基于贻贝 （Mytilus galloprovincialis） 血细胞运动的毒理学和生态毒理学测定

本文提出了一种新的 体外 方法，用于基于 Mytilus galloprovincialis 血细胞的运动性快速、灵敏地评估污染物的毒性和生态毒性。该方法旨在促进开发更合乎道德和更敏感的毒理学和生态毒理学暴露测试。

血细胞是双壳类软体动物中循环的免疫活性细胞，在细胞介导的先天免疫的几个重要功能中起关键作用。在免疫反应的早期阶段，血细胞主动迁移到感染部位。这种固有的运动是这些细胞的基本特征。它代表了一种关键的细胞功能，整合了多个过程，例如细胞粘附、细胞信号传导、细胞骨架动力学和细胞体积的变化。因此，暴露于药物或污染物后细胞运动的改变可以作为有用的毒理学终点。尽管细胞运动在细胞生理学中起着重要作用，但从毒理学的角度来看，它的研究却很差。这项工作在评价 Mytilus galloprovincialis 的血细胞运动的基础上，提出了一种新的体外方法，用于快速、灵敏地评估污染物的毒性和生态毒性。我们开发了一种对粘附在 96 孔聚苯乙烯微孔板底部的血细胞的细胞运动测定法。在暴露于浓度不断增加的药物后，通过在延时显微镜下通过细胞追踪量化细胞轨迹和速度，使我们能够测量对血细胞运动的影响。由于易于以相对非侵入性的方式从动物中收集血细胞，因此所提出的方法为筛选污染物和药物的影响和作用机制提供了一种替代测试。它符合 3R（替代、减少和改进）标准，解决了道德问题，并有助于减少脊椎动物体内动物试验。

基于效果的方法，例如体外和体内生物测定，代表了检测环境化学污染物对生物体的影响并将其用作环境监测和风险评估工具的创新工具 1,2,3,4。它们通过克服经典分析化学方法的一些局限性来补充经典分析化学方法。例如，基于效果的方法可以评估污染物的生物利用度、它们对生物体健康的影响以及混合物的综合毒理学影响。仅凭化学分析可能无法预测这些综合效应⁵。

近年来，新兴污染物（新兴污染物）的生态毒理学代表了一个领域，基于效果的方法可以成为检测暴露和评估对生物群影响的有用工具1,5,6,7。几种基于效果的方法使用双壳类软体动物作为环境监测和评估中的测试生物 ^8,9。一些特性使这些生物体适合进行生态毒理学研究，例如它们的广泛分布、滤食性质、无柄生活方式、多种环境污染物的生物积累能力和对污染物产生可检测的反应的能力、与不同生命阶段一起工作的可能性，以及在实验室条件下维持^{的可能性 7}.它们对污染暴露高度敏感，并根据物种、生命阶段和环境条件对有毒污染物表现出各种反应 ^8,9,10。因此，一些环境指南使用双壳类物种作为标准化测试物种^10,11。

在双壳类软体动物中，广泛分布的 Mytilus galloprovincialis 是生态毒理学领域最常用的物种之一，因为它能够对化学污染暴露产生早期可检测的反应，包括金属硫蛋白诱导、抗氧化酶改变、溶酶体膜不稳定、脂质过氧化、脂褐素积累、微核频率增加、碳酸酐酶诱导 12,13,14^，15.血细胞是免疫活性血淋巴细胞，广泛用于研究环境污染物对双壳类软体动物的毒理学影响 4,13,16,17。这些细胞对生物体的免疫反应至关重要，执行细胞介导的先天免疫的几个重要功能。这些包括通过吞噬作用和各种细胞毒性反应消除微生物，例如溶酶体酶的释放、抗菌肽以及呼吸爆发期间氧代谢物的产生 18,19,20。血细胞是本质上运动的细胞 21,22,23，能够在生物体免疫反应的早期阶段迁移到感染部位。一般来说，运动是表征所有免疫细胞的基本特征，因为它使这些细胞的免疫监视能够保护身体²⁴。对各种软体动物物种的研究表明，血细胞运动是其免疫反应、伤口愈合和与病原体相互作用的关键组成部分。这种运动受特定分子途径的调节，突出了软体动物中血细胞功能的复杂性和特化 21,25,26,27。

尽管运动在血细胞生理学中具有根本重要性，但很少有研究调查血细胞运动对环境化学污染物的敏感性 23,28,29,30。最近，我们小组表征了 Mytilus galloprovincialis 血细胞在组织培养处理的聚苯乙烯 96 孔微孔板中的自发运动，并检查了血细胞运动对体外暴露于扑热息痛²³ 的敏感性。M. galloprovincialis 血细胞表现出基于板状伪足和快速形状变化的随机样细胞运动，正如之前在另一种贻贝物种 Mytilus edulis 21,22,23,28 中发现^的那样，并且已经在人类免疫细胞中描述过³¹。最近证明血细胞运动对化学应激源敏感^23,28。基于这些先前的发现，这项工作提出了一种新的体外方法，用于通过细胞运动的速度分析（平均速度、迁移距离、欧几里得距离和直接性的量化）来评估 M. galloprovincialis 血细胞的运动性及其改变，快速、灵敏地评估污染物的毒性和生态毒性。该方法提供了在短期测定（持续 1-4 小时）或持续 24-48 小时的长时间暴露测定中体外筛选几种物质的毒性的可能性。

所有实验均根据实施欧洲委员会理事会指令 （2010/63 EEC） 的意大利动物福利立法 （D.L.26/2014） 进行。 Mytilus galloprovincialis 是一种滤食性双壳类，通常被称为地中海贻贝。它原产于地中海和南欧的大西洋沿岸。它是被引入的，并广泛分布在北美西部、亚洲和南非。它是世界多个地区重要的商业渔业物种。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。

1. 人工海水 （ASTM） 或过滤天然海水的制备

1. 为了根据 ASTM D1141-98 （2021）³² 制备人工海水反潜战，将以下盐溶解在蒸馏水中（1 L 时为 g）：27.65 NaCl、0.133 NaHCO₃、3.33 MgCl₂·6H₂O， 2.66 Na₂SO₄， 0.733 氯化钙₂ ·2H₂O，0.466 KCl，0.067 KBr，0.02 H₃BO 3,0.013 SrCl₂·6H₂O，0.0019 NaF。ASW 溶液的 pH 值为 7.80。
2. 为了制备过滤后的天然海水 （FSW），用 0.2 μm 过滤器过滤从不受人为活动影响的地点收集的天然海水 37 PSU。

2. 动物驯化

1. 在实验使用前，将成年贻贝标本（Mytilus galloprovincialis Lam.）在含有充气ASW或FSW（1L /动物）的静态罐（饥饿）中在15°C的恒温室中驯化24小时。

3. 用于血细胞运动评估的试剂制备

1. 如上所述准备过滤海水 （FSW） 或标准生理盐水 （SPS）。将 HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪-乙磺酸）4.77 g、NaCl 25.48 g、MgSO₄ 13.06 g、KCl 0.75 g、CaCl₂ 1.47 g 溶于约 800 mL 蒸馏水中，然后加入更多的蒸馏水补成 1 L。用 1 M NaOH 将 pH 值调节至 7.36。
2. 在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 20 mg/mL 的中性红储备液。
3. 制备中性红染色溶液：向 995 μL FSW 或 SPS 中加入 5 μL 中性红储备液。
4. 制备补充有 2 mM L-谷氨酰胺、40 IU/mL 青霉素 G 和 100 μg/mL 链霉素的 FSW 或 SPS，如下所示：将 100 μL 2 mM L-谷氨酰胺和 100 μL 青霉素/链霉素混合物添加到 10 mL FSW/SPS 中。
5. 在 FSW 或 SPS 中制备 0.4% 台盼蓝。
   注：根据 Martínez-Gómez 等人 ³³ 制备中性红储备液。中性红储备液在 2 °C 下储存时可持续约 3-4 周。 应在测定前制备中性红染色溶液和 0.4% 台盼蓝。

4. 血淋巴取样

1. 用 0.5 mL 过滤后的海水 FSW 或标准生理盐水 SPS（15 °C）预填充注射器。
2. 用手术刀沿腹面轻轻小心地撬开瓣膜。将手术刀保持在原位或使用移液器吸头。让皮下注射器的针头进入瓣膜之间的空间。
3. 根据 UNEP/RAMOGE³⁴，用预装注射器从后内收肌轻轻收集 0.5 mL 血淋巴液。
4. 从注射器中取出针头，将注射器的内容物转移到微管中。
5. 从 3-4 个贻贝中收集血淋巴液，并在 15 °C 下使用相同的个体比例将血淋巴样品汇集在试管中。
   注意：注射器的预填充用于在采样过程中立即以 1：1 稀释血淋巴液。根据 Martínez-Gómez 等人的说法，用 FSW 或 SPS 以 50：50 的比例稀释血淋巴液通常用于防止血细胞聚集³³。

5. 血细胞铺板和培养

1. 用血细胞计数器计数细胞。
2. 用 FSW 或 SPS 稀释浓度为 1 ×^{10 6} 个细胞/mL 的血淋巴液。
3. 通过台盼蓝染色评估悬浮液中血细胞的活力：将 100 μL 溶于 FSW 或 SPS 的 0.4% 台盼蓝添加到 100 μL 血细胞悬液中。在 15 °C 下孵育 5 分钟。
4. 接下来，在血细胞计数器中加入一滴悬浮液，并在显微镜观察下对未染色（活）和染色（非活）的细胞进行计数。
5. 评估血细胞活力，作为根据计数细胞总数计算的活细胞百分比³⁵。
6. 使用以下公式进行细胞活力评估³⁵：
   活细胞 （%） = [活细胞数/细胞总数（活细胞 + 非活细胞）] x 100
7. 确保血细胞活力应高于 95% 才能在方案中进一步进行。
8. 将 50 μL 稀释的血淋巴液加入细胞培养物 96 孔平底聚苯乙烯 TC 处理的微孔板的每个孔中。用盖子盖住板。
9. 让血细胞在 15 °C 下粘附在孔底部 30 分钟以形成单层。
10. 用微量移液器轻轻吸出，去除多余的血淋巴液。

6. 短期检测

1. 对于短期测定（1-4 小时内），立即将粘附在孔底部的细胞与 100 μL 在 15 °C 下以不同浓度的 FSW 或 SPS 溶解的目标物质一起孵育。 至少使用三个孔对每个实验条件进行 3 次重复测定。
2. 孵育后，按照步骤 8 评估细胞运动。

7. 长时间暴露试验

1. 对于长时间暴露，即 24-48 小时暴露测定，在 15°C 下，将培养的贴壁细胞与补充有 2 mM L-谷氨酰胺 40 IU/mL 青霉素 G 和 100 μg/mL 链霉素的培养基（FSW 或 ASW）中溶解浓度递增的测试物质一起孵育。 至少使用三个孔对每个实验条件进行 3 次重复测定。
2. 孵育后，按照步骤 8 评估细胞运动。

8. 通过延时显微镜评估细胞运动

1. 将含有贴壁活血细胞的多孔板插入多功能读数仪中。
2. 通过延时显微镜在板上进行实时成像来评估贴壁活细胞的运动性：在每 1 分钟捕获 1 张图像的速率，在每个孔中捕获相同感兴趣区域 （ROI）（使用的 ROI 尺寸：720μm x 720μm） 的图像在 20 倍放大和彩色明场可视化下使用多功能阅读器，持续 10 分钟。
3. 为了更好地观察血细胞，请在延时显微镜检查之前用活性染料 Neutral Red 对细胞进行染色，如下所示：
   1. 从每个孔中取出孵育培养基。
   2. 将 100 μL 溶于含有目标物质的标准生理盐水中的中性红染色溶液加入含有贴壁细胞的板孔中。
   3. 将细胞在 15 °C 下孵育 15 分钟。洗掉多余的染料。
   4. 加入 100 μL 在 FSW 或 SPS 中分离的目标物质。可视化细胞以进行运动评估。
      注意：使用多功能阅读器可以从大量孔中同时采集图像，从而允许同时检测孔中包含的所有实验条件和重复。中性红色染料保留在溶酶体内，溶酶体在细胞质中显示为橙色小点，而细胞核则显示为半透明孔，因为嗜酸菌染料不会染色。在 20 °C 的室温下进行图像采集 10 分钟。

9. 细胞跟踪和测速参数计算

1. 通过图像 J 分析在延时显微镜下为每个孔获取的相同感兴趣区域的帧。
2. 将图像保存在名称中没有空格的文件夹中。图像可以是 JPEG 或 PNG 格式。
3. 打开 ImageJ。单击 File > Import > Image Sequence。
4. 使用 ImageJ 的 手动跟踪 插件对单个细胞进行细胞跟踪。单个单元格的位置在连续图像中标记，从而可以跟踪位置随时间的变化。
5. 每孔至少分析 40 个细胞，不包括从分析中逃脱记录区域的细胞。
6. 将数据集从 ImageJ 插件“手动跟踪”导入免费提供的趋化性和迁移工具软件。
7. 根据软件³⁶免费用户指南中报告的详细说明，使用 趋化性和迁移工具软件量化速度参数，例如平均速度、欧几里得距离、迁移距离和方向性或下面提供的步骤：
   1. 将数据集从 ImageJ 插件“手动跟踪”导入趋化性和迁移工具软件。
   2. 选择所需的切片数量（例如，用于跟踪的图像数量）。
   3. 通过设置 x/y 像素大小和时间间隔来校准软件。x/y 校准表示像素的边缘长度（以 μm 为单位），而时间间隔表示每个切片之间的持续时间。
   4. 调整值和参数后，单击 Apply Settings。
   5. 绘制轨迹并导出为图像。单击 Measured values 按钮查看测量值。省省吧。
   6. 单击 Statistics 按钮并保存轨道序列的速度和方向性。
8. 将对照细胞的计算速度参数与暴露于不同浓度测试物质的血细胞的测速参数进行比较。
   注意：迁移距离（以 μm 为单位）是指观察期间（10 分钟）迁移路径的长度。欧几里得距离（也以 μm 为单位）表示像元起点和终点之间的直线距离。平均速度（以 μm min ^-1 表示）计算为每个细胞的迁移距离与细胞跟踪持续时间的比率。直接性定义为每个轨迹的欧几里得距离与累积距离的比率。

该研究引入了一种新的体外方法，用于利用 Mytilus galloprovincialis 血细胞的运动快速、灵敏地评估污染物的毒性和生态毒性。图 1A-C 显示了附着到孔底部 30 分钟后血细胞的代表性延时成像。在运动评估之前，图中的细胞用中性红染色。使用光学显微镜以每分钟一张图像的速率监测细胞运动，持续 10 分钟，在 20 倍放大倍率下，使用多功能阅读器。图 1A-C 显示了在 0 min、5 min 和 10 min 时从同一感兴趣区域 （ROI） 捕获的 11 帧中的 3 帧。所有三个图中都对相同的单元格进行了编号，以突出它们的移动，并且图中的编号保持一致，以清楚地说明它们的轨迹。

这些细胞表现出基于板状伪足活动和快速形状变化的单细胞运动。用活性染料 Neutral red 标记细胞，以改善它们在追踪过程中的可视化。中性红是一种两亲性弱阳离子染料，易渗透细胞膜。一旦进入细胞，染料就会由于质子化而被困在溶酶体中。贻贝血细胞，尤其是粒细胞，表现出发达的溶酶体系统;因此，它们通过中性红染色可以很好地观察，细胞质富含几个红色标记的溶酶体，细胞核（未被染料标记）显示为半透明孔。

通过该方案的应用，可以根据 Udayan 等人 ²³ 观察到两种主要的血细胞形态类型：（1） 具有双极豆形的扩散细胞，有时是变形虫轮廓，以及较小的圆形星形细胞（细胞 n = 3 和 10）。在这两种细胞类型中，运动的特征是连续的形状变化，伪足和丝状伪足的持续伸展和缩回。

如图 2 所示，该协议应用程序允许通过构建轨迹图并计算主要速度参数（如平均速度和方向性）来成功评估血细胞运动。在基础生理条件下，这些分别对应于铺设细胞的 6.46 ± 0.2 μm/min 和 0.56 ± 0.02 （平均 ±SEM），小细胞分别为 5.18 ± 0.34 μm/min 和 0.37 ± 0.03，附着到孔底部 30 分钟后。因此，该方案允许根据测速参数对不同的血细胞群进行分类。

通过该方案的应用，可以在暴露于药物或污染物后检测血细胞运动速度参数的变化。图 3A-D 显示了贻贝血细胞体外暴露于扑热息痛的代表性结果，扑热息痛是释放到环境中的药物之一 （PiE），在世界各地的河流中具有最高浓度和最高检测频率³¹。

根据 Udayan 等人²³ 的说法，在对照细胞中，在两种细胞形态中都观察到速度随时间显着增加，这表明在 24 小时培养期间血细胞激活，可能唤起了在培养环境中通过退出和铺板实验诱导的炎症反应。当细胞暴露于药物中时，24 小时后，扩散细胞（图 3A）中血细胞的运动激活显着降低，但在小圆形细胞中则没有降低（图 3C），其特征是平均基础速度较低（在时间 0 处评估）。此外，该方案允许检测药物暴露后细胞轨迹的改变，如扩散细胞中小细胞暴露 24 小时后直接性显着增加和暴露 1 小时后直接性降低所示（图 3C，D）。

图 1：附着到孔底部 30 分钟后中性红色染色血细胞的代表性延时成像。 在运动评估之前，用活性染料 Neutral Red 对细胞进行染色。使用 光学显微镜在 20 倍放大倍率下以每分钟 1 张图像的速率监测细胞运动 10 分钟。为简洁起见，图 A、 B 和 C 显示了从 0 分钟、5 分钟和 10 分钟从同一感兴趣区域 （ROI） 捕获的 11 帧中的 3 帧。所有三个数字中都对相同的单元格进行了编号，以说明它们的移动，箭头表示时间间隔。比例尺代表 100 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2： M. galloprovincialis 血细胞的代表性轨迹图。 显示的轨迹来自单个孔。显示了 25 个细胞的轨迹。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：扑热息痛暴露（24 小时）对扩散细胞 （A、B） 和小圆形星形细胞 （C、D） 的速度和方向性的影响。 数据表示为 SEM ±平均值。通过单因素方差分析和 Tukey 后测评估数据的统计显着性。*p < 0.05 对对照 （P < 0.05）。 请单击此处查看此图的较大版本。

这项工作中描述的方案代表了一种新的体外方法，适用于基于评估 M. galloprovincialis 血细胞的运动性及其改变，快速灵敏地评估药物和污染物的毒性。运动是这些细胞免疫功能的一个特殊方面 21,22,23,37,38，因此细胞运动的任何改变都可能预示着这些细胞免疫功能的改变。运动是一项重要的细胞功能，它整合了多种细胞过程，例如细胞粘附、细胞信号传导、细胞骨架活性、细胞内信号传导和细胞体积调节，并且需要整合和协调复杂的生化和生物力学信号 39,40,41.这些过程或每个过程的组成部分都可能成为药物和污染物毒性作用的潜在目标。因此，细胞速度和/或轨迹的运动变化代表整合对多个细胞靶标影响的敏感终点。

该方案适用于在短期测定（持续 1-4 小时）或持续 24-48 小时的长时间暴露测定中对测试物质影响的 体外 评估，从而能够快速筛选污染物和药物的潜在毒性作用。通过使用 96 孔板，该方法有助于同时检测多种物质或不同浓度的单一物质，从而节省时间和试剂。此外，该方案还可以与其他设备一起使用，例如相差显微镜或荧光显微镜。在这种情况下，可以在没有任何染色或使用荧光活性染料的情况下对细胞进行成像。

虽然该方法为毒理学筛选提供了新颖且灵敏的替代方案，但对于更广泛的应用，必须考虑该方法的一些局限性。首先，协议应用的一个关键方面是温度。众所周知，贻贝血细胞对温度变化很敏感。温度对血细胞的影响很复杂，高温和低温会对它们的免疫功能产生负面影响 42,43,44。正如在方法设置过程中观察到的，关于温度对细胞运动影响的关键阶段是细胞收获、粘附和在基质上培养的初步阶段，这需要遵循生物体的适应温度。在第一阶段，温度高于驯化温度几度对于获得扩散细胞形状和运动性至关重要。因此，建议使用 15 °C 的温度进行血细胞培养。在 20 °C 的室温下进行用于运动评估的延时图像采集 10 分钟。 根据方法设置过程中的初步观察，在 20 °C 下暴露培养细胞的这个时间间隔不会显着改变血细胞运动。该方法的另一个局限性涉及血细胞的手动跟踪，这可能会引入用户依赖性的可变性，并且需要大量的时间和对细节的关注。然而，使用活性染料中性红改善了细胞的可视化，进而通过可视化发达的溶酶体系统来改善细胞追踪。细胞核未被染料染色，在细胞手动示踪过程中，它显示为一个易于识别和指向的空孔。该方法的另一个局限性与其体外性质有关。虽然体外条件为评估运动提供了一个受控的环境，但它可能无法完全复制体内发生的复杂相互作用和反应，尤其是在整个生物体的免疫反应中。

近年来，新的方法和方法在生命科学中得到普遍使用，旨在改善结果并减少对动物试验的依赖⁴⁵。该方案为污染物和药物的影响和作用机制的 体外 筛选提供了一种替代的敏感测试，以快速筛选环境基质中单独或混合物中存在的化学污染物的毒理学影响。它侧重于一个新的终点，即免疫系统细胞的运动，它可以对药物和污染物对各种细胞靶标施加的毒理学影响提供综合反应。从这个意义上说，它扩展了文献中可用的 体外 测试范围，也是从应用于环境生物监测的集成多分析方法的角度。该方案的一些特性使其与 3R（替代、减少和改进）标准保持一致，有助于减少脊椎动物 体内 动物试验，并有助于开发更合乎道德和更有效的毒理学和生态毒理学暴露毒性测定。这些特性包括易于以低侵入性方式从贻贝中收集血淋巴液，检测所需的少量血淋巴液，以及使用多孔板，允许同时暴露多种毒物浓度和重复，从而显著节省时间和试剂。

作者没有什么可披露的。

这项研究由意大利大学和研究部 CUP：F85D18000130001 授予 DiSTeBA 的“Dipartimento di Eccellenza”项目和由欧盟 NextGenerationEU、PNRR、项目 n. CN00000033 资助的 NBFC（国家生物多样性未来中心）资助。我们还感谢萨伦托大学生物与环境科学与技术系的 BIOforIU 基础设施。