки подвергались воздействию препарата, активация подвижности гемоцитов была значительно снижена в спредных клетках (рис. 3А) через 24 ч, но не в небольших круглых клетках (рис. 3В), характеризующихся более низкой средней базальной скоростью (по оценке в момент времени 0). Кроме того, протокол позволил обнаружить изменения траектории клеток после воздействия препарата, о чем свидетельствует значительное увеличение прямоты малых клеток через 24 ч и снижение прямоты после 1 ч экспозиции в распространяющихся клетках (рис. 3C, D).

Рисунок 1: Репрезентативная покадровая съемка нейтральных красных гемоцитов после 30 минут прикрепления к дну скважины. Клетки окрашивали жизненно важным красителем Neutral Red непосредственно перед оценкой подвижности. Движения клеток контролировали с помощью оптической микроскопии со скоростью одно изображение каждую минуту в течение 10 минут при 20-кратном увеличении. Для краткости на панелях A, B и C отображаются три из 11 кадров, снятых из одной и той же области интереса (ROI) за 0 мин, 5 мин и 10 мин. На всех трех рисунках пронумерованы одни и те же клетки, чтобы проиллюстрировать их движение, а стрелками обозначены временные интервалы. Масштабные линейки представляют собой 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативный график траектории гемоцитов M. galloprovincialis . Показанные траектории исходят из одной скважины. Показаны траектории 25 ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Влияние воздействия парацетамола (24 ч) на скорость и прямоту распространяющихся клеток (A,B) и небольших круглых звездообразных клеток (C,D). Данные выражаются в виде среднего значения ± SEM. Статистическую значимость данных оценивали с помощью одностороннего ANOVA и пост-теста Тьюки. *p < 0.05 против. контроль (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Протокол, описанный в данной работе, представляет собой новый метод in vitro, подходящий для быстрой и чувствительной оценки токсичности лекарственных средств и загрязнителей на основе оценки подвижности гемоцитов M. galloprovincialis и ее изменений. Подвижность является специфическим аспектом иммунной функции этих клеток 21,22,23,37,38, поэтому любое изменение подвижности клеток может предвещать изменения в иммунной функции этих клеток. Подвижность является важной клеточной функцией, которая объединяет несколько клеточных процессов, таких как клеточная адгезия, клеточная сигнализация, активность цитоскелета, внутриклеточная сигнализация и регуляция клеточного объема, и требует интеграции и координации сложных биохимических и биомеханических сигналов 39,40,41. Каждый из этих процессов или компоненты каждого процесса могут быть потенциальными мишенями токсического действия лекарственных препаратов и загрязняющих веществ. Таким образом, изменения подвижности в скорости и/или траектории клетки представляют собой чувствительные конечные точки, интегрирующие эффекты на несколько клеточных мишеней.

Протокол подходит для оценки in vitro эффектов исследуемых веществ либо в краткосрочных анализах (продолжительностью 1-4 часа), либо в анализах длительного воздействия, продолжительностью 24-48 часов, что позволяет проводить быстрый скрининг загрязняющих веществ и лекарственных препаратов на предмет потенциальных токсических эффектов. Используя 96-луночный планшет, этот метод облегчает одновременное тестирование нескольких веществ или различных концентраций одного вещества, тем самым экономя время и реагенты. Кроме того, протокол также может быть адаптирован для использования с другим оборудованием, таким как фазово-контрастный микроскоп или флуоресцентный микроскоп. В этом случае клетки могут быть визуализированы без какого-либо окрашивания или с использованием флуоресцентных жизненно важных красителей.

Несмотря на то, что этот метод предлагает новые и чувствительные альтернативы для токсикологического скрининга, некоторые ограничения метода должны быть учтены для более широкого применения. Во-первых, важнейшим аспектом применения протокола является температура. Известно, что гемоциты мидий чувствительны к перепадам температуры. Воздействие температуры на гемоциты является сложным, при этом высокие и низкие температуры негативно влияют на их иммунные функции 42,43,44. Как было отмечено во время настройки метода, критической фазой, касающейся влияния температуры на подвижность клеток, является предварительная фаза сбора клеток, адгезии и культивирования на субстрате, которая должна следовать температуре акклиматизации организмов. Повышение температуры на несколько градусов во время этой первой фазы по сравнению с температурой акклиматизации может иметь решающее значение для приобретения формы и подвижности спредных клеток. Поэтому для культивирования гемоцитов рекомендуется температура 15 °C. Покадровое изображение для оценки моторики проводилось в течение 10 минут при комнатной температуре 20 °C. На основании предварительных наблюдений во время настройки метода можно сделать вывод, что экспозиция культивируемых клеток в течение этого интервала времени при 20 °C существенно не изменяет подвижность гемоцитов. Еще одним ограничением метода является ручное отслеживание гемоцитов, что может привести к вариабельности, зависящей от пользователя, и потребовать значительного времени и внимания к деталям. Тем не менее, использование жизненно важного красителя нейтрального красного цвета улучшает визуализацию клеток и, в свою очередь, отслеживание клеток за счет визуализации хорошо развитой лизосомальной системы. Ядро не окрашено красителем и выглядит как пустое отверстие, которое легко распознать и легко указать во время ручного отслеживания клеток. Еще одно ограничение метода связано с его природой in vitro. В то время как состояние in vitro обеспечивает контролируемую среду для оценки подвижности, оно может не полностью воспроизводить сложные взаимодействия и реакции, которые происходят in vivo, особенно в рамках иммунных реакций всего организма.

В последние годы в медико-биологической отрасли широко используются новые подходы и методологии, направленные на улучшение результатов и снижение зависимости от испытаний на животных⁴⁵. Протокол предлагает альтернативный чувствительный тест для in vitro скрининга эффектов и механизмов действия загрязнителей и лекарственных препаратов с целью быстрого скрининга токсикологических эффектов химических загрязнителей, присутствующих в матрицах окружающей среды, как по отдельности, так и в смесях. Он фокусируется на новой конечной точке — подвижности клеток иммунной системы, которая может обеспечить комплексный ответ на токсикологическое воздействие, оказываемое лекарствами и загрязняющими веществами на различные клеточные мишени. В этом смысле он расширяет диапазон доступных в литературе тестов in vitro , в том числе с точки зрения интегрированного многопробирного подхода для применения в биомониторинге окружающей среды. Некоторые характеристики протокола согласовывают его с критериями 3R (Замена, Сокращение и Уточнение), способствуя сокращению количества позвоночных in vivo в испытаниях на животных и разработке более этичного и эффективного токсикологического и экотоксикологического анализа токсичности воздействия. Эти характеристики включают в себя легкое извлечение гемолимфы из мидий малоинвазивным способом, небольшое количество гемолимфы, необходимое для тестирования, и использование многолуночного планшета, который позволяет одновременно подвергать воздействию несколько концентраций токсикантов и повторять их, обеспечивая значительную экономию времени и реагентов.

Авторам нечего раскрывать.

Это исследование финансировалось проектом "Dipartimento di Eccellenza", предоставленным DiSTeBA Министерством университетов и исследований Италии, CUP: F85D18000130001, и NBFC (Национальный центр будущего биоразнообразия), финансируемым Европейским союзом NextGenerationEU, PNRR, проект No CN00000033. Мы также благодарим инфраструктуру BIOforIU на факультете биологических и экологических наук и технологий Университета Саленто.