JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقترح المقالة طريقة جديدة في المختبر للتقييم السريع والحساس لسمية والسمية البيئية للملوثات ، بناء على حركة الخلايا الدموية Mytilus galloprovincialis . تهدف الطريقة إلى المساهمة في تطوير اختبارات التعرض السمية والسمية البيئية الأكثر أخلاقية وحساسية.

Abstract

الخلايا الدموية هي الخلايا المختصة بالمناعة المنتشرة في الرخويات ذات الصدفتين وتلعب دورا رئيسيا في العديد من الوظائف المهمة للمناعة الفطرية بوساطة الخلية. خلال المراحل المبكرة من الاستجابة المناعية ، تهاجر الخلايا الدموية بنشاط إلى موقع الإصابة. هذه الحركة المتأصلة هي سمة أساسية لهذه الخلايا. إنه يمثل وظيفة خلوية رئيسية تدمج عمليات متعددة ، مثل التصاق الخلية ، وإشارات الخلية ، وديناميكيات الهيكل الخلوي ، والتغيرات في حجم الخلية. لذلك ، يمكن أن تكون التغيرات في حركة الخلايا بعد التعرض للأدوية أو الملوثات بمثابة نقطة نهاية سمية مفيدة. على الرغم من الدور الأساسي لحركة الخلية في علم وظائف الأعضاء الخلوي ، فقد تم التحقيق فيه بشكل سيئ من منظور السمية. يقترح هذا العمل طريقة جديدة في المختبر للتقييم السريع والحساس لسمية الملوثات والسمية البيئية ، بناء على تقييم حركة الخلايا الدموية ل Mytilus galloprovincialis. قمنا بتطوير اختبار حركة الخلية على الخلايا الدموية الملتصقة بقاع صفيحة البوليسترين المكونة من 96 بئرا. بعد التعرض لتركيزات متزايدة من الأدوية ، تم قياس مسارات الخلايا والسرعات عن طريق تتبع الخلايا تحت الفحص المجهري بفاصل زمني ، مما يسمح لنا بقياس التأثيرات على حركة الخلايا الدموية. نظرا لسهولة جمع الخلايا الدموية من بطريقة غير جراحية نسبيا ، تقدم الطريقة المقترحة اختبارا بديلا لفحص آثار وآليات عمل الملوثات والأدوية. إنه يتماشى مع معايير 3Rs (الاستبدال والتقليل والصقل) ، ويعالج المخاوف الأخلاقية ويساهم في تقليل الفقاريات في الجسم الحي للتجارب على.

Introduction

تمثل الأساليب القائمة على التأثير ، مثل المقايسات الحيوية في المختبر وفي الجسم الحي ، أدوات مبتكرة للكشف عن آثار الملوثات الكيميائية البيئية في الكائنات الحية ولاستخدامها كأدوات في الرصد البيئي وتقييم المخاطر1 ، 2 ، 3 ، 4. إنها تكمل النهج الكيميائي التحليلي الكلاسيكي من خلال التغلب على بعض قيوده. على سبيل المثال ، يمكن للطرق القائمة على التأثير تقييم التوافر البيولوجي للملوثات ، وتأثيرها على صحة الكائن الحي ، والتأثيرات السمية المشتركة للمخاليط. قد لا يمكن التنبؤ بهذه التأثيرات المجمعة بناء على التحليل الكيميائيفقط 5.

في السنوات الأخيرة ، يمثل علم السموم البيئية للملوثات الناشئة (الملوثات الناشئة) مجالا يمكن أن تكون فيه الأساليب القائمة على التأثير أدوات مفيدة للكشف عن التعرض وتقييم التأثير على الكائنات الحية1،5،6،7. تستخدم العديد من الطرق القائمة على التأثير الرخويات ذات الصدفتين ككائنات اختبار في المراقبة والتقييم البيئي8،9. بعض الخصائص تجعل هذه الكائنات مناسبة لدراسات السمية الإيكولوجية ، مثل توزيعها الواسع ، وطبيعتها للتغذية بالترشيح ، وأسلوب حياتها اللاطئا ، والقدرة على التراكم الأحيائي لمجموعة واسعة من الملوثات البيئية وتطوير استجابات قابلة للكشف للملوثات ، وإمكانية العمل مع مراحل الحياة المختلفة ، والمحافظة عليها في ظروف المختبر7. إنها حساسة للغاية للتعرض للتلوث وتظهر مجموعة متنوعة من الاستجابات للملوثات السامة اعتمادا على الأنواع ومرحلة الحياة والظروف البيئية8،9،10. لذلك ، تستخدم العديد من الإرشادات البيئية الأنواع ذات الصدفتين كأنواع اختبار موحدة10،11.

من بين الرخويات ذات الصدفتين ، يعد Mytilus galloprovincialis المنتشر أحد أكثر الأنواع استخداما في مجال السمية البيئية نظرا لقدرته على تطوير استجابات مبكرة يمكن اكتشافها للتعرض للتلوث الكيميائي ، بما في ذلك تحريض الميتالوثيونين ، وتغيير الإنزيم المضاد للأكسدة ، وزعزعة استقرار الغشاء الليزوزومي ، وبيروكسيد الدهون ، وتراكم الليبوفوسين ، وزيادة تواتر النوى الدقيقة ، وتحريض أنهيدراز الكربوني12،13،14 ، 15. تستخدم الخلايا الدموية ، وهي الخلايا الدموية ذات الكفاءة المناعية ، على نطاق واسع لدراسة الآثار السمية للملوثات البيئية في الرخويات ذات الصدفتين4،13،16،17. هذه الخلايا ضرورية للاستجابة المناعية للكائن الحي ، حيث تقوم بالعديد من الوظائف المهمة للمناعة الفطرية بوساطة الخلية. وتشمل هذه القضاء على الميكروبات من خلال البلعمة والتفاعلات السامة للخلايا المختلفة ، مثل إطلاق الإنزيمات الليزوزومية ، والببتيدات المضادة للميكروبات ، وإنتاج مستقلبات الأكسجين أثناء انفجار الجهاز التنفسي18،19،20. الخلايا الدموية هي خلايا متحركة في جوهرها21،22،23 قادرة على الهجرة إلى موقع العدوى خلال المرحلة المبكرة من الاستجابة المناعية للكائن الحي. بشكل عام ، تعد الحركة سمة أساسية تميز جميع الخلايا المناعية لأنها تمكن من المراقبة المناعية لهذه الخلايا لحماية الجسم24. تظهر الأبحاث عبر أنواع الرخويات المختلفة أن حركة الخلايا الدموية هي عنصر حاسم في استجابتها المناعية والتئام الجروح والتفاعل مع مسببات الأمراض. يتم تنظيم هذه الحركة من خلال مسارات جزيئية محددة ، مما يسلط الضوء على تعقيد وتخصص وظائف الخلايا الدموية في الرخويات21،25،26،27.

على الرغم من الأهمية الأساسية للحركة في فسيولوجيا الخلايا الدموية ، فقد حقق عدد قليل جدا من الدراسات في حساسية حركة الخلايا الدموية للملوثات الكيميائية البيئية23،28،29،30. في الآونة الأخيرة ، تميزت مجموعتنا بالحركة العفوية للخلايا الدموية Mytilus galloprovincialis في صفيحة دقيقة من البوليسترين 96 بئر معالجة بزراعة الأنسجة وفحصت حساسية حركة الخلايا الدموية للتعرض في المختبر للباراسيتامول23. M. galloprovincialis أظهرت الخلايا الدموية حركة خلية شبيهة بالعشوائية تعتمد على lamellipodia وتغيرات سريعة في الشكل ، كما هو موجود سابقا في أنواع أخرى من بلح البحر ، Mytilus edulis21،22،23،28 ، وتم وصفها بالفعل في الخلايا المناعية البشرية31. ثبت مؤخرا أن حركة الخلايا الدموية حساسة للضغوطات الكيميائية23،28. بناء على هذه النتائج السابقة ، يقترح هذا العمل طريقة جديدة في المختبر للتقييم السريع والحساس لسمية والسمية البيئية للملوثات بناء على تقييم حركة M. galloprovincialis الخلايا الدموية وتغييراتها ، من خلال تحليل السرعة لحركة الخلية (القياس الكمي لمتوسط السرعة ، والمسافة المهاجرة ، والمسافة الإقليدية ، والمباشرة). توفر هذه الطريقة إمكانية فحص سمية العديد من المواد في المختبر إما في فحوصات قصيرة المدى (تستمر من 1 إلى 4 ساعات) أو فحوصات التعرض لفترات طويلة, تستمر 24-48 ساعة.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب بموجب التشريع الإيطالي لرعاية (DL26 / 2014) الذي نفذ توجيه مجلس اللجنة الأوروبية (2010/63 EEC). Mytilus galloprovincialis هو ذوات الصدفتين الذي يتغذى بالترشيح ، والمعروف باسم بلح البحر الأبيض المتوسط. موطنها البحر الأبيض المتوسط وساحل المحيط الأطلسي في جنوب أوروبا. تم تقديمه وهو منتشر على نطاق واسع في غرب أمريكا الشمالية وآسيا وجنوب إفريقيا. إنه نوع مهم من مصايد الأسماك التجارية في عدة أجزاء من العالم. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير مياه البحر الاصطناعية (ASTM) أو مياه البحر الطبيعية المفلترة

  1. لتحضير مياه البحر الاصطناعية ASW وفقا ل ASTM D1141-98 (2021) 32 ، قم بإذابة الأملاح التالية في الماء المقطر (جم لمدة 1 لتر): 27.65 كلوريد الصوديوم ، 0.133 NaHCO3 ، 3.33 MgCl2 · 6H2O ، 2.66 Na2SO4 ، 0.733 CaCl2 · 2H2O ، 0.466 كيلو متر ، 0.067 كيلوبايت ، 0.02 ساعة3بو3 ، 0.013 SrCl2 ·6H2O ، 0.0019 NaF. يحتوي محلول ASW على درجة حموضة 7.80.
  2. لتحضير مياه البحر الطبيعية المفلترة (FSW) ، قم بتصفية مياه البحر الطبيعية 37 PSU ، التي تم جمعها من موقع لا يتأثر بالأنشطة البشرية المنشأ باستخدام مرشحات 0.2 ميكرومتر.

2. التأقلم الحيواني

  1. تأقلم عينات بلح البحر البالغة (Mytilus galloprovincialis Lam.) لمدة 24 ساعة في خزانات ثابتة (في حالة الجوع) تحتوي على ASW أو FSW هوائي (1 لتر /) عند 15 درجة مئوية في غرفة ثرموستاتي قبل الاستخدام التجريبي.

3. تحضير الكاشف لتقييم حركة الخلايا الدموية

  1. تحضير مياه البحر المفلترة (FSW) على النحو الوارد أعلاه أو المحلول الملحي الفسيولوجي القياسي (SPS). قم بإذابة HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازين-حمض إيثان سلفونيك) 4.77 جم ، كلوريد الصوديوم 25.48 جم ، MgSO4 13.06 جم ، KCl 0.75 جم ، CaCl2 1.47 جم في حوالي 800 مل من الماء المقطر ، ثم يصنع حتى 1 لتر بإضافة المزيد من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.36 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
  2. تحضير محلول مخزون أحمر محايد بمقدار 20 مجم / مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
  3. تحضير محلول تلطيخ أحمر محايد: أضف 5 ميكرولتر من محلول المرق الأحمر المحايد إلى 995 ميكرولتر من FSW أو SPS.
  4. تحضير FSW أو SPS مكمل ب 2 ملي مولار من L-glutamine و 40 وحدة دولية / مل بنسلين G و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين على النحو التالي: أضف 100 ميكرولتر من 2 ملي مولار من L-glutamine و 100 ميكرولتر من مزيج البنسلين / الستربتومايسين إلى 10 مل من FSW / SPS.
  5. تحضير 0.4٪ تريبان بلو في FSW أو SPS.
    ملاحظة: تم إعداد محلول مخزون أحمر محايد وفقا ل Martínez-Gómez et al.33. يدوم محلول المرق الأحمر المحايد لمدة 2-3 أسابيع عند تخزينه عند 4 درجات مئوية. يجب تحضير محلول تلطيخ أحمر محايد و 0.4٪ تريبان بلو قبل الفحص مباشرة.

4. أخذ عينات الهيموليمف

  1. املأ المحقنة مسبقا ب 0.5 مل من مياه البحر المفلترة FSW أو محلول ملحي فسيولوجي قياسي SPS (عند 15 درجة مئوية).
  2. قم بفصل الصمامات قليلا وبعناية على طول السطح البطني بمشرط. حافظ على المشرط في موضعه أو استخدم طرف الماصة. اسمح لإبرة حقنة تحت الجلد بالدخول إلى الفراغ بين الصمامات.
  3. اجمع برفق 0.5 مل من الهيموليمف من العضلة المقربة الخلفية باستخدام المحقنة المعبأة مسبقا وفقا لمعيار UNEP / RAMOGE34.
  4. قم بإزالة الإبرة من المحقنة وانقل محتويات المحقنة إلى أنبوب صغير.
  5. اجمع الهيموليمف من 3-4 بلح البحر وقم بتجميع عينات الهيموليمف معا في أنبوب عند 15 درجة مئوية باستخدام نفس النسبة بين الأفراد.
    ملاحظة: يتم استخدام الملء المسبق للحقنة لتخفيف الهيموليمف 1: 1 على الفور أثناء أخذ العينات. يستخدم تخفيف الهيموليمف باستخدام FSW أو SPS بنسبة 50:50 بشكل شائع لمنع تراكم الخلايا الدموية ، وفقا ل Martínez-Gómez et al.33.

5. طلاء الخلايا الدموية والثقافة

  1. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
  2. تمييع الهيموليمف بتركيز 1 × 106 خلايا / مل مع FSW أو SPS.
  3. قم بتقييم جدوى الخلايا الدموية في التعليق عن طريق تلطيخ Trypan الأزرق: أضف 100 ميكرولتر من 0.4٪ Trypan Blue المذاب في FSW أو SPS إلى 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا الدموية. احتضن لمدة 5 دقائق عند 15 درجة مئوية.
  4. بعد ذلك ، أضف قطرة من التعليق في مقياس الدم واحسب الخلايا غير الملوثة (القابلة للحياة) والملطخة (غير القابلة للحياة) تحت المراقبة المجهرية.
  5. قم بتقييم صلاحية الخلايا الدموية كنسبة مئوية للخلايا القابلة للحياة محسوبة على العدد الإجمالي للخلايا المحسوبة35.
  6. استخدم الصيغة التالية لتقييم بقاء الخلية35:
    الخلايا القابلة للحياة (٪) = [عدد الخلايا القابلة للحياة / العدد الإجمالي للخلايا (قابلة للحياة + غير قابلة للحياة)] × 100
  7. تأكد من أن صلاحية الخلايا الدموية يجب أن تكون أعلى من 95٪ للمضي قدما في البروتوكول.
  8. أضف 50 ميكرولتر من الهيموليمف المخفف في كل بئر من مزرعة الخلية 96 بئرا من البوليسترين المسطح القاع المعالج ب TC. غطي الطبق بغطاءه.
  9. اسمح للخلايا الدموية بالالتصاق بقاع الآبار لمدة 30 دقيقة عند 15 درجة مئوية لتشكيل طبقة أحادية.
  10. قم بإزالة الهيموليمف الزائد عن طريق الشفط برفق باستخدام ماصة دقيقة.

6. الفحص قصير المدى

  1. بالنسبة للمقايسات قصيرة المدى (في غضون 1-4 ساعات) ، احتضان الخلايا الملتصقة بقاع الآبار على الفور ب 100 ميكرولتر من المادة ذات الأهمية التي تم حلها في FSW أو SPS بتركيزات مختلفة عند 15 درجة مئوية. استخدم ثلاثة آبار على الأقل لثلاثة تحديدات مكررة لكل حالة تجريبية.
  2. بعد الحضانة ، قم بتقييم حركة الخلية باتباع الخطوة 8.

7. فحص التعرض لفترات طويلة

  1. بالنسبة للتعرض لفترات طويلة ، أي فحوصات التعرض لمدة 24-48 ساعة ، احتضان الخلايا الملتصقة المزروعة بتركيزات متزايدة من مادة الاختبار المذابة في وسط المزرعة (FSW أو ASW) مكملة ب 2 ملي مولار L-glutamine 40 وحدة دولية / مل البنسلين G و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) عند 15 درجة مئوية. استخدم ثلاثة آبار على الأقل لثلاثة تحديدات مكررة لكل حالة تجريبية.
  2. بعد الحضانة ، قم بتقييم حركة الخلية باتباع الخطوة 8.

8. تقييم حركة الخلية عن طريق الفحص المجهري بفاصل زمني

  1. أدخل اللوحة متعددة الآبار التي تحتوي على الخلايا الدموية الحية الملتصقة في قارئ متعدد الأوضاع.
  2. قم بتقييم حركة الخلايا الحية الملتصقة عن طريق التصوير في الوقت الفعلي على اللوحة من خلال الفحص المجهري بفاصل زمني: التقط صورا لنفس منطقة الاهتمام (ROI) (أبعاد عائد الاستثمار المستخدم: 720 ميكرومتر × 720 ميكرومتر) في كل بئر بمعدل صورة واحدة كل دقيقة واحدة لمدة 10 دقائق باستخدام القارئ متعدد الأوضاع تحت تكبير 20x وتصور المجال الساطع اللوني.
  3. للحصول على تصور أفضل للخلايا الدموية ، قم بتلطيخ الخلايا بالصبغة الحيوية Neutral Red قبل الفحص المجهري بفاصل زمني على النحو التالي:
    1. قم بإزالة وسط الحضانة من كل بئر.
    2. أضف 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ أحمر محايد مذاب في محلول ملحي فسيولوجي قياسي يحتوي على المادة ذات الأهمية في آبار الصفيحة التي تحتوي على الخلايا الملتصقة.
    3. احتضان الخلايا عند 15 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اغسل الصبغة الزائدة.
    4. أضف 100 ميكرولتر من المادة ذات الأهمية التي تم حلها في FSW أو SPS. تصور الخلايا لتقييم الحركة.
      ملاحظة: يسمح استخدام قارئ متعدد الأوضاع بالحصول على الصور في وقت واحد من عدد كبير من الآبار، مما يسمح بالكشف المتزامن عن الحركة لجميع الظروف التجريبية والتكرارات الموجودة في البئر. يتم الاحتفاظ بالصبغة الحمراء المحايدة داخل الجسيمات الحالة ، والتي تظهر على شكل بقع برتقالية صغيرة في السيتوبلازم ، بينما تظهر النواة كثقب شفاف لأن الصبغة الحيوية الحمضية لا تلطخها. تم الحصول على الصورة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة 20 درجة مئوية.

9. تتبع الخلية وحساب المعلمات السرعية

  1. قم بتحليل إطارات نفس منطقة الاهتمام المكتسبة تحت الفحص المجهري بفاصل زمني بواسطة الصورة J لكل بئر.
  2. احفظ الصور في مجلد بدون مسافات في الاسم. يمكن أن تكون الصور إما بتنسيق JPEG أو PNG.
  3. افتح ImageJ. انقر فوق ملف > استيراد > تسلسل الصور.
  4. قم بإجراء تتبع الخلايا على الخلايا المفردة باستخدام المكون الإضافي Manual Tracking في ImageJ. يتم تمييز مواضع الخلايا الفردية في صور متتالية ، مما يسمح بتتبع التغييرات الموضعية بمرور الوقت.
  5. قم بتحليل ما لا يقل عن 40 خلية لكل بئر ، باستثناء الخلايا التي تهرب من الحقل المسجل من التحليل.
  6. قم باستيراد مجموعات البيانات من المكون الإضافي ImageJ ، "التتبع اليدوي" ، إلى برنامج Chemotaxis و Migration Tool المتاح مجانا.
  7. قم بتحديد المعلمات السرعية مثل متوسط السرعة والمسافة الإقليدية والمسافة المهاجرة والمباشرة باستخدام برنامج Chemotaxis and Migration Tool وفقا للتعليمات التفصيلية الواردة في دليل المستخدم المتاح مجانا للبرنامج36أو الخطوات الواردة أدناه:
    1. قم باستيراد مجموعات البيانات من المكون الإضافي ImageJ "التتبع اليدوي" إلى برنامج Chemotaxis and Migration Tool.
    2. حدد العدد المطلوب من الشرائح (على سبيل المثال ، عدد الصور المستخدمة للتتبع).
    3. قم بمعايرة البرنامج عن طريق تعيين حجم البكسل x / y والفاصل الزمني. تشير معايرة x/y إلى طول حافة البكسل بالميكرومتر، بينما يمثل الفاصل الزمني المدة بين كل شريحة.
    4. بعد ضبط القيم والمعلمات ، انقر فوق تطبيق الإعدادات.
    5. رسم المسارات وتصديرها كصورة. انقر فوق الزر "القيم المقاسة " لرؤية القيم المقاسة. احفظه.
    6. انقر فوق الزر "إحصائيات " واحفظ سرعة ومباشرة سلسلة المسار.
  8. قارن بين معلمات قياس السرعة المحسوبة لخلايا التحكم مع تلك الموجودة في الخلايا الدموية المعرضة لمادة الاختبار بتركيزات مختلفة.
    ملاحظة: تشير المسافة المهاجرة (المقاسة بالميكرومتر) إلى طول مسار الهجرة خلال فترة المراقبة (10 دقائق). تمثل المسافة الإقليدية (تقاس أيضا بالميكرومتر) مسافة الخط المستقيم بين نقطة البداية ونقطة نهاية الخلية. يتم حساب متوسط السرعة (معبرا عنها بالميكرومتر دقيقة -1) على أنها نسبة المسافة المهاجرة إلى مدة تتبع الخلية لكل خلية. يتم تعريف المباشرة على أنها نسبة المسافة الإقليدية إلى المسافة المتراكمة لكل مسار.

النتائج

تقدم الدراسة طريقة جديدة في المختبر لتقييم سمية وسمية الملوثات بسرعة وحساسية ، باستخدام حركة الخلايا الدموية Mytilus galloprovincialis. يوضح الشكل 1A-C تصويرا تمثيليا بفاصل زمني للخلايا الدموية بعد 30 دقيقة من التعلق بقاع البئر. تم تلطيخ الخلايا الموجودة في الشكل باللون الأحمر المحايد قبل تقييم الحركة. تمت مراقبة حركات الخلايا باستخدام الفحص المجهري البصري بمعدل صورة واحدة كل دقيقة لمدة 10 دقائق ، أقل من 20x ، مع قارئ متعدد الأوضاع. يعرض الشكل 1A-C ثلاثة من 11 إطارا تم التقاطها من نفس منطقة الاهتمام (ROI) في 0 دقيقة و 5 دقائق و 10 دقائق. يتم ترقيم نفس الخلايا في جميع الأشكال الثلاثة لتسليط الضوء على حركتها ، ويظل الترقيم متسقا عبر الأشكال لتوضيح مساراتها بوضوح.

تظهر الخلايا حركات خلية واحدة بناء على نشاط الصفيحة والأرجل والتغييرات السريعة في الشكل. تم تصنيف الخلايا بالصبغة الحيوية أحمر محايد لتحسين تصورها أثناء التتبع. الأحمر المحايد هو صبغة موجبة برمائية وضعيفة يمكن أن تتخلل بسهولة غشاء الخلية. بمجرد دخولها إلى الخلايا ، تصبح الصبغة محاصرة في الجسيمات الحالة بسبب البروتون. تظهر خلايا دموية بلح البحر ، وخاصة الخلايا المحببة ، نظاما ليزوزوميا متطورا. لذلك ، يتم تصورها جيدا من خلال تلطيخ أحمر محايد ، حيث يظهر السيتوبلازم الغني بالعديد من الجسيمات الحالة ذات العلامات الحمراء والنواة (غير المميزة بالصبغة) كثقب شفاف.

من خلال تطبيق البروتوكول ، يمكن ملاحظة نوعين رئيسيين من أشكال الخلايا الدموية وفقا ل Udayan et al.23: (1) انتشار الخلايا ذات شكل حبة ثنائية القطب وأحيانا مخطط أميبويد ، وخلايا أصغر على شكل نجمة مستديرة (الخلايا n = 3 و 10). في كلا النوعين من الخلايا ، تميزت الحركة بتغييرات مستمرة في الشكل ، مع استمرار التمديد والتراجع للكاذب والخيوط.

يسمح تطبيق البروتوكول بالتقييم الناجح لحركة الخلايا الدموية عن طريق إنشاء مخططات المسار ، كما هو موضح في الشكل 2 ، وحساب معلمات قياس السرعة الرئيسية مثل متوسط السرعة والمباشرة. تتوافق هذه على التوالي مع 6.46 ± 0.2 ميكرومتر / دقيقة و 0.56 ± 0.02 (متوسط ± SEM) للخلايا المنتشرة و 5.18 ± 0.34 ميكرومتر / دقيقة و 0.37 ± 0.03 للخلايا الصغيرة ، على التوالي في ظل الظروف الفسيولوجية القاعدية بعد 30 دقيقة التعلق بقاع البئر. لذلك ، يسمح البروتوكول بتصنيف مجموعات الخلايا الدموية المختلفة بناء على معلمات السرعة.

من خلال تطبيق البروتوكول ، يمكن الكشف عن التغيرات في المعلمة السرعية لحركة الخلايا الدموية بعد التعرض للأدوية أو الملوثات. يوضح الشكل 3A-D النتائج التمثيلية للتعرض المختبري لخلايا دموية بلح البحر للباراسيتامول ، وهو أحد الأدوية التي يتم إطلاقها في البيئة (PiE) بأعلى تركيز وأعلى ترددات الكشف في الأنهار في جميع أنحاء العالم31.

وفقا ل Udayan et al.23 ، في خلايا التحكم ، لوحظت زيادة كبيرة في السرعة بمرور الوقت في كلا الأنماط الشكلية للخلايا ، مما يشير إلى تنشيط الخلايا الدموية خلال 24 ساعة ، مما يفترض أنه يستحضر الاستجابة الالتهابية التي يسببها الانسحاب والطلاء في بيئة الاستزراع. عندما تعرضت الخلايا للدواء ، انخفض تنشيط حركة الخلايا الدموية بشكل كبير في الخلايا المنتشرة (الشكل 3 أ) بعد 24 ساعة ولكن ليس في الخلايا المستديرة الصغيرة (الشكل 3 ج) ، والتي تتميز بمتوسط سرعة قاعدية أقل (كما تم تقييمه في الوقت 0). بالإضافة إلى ذلك ، سمح البروتوكول بالكشف عن تغيرات مسار الخلية بعد التعرض للأدوية ، كما يتضح من الزيادة الكبيرة في مباشرت الخلايا الصغيرة بعد 24 ساعة وانخفاض المباشرة بعد التعرض لمدة ساعة واحدة في الخلايا المنتشرة (الشكل 3C ، D).

figure-results-3814
الشكل 1: تصوير بفاصل زمني تمثيلي للخلايا الدموية المحايدة الملطخة باللون الأحمر بعد 30 دقيقة من التعلق بقاع البئر. تم تلطيخ الخلايا بالصبغة الحيوية Neutral Red قبل تقييم الحركة. تمت مراقبة حركات الخلايا باستخدام الفحص المجهري البصري بمعدل صورة واحدة كل دقيقة لمدة 10 دقائق تحت تكبير 20x. للإيجاز، تعرض اللوحات A وB وC ثلاثة من 11 إطارا تم التقاطها من نفس منطقة الاهتمام (ROI) في 0 دقيقة و5 دقائق و10 دقائق. يتم ترقيم نفس الخلايا في جميع الأشكال الثلاثة لتوضيح حركتها ، وتشير الأسهم إلى الفترات الزمنية. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4745
الشكل 2: مخطط المسار التمثيلي ل M. galloprovincialis الخلايا الدموية. تأتي المسارات الموضحة من بئر واحد. يتم عرض مسارات 25 خلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5227
الشكل 3: تأثير التعرض للباراسيتامول (24 ساعة) على سرعة ومباشرة الخلايا المنتشرة (A ، B) والخلايا الصغيرة المستديرة على شكل نجمة (C ، D). يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM. تم تقييم الدلالة الإحصائية للبيانات عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه والاختبار اللاحق لتوكي. * ص < 0.05 مقابل التحكم (ص < 0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يمثل البروتوكول الموصوف في هذا العمل طريقة جديدة في المختبر مناسبة للتقييم السريع والحساس لسمية الأدوية والملوثات بناء على تقييم حركة M. galloprovincialis الخلايا الدموية وتغييراتها. الحركة هي جانب غريب من الوظيفة المناعية لهذهالخلايا 21،22،23،37،38 ، وبالتالي فإن أي تغيير في حركة الخلية قد ينذر بتغيرات في الوظيفة المناعية لهذه الخلايا. الحركة هي وظيفة خلوية أساسية تدمج العديد من العمليات الخلوية ، مثل التصاق الخلية ، وإشارات الخلية ، ونشاط الهيكل الخلوي ، والإشارات داخل الخلايا ، وتنظيم حجم الخلية ، وتتطلب تكامل وتنسيق الإشارات الكيميائية الحيوية والميكانيكية الحيويةالمعقدة 39،40،41. يمكن أن تكون كل عملية من هذه العمليات أو مكونات كل عملية أهدافا محتملة للعمل السام للأدوية والملوثات. لذلك ، تمثل التغيرات في الحركة سواء في سرعة الخلية و / أو المسار نقاط نهاية حساسة تدمج التأثيرات على أهداف خلوية متعددة.

البروتوكول مناسب للتقييم المختبري لتأثيرات مواد الاختبار إما في فحوصات قصيرة الأجل (تستمر من 1 إلى 4 ساعات) أو فحوصات التعرض لفترات طويلة ، والتي تستمر من 24 إلى 48 ساعة ، مما يتيح الفحص السريع للملوثات والأدوية بحثا عن الآثار السامة المحتملة. باستخدام صفيحة 96 بئرا ، تسهل الطريقة الاختبار المتزامن لمواد متعددة أو تركيزات متفاوتة لمادة واحدة ، وبالتالي توفير الوقت والكواشف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تكييف البروتوكول لاستخدامه مع معدات أخرى ، مثل مجهر تباين الطور أو مجهر الفلورسنت. في هذه الحالة ، يمكن تصوير الخلايا دون أي وصمة عار أو باستخدام الأصباغ الحيوية الفلورية.

في حين أن الطريقة تقدم بدائل جديدة وحساسة للفحص السمي ، يجب مراعاة بعض قيود الطريقة للتطبيقات الأوسع. أولا ، أحد الجوانب المهمة لتطبيق البروتوكول هو درجة الحرارة. من المعروف أن خلايا بلح البحر حساسة للتغيرات في درجات الحرارة. تأثيرات درجة الحرارة على الخلايا الدموية معقدة ، حيث تؤثر درجات الحرارة المرتفعة والمنخفضة سلبا على وظائفها المناعية42،43،44. كما لوحظ أثناء إعداد الطريقة ، فإن المرحلة الحرجة المتعلقة بتأثير درجة الحرارة على حركة الخلية هي المرحلة الأولية لحصاد الخلايا والالتصاق والزراعة على الركيزة ، والتي تحتاج إلى اتباع درجة حرارة التأقلم للكائنات الحية. يمكن أن تكون الزيادات في درجة الحرارة بمقدار بضع درجات خلال هذه المرحلة الأولى فوق درجة حرارة التأقلم أمرا بالغ الأهمية لاكتساب شكل الخلية المنتشرة وحركتها. لذلك ، يوصى بدرجة حرارة 15 درجة مئوية لزراعة الخلايا الدموية. تم الحصول على صورة بفاصل زمني لتقييم الحركة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة 20 درجة مئوية. بناء على الملاحظة الأولية أثناء إعداد الطريقة ، فإن تعرض الخلايا المستنبتة لهذا الفاصل الزمني عند 20 درجة مئوية لا يغير بشكل كبير حركة الخلايا الدموية. يتضمن القيد الآخر للطريقة التتبع اليدوي للخلايا الدموية ، والذي قد يؤدي إلى تباين يعتمد على المستخدم ويتطلب وقتا طويلا واهتماما بالتفاصيل. ومع ذلك ، فإن استخدام الصبغة الحيوية الحمراء المحايدة يحسن تصور الخلايا ، وبالتالي تتبع الخلايا من خلال تصور النظام الليزوزومي المتطور. لا تلطخ النواة بالصبغة ، وتظهر على شكل ثقب فارغ يمكن التعرف عليه بسهولة ويمكن الإشارة إليه بسهولة أثناء التتبع اليدوي للخلية. يتعلق القيد الآخر للطريقة بطبيعتها في المختبر . في حين أن الحالة في المختبر توفر بيئة خاضعة للرقابة لتقييم الحركة ، إلا أنها قد لا تكرر بشكل كامل التفاعلات والاستجابات المعقدة التي تحدث في الجسم الحي ، لا سيما داخل الاستجابات المناعية للكائن الحي بأكمله.

في السنوات الأخيرة ، أصبحت الأساليب والمنهجيات الجديدة شائعة الاستخدام في علوم الحياة ، بهدف تحسين النتائج وتقليل الاعتماد على التجارب على45. ويقدم البروتوكول اختبارا بديلا حساسا للفحص في المختبر لآثار وآليات عمل الملوثات والعقاقير للفحص السريع للتأثيرات السمية للملوثات الكيميائية الموجودة، سواء بشكل فردي أو في مخاليط، في المصفوفات البيئية. يركز على نقطة نهاية جديدة ، وهي حركة خلايا الجهاز المناعي ، والتي يمكن أن توفر استجابة متكاملة للتأثيرات السمية التي تمارسها الأدوية والملوثات على أهداف خلوية مختلفة. وبهذا المعنى، فإنه يوسع نطاق الاختبارات المختبرية المتاحة في الأدبيات، أيضا من منظور نهج متكامل متعدد الاختبارات للتطبيق في المراقبة البيولوجية البيئية. تتوافق بعض خصائص البروتوكول مع معايير 3R (الاستبدال والتخفيض والتنقيح) ، مما يساهم في تقليل الفقاريات في الجسم الحي على التجريبية وتطوير مقايسة سمية أكثر أخلاقية وكفاءة للتعرض للسموم والسمية البيئية. تشمل هذه الخصائص جمع الهيموليمف السهل من بلح البحر بطريقة منخفضة التوغل ، وكمية صغيرة من الهيموليمف المطلوبة للاختبار ، واستخدام صفيحة متعددة الآبار ، مما يسمح بالتعرض المتزامن لتركيزات متعددة من المواد السامة والتكرارات مما يوفر توفيرا كبيرا في الوقت والكواشف.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل مشروع "Dipartimento di Eccellenza" الممنوح ل DiSTeBA من قبل وزارة الجامعة والبحث الإيطالية ، CUP: F85D18000130001 ، ومن قبل NBFC (المركز الوطني لمستقبل التنوع البيولوجي) الممول من الاتحاد الأوروبي NextGenerationEU ، PNRR ، المشروع ن. CN00000033. نشكر أيضا البنية التحتية ل BIOforIU في قسم العلوم والتقنيات البيولوجية والبيئية بجامعة سالينتو.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm filter (diameter 25 mm)ABLUO labware
2.5 ml hypodermic syringe needdle 22GRays2522CM32labware
96-well flat-bottom polystyrene TC-treated microplateCorning3916labware
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGChemical
Chemotaxis and Migration Tool software (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Equipment: Cell imaging multimode reader
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tube Conical BottomCorning352196labware
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Chemical
Hemocytometer Fast read 102BiosigmaBVS100labware
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500GChemical
ImageJ softwareNIHsoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemical
KClMerk 104936Chemical
L-glutamineMerk (Sigma - Aldrich) G7513Essential amino acid for cell culture medium
MgCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670Chemical
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Chemical
Microscope Nikon Eclipse E600NikonEquipment: Cell imaging 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemical
NaFFluka71519 500gChemical
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGChemical
Neutral RedMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GVital cell dye
Penicillin/StreptomycinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotics for cell culture
SrCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521Chemical
Trypan blue Merk (Sigma - Aldrich) T8154Cell dye

References

  1. Di Paolo, C., et al. Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring. Water Res. 104, 473-484 (2016).
  2. Brack, W., et al. Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality. Environ Sci Eur. 31 (1), 10(2019).
  3. Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies. Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).
  4. Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives. Water. 13 (13), 1847(2021).
  5. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).
  6. Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment. León, V. M., Bellas, J. Chapter 2, Elsevier. Amsterdam. 11-71 (2023).
  7. Lionetto, F., et al. Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies. Nanomaterials. 12 (9), 1560(2022).
  8. Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).
  9. Ogidi, O. I., Onwuagba, C. G., Richard-Nwachukwu, N. Biomonitoring tools, techniques and approaches for environmental assessments. Biomonitoring of Pollutants in the Global South. Izah, S. C., Ogwu, M. C., Hamidifar, H. , Springer. Singapore. (2024).
  10. Rosner, A., et al. A broad-taxa approach as an important concept in ecotoxicological studies and pollution monitoring. Biol Rev. 99 (1), 131-176 (2024).
  11. Gagné, F., Burgeot, T. Bivalves in ecotoxicology. Encyclopedia of Aquatic Ecotoxicology. , 247-258 (2013).
  12. Caricato, R., et al. Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study. Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).
  13. Calisi, A., et al. Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites. Mar Environ Res. 188, 105988(2023).
  14. Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F. Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring. Biomarkers in Marine Organisms. Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. , Elsevier Science. Amsterdam. 29-43 (2001).
  15. Bocchetti, R., et al. Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas. Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).
  16. Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker. Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).
  17. Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects. Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).
  18. Canesi, L., et al. Tyrosine kinase-mediated cell signaling in the activation of Mytilus hemocytes: Possible role of STAT-like proteins. Biol Cell. 95 (9), 603-613 (2003).
  19. Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations. Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).
  20. Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components. Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).
  21. Le Foll, F., et al. Characterization of Mytilus edulis hemocyte subpopulations by single-cell time-lapse motility imaging. Fish Shellfish Immunol. 28 (2), 372-386 (2010).
  22. Rioult, D., Lebel, J. -M., Le Foll, F. Cell tracking and velocimetric parameters analysis as an approach to assess activity of mussel (Mytilus edulis) hemocytes in vitro. Cytotechnology. 65 (5), 749-758 (2013).
  23. Udayan, G., Giordano, M. E., Pagliara, P., Lionetto, M. G. Motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes: Sensitivity to paracetamol in vitro exposure. Aquat Toxicol. 265, 106779(2023).
  24. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  25. Ivanina, A., Falfushynska, H., Beniash, E., Piontkivska, H., Sokolova, I. Biomineralization-related specialization of hemocytes and mantle tissues of the Pacific oyster Crassostrea gigas. J Exp Biol. 220 (18), 3209-3221 (2017).
  26. Furukawa, F., et al. Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai. Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).
  27. Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection. Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).
  28. Gendre, H., et al. Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha. Fish Shellfish Immunol. 139, 108919(2023).
  29. Kaloyianni, M., et al. Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).
  30. Sendra, M., et al. Nanoplastics: From tissue accumulation to cell translocation into Mytilus galloprovincialis hemocytes. Resilience of immune cells exposed to nanoplastics and nanoplastics plus Vibrio splendidus combination. J Hazard Mater. 388, 121788(2020).
  31. Pizzagalli, D. U., Pulfer, A., Thelen, M., Krause, R., Gonzalez, S. F. In vivo motility patterns displayed by immune cells under inflammatory conditions. Front Immunol. 12, 804159(2021).
  32. ASTM D1141-98. Standard Practice for Preparation of Substitute Ocean Water. , (2021).
  33. Martínez-Gómez, C., Bignell, J., Lowe, D. Lysosomal membrane stability in mussels. ICES Techniques in Marine Environmental Sciences. 56, 1-41 (2015).
  34. UNEP/RAMOGE. Manual on the biomarkers recommended for the MED POL Biomonitoring Programme. UNEP. , Athens. (1999).
  35. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  36. Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0 Version 1.1. , (2013).
  37. Wilkinson, J. L., et al. Pharmaceutical pollution of the world's rivers. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (8), e2113947119(2022).
  38. Parisi, M. G., Pirrera, J., La Corte, C. Effects of organic mercury on Mytilus galloprovincialis hemocyte function and morphology. J Comp Physiol B. 191 (1), 143-158 (2021).
  39. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  40. Bailly, M., Condeelis, J. Cell motility: Insights from the backstage. Nat Cell Biol. 4 (5), E292-E294 (2002).
  41. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  42. Mosca, F., et al. Effects of high temperature and exposure to air on mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk 1819) hemocyte phagocytosis: Modulation of spreading and oxidative response. Tissue Cell. 45 (3), 198-203 (2013).
  43. Beaudry, A., et al. Effect of temperature on immunocompetence of the blue mussel (Mytilus edulis). J Xenobiot. 6 (1), 5889(2016).
  44. Wu, F., et al. Combined effects of seawater acidification and high temperature on hemocyte parameters in the thick shell mussel Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 56, 554-562 (2016).
  45. Schmeisser, S., et al. New approach methodologies in human regulatory toxicology - Not if, but how and when. Environ Int. 178, 108082(2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

214 Mytilus Galloprovincialis 3Rs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved