Um ensaio toxicológico e ecotoxicológico baseado na motilidade dos hemócitos do mexilhão (Mytilus galloprovincialis)

O artigo propõe um novo método in vitro para a avaliação rápida e sensível da toxicidade e ecotoxicidade de poluentes, baseado na motilidade dos hemócitos de Mytilus galloprovincialis . O método visa contribuir para o desenvolvimento de testes de exposição toxicológica e ecotoxicológica mais éticos e sensíveis.

Os hemócitos são as células circulantes imunocompetentes em moluscos bivalves e desempenham um papel fundamental em várias funções importantes da imunidade inata mediada por células. Durante os estágios iniciais da resposta imune, os hemócitos migram ativamente para o local da infecção. Essa motilidade inerente é uma característica fundamental dessas células. Representa uma função celular chave que integra vários processos, como adesão celular, sinalização celular, dinâmica do citoesqueleto e alterações no volume celular. Portanto, alterações na motilidade celular após exposição a drogas ou poluentes podem servir como um desfecho toxicológico útil. Apesar do papel fundamental da motilidade celular na fisiologia celular, ela tem sido pouco investigada do ponto de vista toxicológico. Este trabalho propõe um novo método in vitro para a avaliação rápida e sensível da toxicidade e ecotoxicidade de poluentes, baseado na avaliação da motilidade dos hemócitos de Mytilus galloprovincialis. Desenvolvemos um ensaio de motilidade celular em hemócitos aderidos ao fundo de uma microplaca de poliestireno de 96 poços. Após a exposição a concentrações crescentes de drogas, as trajetórias e velocidades celulares foram quantificadas por rastreamento celular sob microscopia de lapso de tempo, permitindo medir os efeitos na motilidade dos hemócitos. Devido à facilidade de coleta de hemócitos dos animais de forma relativamente não invasiva, o método proposto oferece um teste alternativo para triagem dos efeitos e mecanismos de ação de poluentes e fármacos. Ele se alinha com os critérios 3Rs (Substituição, Redução e Refinamento), abordando questões éticas e contribuindo para a redução de testes em animais in vivo em vertebrados.

Os métodos baseados em efeitos, como os bioensaios in vitro e in vivo, representam ferramentas inovadoras para a detecção dos efeitos de poluentes químicos ambientais em organismos vivos e para seu uso como ferramentas de monitoramento ambiental e avaliação de riscos ^1,2,3,4. Eles complementam a abordagem química analítica clássica, superando algumas de suas limitações. Por exemplo, os métodos baseados em efeitos podem avaliar a biodisponibilidade de poluentes, seu impacto na saúde do organismo e os efeitos toxicológicos combinados das misturas. Esses efeitos combinados podem não ser previsíveis com base apenas na análise química⁵.

Nos últimos anos, a ecotoxicologia de poluentes de preocupação emergente (poluentes emergentes) representa um campo onde métodos baseados em efeitos podem ser ferramentas úteis para detectar a exposição e avaliar o impacto na biota 1,5,6,7. Vários métodos baseados em efeitos utilizam moluscos bivalves como organismos de ensaio na monitorização e avaliação ambiental ^8,9. Algumas características tornam esses organismos adequados para estudos ecotoxicológicos, como sua ampla distribuição, sua natureza filtradora, seu estilo de vida séssil, a capacidade de bioacumulação de uma ampla gama de poluentes ambientais e de desenvolver respostas detectáveis a poluentes, a possibilidade de trabalhar com diferentes estágios de vida e de manter em condições de laboratório⁷. Eles são altamente sensíveis à exposição à poluição e mostram uma variedade de respostas a contaminantes tóxicos, dependendo da espécie, estágio de vida e condições ambientais ^8,9,10. Portanto, várias diretrizes ambientais utilizam espécies de bivalves como espécies de teste padronizadas^10,11.

Dentre os moluscos bivalves, o amplamente difundido Mytilus galloprovincialis é uma das espécies mais utilizadas no campo ecotoxicológico devido à sua capacidade de desenvolver respostas detectáveis precocemente à exposição à poluição química, incluindo indução de metalotioneína, alteração enzimática antioxidante, desestabilização da membrana lisossômica, peroxidação lipídica, acúmulo de lipofuscina, aumento da frequência de micronúcleos, indução de anidrase carbônica 12,13,14^{, 15}. Os hemócitos, as células hemolinfáticas imunocompetentes, são amplamente utilizados para estudar os impactos toxicológicos de poluentes ambientais em moluscos bivalves 4,13,16,17. Essas células são cruciais para a resposta imune do organismo, desempenhando várias funções importantes da imunidade inata mediada por células. Isso inclui a eliminação de micróbios por meio de fagocitose e várias reações citotóxicas, como a liberação de enzimas lisossômicas, peptídeos antimicrobianos e a produção de metabólitos de oxigênio durante a explosão respiratória 18,19,20. Os hemócitos são células intrinsecamente móveis 21,22,23 capazes de migrar para o local da infecção durante o estágio inicial da resposta imune do organismo. Em geral, a motilidade é uma característica fundamental que caracteriza todas as células imunes, pois permite a imunovigilância dessas células para proteger o organismo²⁴. Pesquisas em várias espécies de moluscos demonstram que a motilidade dos hemócitos é um componente crítico de sua resposta imune, cicatrização de feridas e interação com patógenos. Essa motilidade é regulada por vias moleculares específicas, destacando a complexidade e especialização das funções dos hemócitos em moluscos 21,25,26,27.

Apesar da importância fundamental da motilidade na fisiologia dos hemócitos, poucos estudos investigaram a sensibilidade da motilidade dos hemócitos a poluentes químicos ambientais 23,28,29,30. Recentemente, nosso grupo caracterizou o movimento espontâneo de hemócitos de Mytilus galloprovincialis em uma microplaca de poliestireno de 96 poços tratada com cultura de tecidos e examinou a sensibilidade da motilidade dos hemócitos à exposição in vitro ao paracetamol²³. Os hemócitos de M. galloprovincialis mostraram um movimento celular aleatório baseado em lamelipódios e mudanças rápidas de forma, como encontrado anteriormente em outra espécie de mexilhão, Mytilus edulis 21,22,23,28^, e já descrito em células imunes humanas³¹. Recentemente, a motilidade dos hemócitos demonstrou ser sensível a estressores químicos^23,28. Com base nesses achados anteriores, este trabalho propõe um novo método in vitro para a avaliação rápida e sensível da toxicidade e ecotoxicidade de poluentes com base na avaliação da motilidade de hemócitos de M. galloprovincialis e suas alterações, por meio da análise velocimétrica da motilidade celular (quantificação da velocidade média, distância migratória, distância euclidiana e franqueza). O método oferece a possibilidade de rastrear in vitro a toxicidade de várias substâncias, seja em ensaios de curto prazo (com duração de 1-4 h) ou em ensaios de exposição prolongada, com duração de 24-48 h.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com a legislação italiana de bem-estar animal (DL26/2014) que implementou a Diretiva do Conselho do Comitê Europeu (2010/63 EEC). Mytilus galloprovincialis é um bivalve filtrador, comumente conhecido como mexilhão mediterrâneo. É nativa do Mar Mediterrâneo e da costa atlântica do sul da Europa. Foi introduzido e é difundido no oeste da América do Norte, Ásia e África do Sul. É uma importante espécie de pesca comercial em várias partes do mundo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de água do mar artificial (ASTM) ou água do mar natural filtrada

1. Para a preparação de água do mar artificial ASW de acordo com ASTM D1141-98 (2021)³², dissolva os seguintes sais em água destilada (g para 1 L): 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO₃, 3,33 MgCl₂· 6H₂O, 2,66 Na₂SO₄, 0,733 CaCl₂ · 2H₂O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H₃BO₃, 0,013 SrCl₂·6H₂O, 0,0019 NaF. A solução ASW tem um pH de 7,80.
2. Para a preparação de água do mar natural filtrada (FSW), filtre a água do mar natural 37 PSU, coletada de um local não impactado por atividades antrópicas com filtros de 0,2 μm.

2. Aclimatação animal

1. Aclimatar espécimes de mexilhões adultos (Mytilus galloprovincialis Lam.) durante 24 h em tanques estáticos (em caso de fome) contendo ASW ou FSW (1 l/animal) aerados a 15 °C numa sala termostática antes da utilização experimental.

3. Preparação de reagentes para avaliação da motilidade dos hemócitos

1. Prepare água do mar filtrada (FSW) como acima ou solução salina fisiológica padrão (SPS). Dissolva HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanossulfônico) 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO₄ 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl₂ 1,47 g em aproximadamente 800 mL de água destilada e, em seguida, perfaça até 1 L pela adição de mais água destilada. Ajuste o pH para 7,36 com NaOH 1 M.
2. Prepare uma solução de estoque vermelho neutro de 20 mg / mL em dimetilsulfóxido (DMSO).
3. Prepare a solução de coloração Vermelho Neutro: Adicione 5 μL de uma solução estoque de Vermelho Neutro a 995 μL de FSW ou SPS.
4. Prepare FSW ou SPS suplementado com 2 mM de L-glutamina, 40 UI / mL de penicilina G e 100 μg / mL de estreptomicina da seguinte forma: Adicione 100 μL de 2 mM de L-glutamina e 100 μL de mistura de penicilina / estreptomicina a 10 mL de FSW / SPS.
5. Prepare 0,4% de azul de tripano em FSW ou SPS.
   NOTA: A solução estoque vermelha neutra foi preparada de acordo com Martínez-Gómez et ^al.33. A solução-mãe Vermelho Neutro dura cerca de 2-3 semanas quando armazenada a 4 °C. A solução de coloração vermelha neutra e o azul de tripano a 0,4% devem ser preparados imediatamente antes do ensaio.

4. Amostragem de hemolinfa

1. Encha previamente uma seringa com 0,5 ml de FSW de água do mar filtrada ou SPS de soro fisiológico padrão (a 15 °C).
2. Separe leve e cuidadosamente as válvulas ao longo da superfície ventral com um bisturi. Mantenha o bisturi na posição ou use uma ponta de pipeta. Deixe a agulha de uma seringa hipodérmica entrar no espaço entre as válvulas.
3. Colete suavemente 0,5 mL de hemolinfa do músculo adutor posterior com a seringa pré-cheia de acordo com o PNUMA/RAMOGE³⁴.
4. Retire a agulha da seringa e transfira o conteúdo da seringa para um microtubo.
5. Colete a hemolinfa de 3-4 mexilhões e agrupe as amostras de hemolinfa em um tubo a 15 ° C usando a mesma proporção entre os indivíduos.
   NOTA: O pré-enchimento da seringa é usado para diluir imediatamente a hemolinfa 1:1 durante a amostragem. A diluição da hemolinfa com FSW ou SPS na proporção de 50:50 é comumente usada para prevenir a agregação de hemócitos, de acordo com Martínez-Gómez et ^al.33.

5. Plaqueamento e cultura de hemócitos

1. Conte as células com um hemocitômetro.
2. Diluir a hemolinfa na concentração de 1 × 10⁶ células/mL com FSW ou SPS.
3. Avalie a viabilidade dos hemócitos em suspensão pela coloração com azul de tripano: Adicione 100 μL de azul de tripano a 0,4% dissolvido em FSW ou SPS a 100 μL de suspensão de hemócitos. Incubar durante 5 min a 15 °C.
4. Em seguida, adicione uma gota de suspensão em um hemocitômetro e conte as células não coradas (viáveis) e coradas (não viáveis) sob observação microscópica.
5. Avalie a viabilidade dos hemócitos como a porcentagem de células viáveis calculada sobre o número total de células contadas³⁵.
6. Utilizar a seguinte fórmula para a avaliação da viabilidade celular³⁵:
   Células viáveis (%) = [número de células viáveis/número total de células (viáveis + inviáveis)] x 100
7. Certifique-se de que a viabilidade do hemócito seja superior a 95% para prosseguir no protocolo.
8. Adicione 50 μL de hemolinfa diluída em cada poço de uma microplaca de poliestireno de fundo plano de 96 poços de cultura de células. Cubra o prato com a tampa.
9. Permitir que os hemócitos adiram ao fundo dos alvéolos durante 30 min a 15 °C para formar uma monocamada.
10. Remova o excesso de hemolinfa aspirando suavemente com uma micropipeta.

6. Ensaio a curto prazo

1. Para ensaios de curto prazo (dentro de 1-4 h), incubar imediatamente as células aderentes ao fundo dos alvéolos com 100 μL da substância de interesse dissolvida em FSW ou SPS em diferentes concentrações a 15 °C. Utilizar pelo menos três alvéolos para três determinações repetidas de cada condição experimental.
2. Após a incubação, avalie a motilidade celular seguindo a etapa 8.

7. Ensaio de exposição prolongada

1. Para exposições prolongadas, ou seja, ensaios de exposição de 24-48 h, incubar as células aderentes cultivadas com concentrações crescentes da substância de ensaio dissolvida no meio de cultura (FSW ou ASW) suplementado com 2 mM de L-glutamina (40 UI/ml de penicilina G e 100 μg/ml de estreptomicina) a 15°C. Utilizar pelo menos três alvéolos para três determinações repetidas de cada condição experimental.
2. Após a incubação, avalie a motilidade celular seguindo a etapa 8.

8. Avaliação da motilidade celular por microscopia de lapso de tempo

1. Insira a placa multipoços contendo os hemócitos vivos aderentes em um leitor multimodo.
2. Avalie a motilidade das células vivas aderentes por meio de imagens em tempo real na placa por meio de microscopia de lapso de tempo: capture imagens da mesma região de interesse (ROI) (dimensão da ROI utilizada: 720μm x 720μm) em cada poço a uma taxa de 1 imagem a cada 1 min por 10 min usando o leitor multimodo sob ampliação de 20x e visualização de campo claro colorido.
3. Para melhor visualização dos hemócitos, core as células com o corante vital Vermelho Neutro imediatamente antes da microscopia de lapso de tempo da seguinte forma:
   1. Remova o meio de incubação de cada poço.
   2. Adicione 100 μL de solução de coloração de Vermelho Neutro dissolvido em solução salina fisiológica padrão contendo a substância de interesse nos poços da placa que contém as células aderentes.
   3. Incubar as células a 15 °C durante 15 min. Lave o excesso de corante.
   4. Adicionar 100 μL da substância de interesse resolvida em FSW ou SPS. Visualize as células para avaliação da motilidade.
      NOTA: O uso de um leitor multimodo permite a aquisição simultânea de imagens de um grande número de poços, permitindo a detecção simultânea da motilidade de todas as condições experimentais e réplicas contidas no poço. O corante vermelho neutro é retido dentro dos lisossomos, que aparecem como pequenas manchas laranja no citoplasma, enquanto o núcleo aparece como um buraco translúcido, uma vez que o corante acidophilus vital não o mancha. A aquisição das imagens foi feita por 10 min a uma temperatura ambiente de 20 °C.

9. Rastreamento celular e cálculo de parâmetros velocimétricos

1. Analise os quadros da mesma região de interesse adquiridos sob microscopia de lapso de tempo pela Imagem J para cada poço.
2. Salve as imagens em uma pasta sem espaços no nome. As imagens podem estar no formato JPEG ou PNG.
3. Abra o ImageJ. Clique em Arquivo > Importar > sequência de imagens.
4. Execute o rastreamento de células em células únicas usando o plug-in de rastreamento manual do ImageJ. As posições das células individuais são marcadas em imagens consecutivas, permitindo o rastreamento de mudanças de posição ao longo do tempo.
5. Analise pelo menos 40 células por poço, excluindo as células que escapam do campo registrado da análise.
6. Importe conjuntos de dados do plug-in ImageJ, "Rastreamento manual", para o software Quimiotaxia e Ferramenta de Migração disponível gratuitamente.
7. Quantifique os parâmetros velocimétricos, como velocidade média, distância euclidiana, distância migrada e franqueza usando o software Chemotaxis and Migration Tool de acordo com as instruções detalhadas relatadas no guia do usuário do software^{disponível gratuitamente 36}ou as etapas fornecidas abaixo:
   1. Importe conjuntos de dados do plug-in ImageJ "Rastreamento manual" para o software Chemotaxis and Migration Tool.
   2. Selecione o número desejado de fatias (por exemplo, o número de imagens usadas para rastreamento).
   3. Calibre o software definindo o tamanho do pixel x/y e o intervalo de tempo. A calibração x/y indica o comprimento da borda de um pixel em μm, enquanto o intervalo de tempo representa a duração entre cada fatia.
   4. Depois de ajustar os valores e parâmetros, clique em Aplicar configurações.
   5. Plote trajetórias e exporte como imagem. Clique no botão Valores medidos para ver os valores medidos. Salve-o.
   6. Clique no botão Estatísticas e salve a velocidade e a franqueza da série de faixas.
8. Comparar os parâmetros velocimétricos calculados para as células de controlo com os dos hemócitos expostos à substância em estudo em diferentes concentrações.
   NOTA: A distância migrada (medida em μm) refere-se ao comprimento do caminho de migração durante o período de observação (10 min). A distância euclidiana (também medida em μm) representa a distância em linha reta entre o ponto inicial e o ponto final da célula. A velocidade média (expressa em μm ^min-1) é calculada como a razão entre a distância migrada e a duração do rastreamento celular para cada célula. A franqueza é definida como a razão entre a distância euclidiana e a distância acumulada para cada trajetória.

O estudo apresenta um novo método in vitro para avaliar de forma rápida e sensível a toxicidade e ecotoxicidade de poluentes, utilizando a motilidade dos hemócitos de Mytilus galloprovincialis. A Figura 1A-C mostra imagens representativas de lapso de tempo de hemócitos após 30 min de fixação ao fundo do poço. As células da figura foram coradas com Vermelho Neutro pouco antes da avaliação da motilidade. Os movimentos celulares foram monitorados por microscopia óptica a uma taxa de uma imagem a cada minuto por 10 min, sob aumento de 20x, com um leitor multimodo. A Figura 1A-C exibe três dos 11 quadros capturados da mesma região de interesse (ROI) em 0 min, 5 min e 10 min. As mesmas células são numeradas em todas as três figuras para destacar seu movimento, e a numeração permanece consistente em todas as figuras para ilustrar claramente suas trajetórias.

As células mostram movimentos unicelulares com base na atividade dos lamelipódios e mudanças rápidas de forma. As células foram marcadas com o corante vital vermelho neutro para melhorar sua visualização durante o rastreamento. O vermelho neutro é um corante catiônico anfifílico e fraco que pode permear facilmente a membrana celular. Uma vez dentro das células, o corante fica preso nos lisossomos devido à protonação. Os hemócitos de mexilhão, particularmente os granulócitos, apresentam um sistema lisossômico bem desenvolvido; portanto, eles são bem visualizados pela coloração Vermelho Neutro, com o citoplasma rico em vários lisossomos marcados com vermelho e o núcleo (não marcado pelo corante) aparecendo como um buraco translúcido.

Por meio da aplicação do protocolo, dois morfotipos principais de hemócitos podem ser observados de acordo com Udayan et ^al.23: (1) células disseminadas com formato de feijão bipolar e, às vezes, contorno amebóide, e células menores em forma de estrela redonda (células n = 3 e 10). Em ambos os tipos de células, o movimento foi caracterizado por mudanças contínuas de forma, com extensão e retração contínuas de pseudópodes e filopódios.

A aplicação do protocolo permite a avaliação bem-sucedida da motilidade dos hemócitos por meio da construção de gráficos de trajetória, conforme relatado na Figura 2, e do cálculo dos principais parâmetros velocimétricos, como velocidade média e franqueza. Estes corresponderam respectivamente a 6,46 ± 0,2 μm/min e 0,56 ± 0,02 (média ± MEV) para células espalhadas e 5,18 ± 0,34 μm/min e 0,37 ± 0,03 para células pequenas, respectivamente em condições fisiológicas basais após 30 min de fixação ao fundo do poço. Portanto, o protocolo permite a classificação de diferentes populações de hemócitos com base em parâmetros velocimétricos.

Através da aplicação do protocolo, alterações no parâmetro velocimétrico da motilidade dos hemócitos podem ser detectadas após a exposição a drogas ou poluentes. A Figura 3A-D mostra resultados representativos da exposição in vitro de hemócitos de mexilhão ao paracetamol, que é um dos fármacos liberados no ambiente (PiE) com maior concentração e maiores frequências de detecção em rios de todo o mundo³¹.

De acordo com Udayan et ^al.23, em células controle, foi observado um aumento significativo na velocidade com o tempo em ambos os morfotipos celulares, sugerindo ativação de hemócitos durante a cultura de 24 horas, presumivelmente evocativa da resposta inflamatória induzida experimentalmente por retirada e plaqueamento no ambiente de cultura. Quando as células foram expostas à droga, a ativação da motilidade dos hemócitos foi significativamente reduzida nas células espalhadas (Figura 3A) após 24 h, mas não nas pequenas células redondas (Figura 3C), caracterizada por uma velocidade basal média mais baixa (avaliada no tempo 0). Além disso, o protocolo permitiu a detecção de alterações na trajetória celular após a exposição ao fármaco, conforme indicado pelo aumento significativo da franqueza de pequenas células após 24 h e pela diminuição da franqueza após 1 h de exposição em células espalhadas (Figura 3C,D).

Figura 1: Imagem representativa de lapso de tempo de hemócitos neutros corados de vermelho após 30 min de fixação ao fundo do poço. As células foram coradas com o corante vital Vermelho Neutro pouco antes da avaliação da motilidade. Os movimentos celulares foram monitorados por microscopia óptica a uma taxa de uma imagem a cada minuto por 10 min sob aumento de 20x. Para resumir, os painéis A, B e C exibem três dos 11 quadros capturados da mesma região de interesse (ROI) em 0 min, 5 min e 10 min. As mesmas células são numeradas em todas as três figuras para ilustrar seu movimento, e as setas indicam os intervalos de tempo. As barras de escala representam 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Gráfico de trajetória representativa de hemócitos de M. galloprovincialis . As trajetórias mostradas vêm de um único poço. As trajetórias de 25 células são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Efeito da exposição ao paracetamol (24 h) na velocidade e franqueza das células espalhadas (A, B) e pequenas células redondas em forma de estrela (C, D). Os dados são expressos como média ± EPM. A significância estatística dos dados foi avaliada por ANOVA one-way e pós-teste de Tukey. *p < 0,05 vs. controle (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O protocolo descrito neste trabalho representa um novo método in vitro adequado para a avaliação rápida e sensível da toxicidade de fármacos e poluentes com base na avaliação da motilidade dos hemócitos de M. galloprovincialis e suas alterações. A motilidade é um aspecto peculiar da função imunológica dessas células 21,22,23,37,38, portanto, qualquer alteração na motilidade celular pode pressagiar alterações na função imunológica dessas células. A motilidade é uma função celular essencial que integra vários processos celulares, como adesão celular, sinalização celular, atividade do citoesqueleto, sinalização intracelular e regulação do volume celular, e requer a integração e coordenação de sinais bioquímicos e biomecânicos complexos 39,40,41 . Cada um desses processos ou os componentes de cada processo podem ser alvos potenciais da ação tóxica de drogas e poluentes. Portanto, alterações na motilidade na velocidade e/ou trajetória celular representam desfechos sensíveis integrando os efeitos em múltiplos alvos celulares.

O protocolo é adequado para a avaliação in vitro dos efeitos das substâncias em estudo, quer em ensaios de curta duração (com duração de 1-4 h) quer em ensaios de exposição prolongada, com duração de 24-48 h, permitindo uma rápida triagem de poluentes e drogas para potenciais efeitos tóxicos. Ao usar uma placa de 96 poços, o método facilita o teste simultâneo de várias substâncias ou concentrações variadas de uma única substância, economizando tempo e reagentes. Além disso, o protocolo também pode ser adaptado para ser usado com outros equipamentos, como microscópio de contraste de fase ou microscópio fluorescente. Nesse caso, as células podem ser visualizadas sem qualquer mancha ou usando corantes vitais fluorescentes.

Embora o método ofereça alternativas novas e sensíveis para a triagem toxicológica, algumas limitações do método devem ser consideradas para aplicações mais amplas. Primeiro, um aspecto crítico da aplicação do protocolo é a temperatura. Sabe-se que os hemócitos de mexilhão são sensíveis às mudanças de temperatura. Os efeitos da temperatura sobre os hemócitos são complexos, com altas e baixas temperaturas impactando negativamente suas funções imunológicas 42,43,44. Conforme observado durante a configuração do método, a fase crítica relativa ao efeito da temperatura na motilidade celular é a fase preliminar de colheita, adesão e cultivo de células no substrato, que precisa seguir a temperatura de aclimatação dos organismos. Aumentos de temperatura de alguns graus durante esta primeira fase acima da temperatura de aclimatação podem ser críticos para adquirir a forma e a motilidade da célula espalhada. Portanto, recomenda-se uma temperatura de 15 °C para a cultura de hemócitos. A aquisição da imagem com lapso de tempo para avaliação da motilidade foi feita por 10 min a uma temperatura ambiente de 20 °C. Com base na observação preliminar durante a configuração do método, a exposição das células cultivadas para este intervalo de tempo a 20 ° C não altera significativamente a motilidade dos hemócitos. Outra limitação do método envolve o rastreamento manual de hemócitos, que pode introduzir variabilidade dependente do usuário e exigir tempo e atenção significativos aos detalhes. No entanto, o uso do corante vital vermelho neutro melhora a visualização das células e, por sua vez, o rastreamento celular por meio da visualização do sistema lisossômico bem desenvolvido. O núcleo não é corado pelo corante e aparece como um orifício vazio que é facilmente reconhecível e facilmente apontado durante o rastreamento manual da célula. Outra limitação do método está relacionada à sua natureza in vitro. Embora a condição in vitro forneça um ambiente controlado para avaliar a motilidade, ela pode não replicar totalmente as interações e respostas complexas que ocorrem in vivo, particularmente nas respostas imunes de todo o organismo.

Nos últimos anos, novas abordagens e metodologias passaram a ser de uso comum nas ciências da vida, com o objetivo de melhorar os resultados e reduzir a dependência de testes em animais⁴⁵. O protocolo oferece um teste sensível alternativo para triagem in vitro dos efeitos e mecanismos de ação de poluentes e drogas para rastrear rapidamente os efeitos toxicológicos de contaminantes químicos presentes, individualmente ou em misturas, em matrizes ambientais. Ele se concentra em um novo ponto final, a motilidade das células do sistema imunológico, que pode fornecer uma resposta integrada aos efeitos toxicológicos exercidos por drogas e poluentes em vários alvos celulares. Nesse sentido, amplia a gama de testes in vitro disponíveis na literatura, também sob a ótica de uma abordagem integrada de múltiplos ensaios para aplicação em biomonitoramento ambiental. Algumas características do protocolo o alinham com os critérios dos 3R's (Substituição, Redução e Refinamento), contribuindo para a redução de testes em animais in vivo em vertebrados e para o desenvolvimento de ensaios de toxicidade de exposição toxicológica e ecotoxicológica mais éticos e eficientes. Essas características incluem a fácil coleta de hemolinfa de mexilhões de forma pouco invasiva, a pequena quantidade de hemolinfa necessária para o teste e o uso de uma placa multipoços, que permite a exposição simultânea de múltiplas concentrações tóxicas e réplicas, oferecendo economia significativa de tempo e reagentes.

Os autores não têm nada a divulgar.

Esta pesquisa foi financiada pelo projeto "Dipartimento di Eccellenza" concedido ao DiSTeBA pelo Ministério Italiano da Universidade e Pesquisa, CUP: F85D18000130001, e pelo NBFC (National Biodiversity Future Center) financiado pela União Europeia NextGenerationEU, PNRR, projeto n. CN00000033. Agradecemos também a infraestrutura BIOforIU no Departamento de Ciências e Tecnologias Biológicas e Ambientais da Universidade de Salento.