Здесь представлен протокол анализа ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты, с использованием примеров ферментов лигазы, нуклеазы и полимеразы. В анализе используются флуоресцентно меченые и немеченые олигонуклеотиды, которые могут быть объединены для образования дуплексов, имитирующих повреждения РНК и/или ДНК или промежуточные пути, что позволяет охарактеризовать поведение фермента.
Доступность ряда модифицированных синтетических олигонуклеотидов от коммерческих поставщиков позволила разработать сложные анализы для характеристики различных свойств ферментов, метаболизирующих нуклеиновые кислоты, которые могут быть запущены в любой стандартной лаборатории молекулярной биологии. Использование флуоресцентных меток сделало эти методы доступными для исследователей со стандартным оборудованием для электрофореза PAGE и флуоресцентным тепловизором, не используя радиоактивные материалы и не требуя лаборатории, предназначенной для хранения и подготовки радиоактивных материалов, т.е. горячей лаборатории. Необязательное добавление стандартных модификаций, таких как фосфорилирование, может упростить настройку анализа, в то время как специфическое включение модифицированных нуклеотидов, которые имитируют повреждения ДНК или промежуточные продукты, может быть использовано для исследования конкретных аспектов поведения фермента. Здесь демонстрируется разработка и проведение анализов для изучения нескольких аспектов процессинга ДНК ферментами с использованием коммерчески доступных синтетических олигонуклеотидов. К ним относятся способность лигаз присоединяться или нуклеазы разрушать различные гибридные структуры ДНК и РНК, дифференциальное использование кофактора ДНК-лигазой и оценка ДНК-связывающей способности ферментов. Обсуждаются факторы, которые следует учитывать при проектировании синтетических нуклеотидных субстратов, а также приводится базовый набор олигонуклеотидов, которые могут быть использованы для ряда анализов лигазы нуклеиновой кислоты, полимеразы и нуклеазного фермента.
Все формы жизни нуждаются в ферментах, процессирующих нуклеиновые кислоты, для осуществления фундаментальных биологических процессов, включая репликацию, транскрипцию и репарацию ДНК. Ключевыми ферментативными функциями для этих путей являются полимеразы, которые генерируют копии молекул РНК/ДНК, лигазы, которые присоединяются к полинуклеотидным субстратам, нуклеазы, которые разрушают их, а также геликазы и топоизомеразы, которые расплавляют дуплексы нуклеиновых кислот или изменяют их топологию 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Кроме того, многие из этих ферментов обеспечивают необходимые молекулярные инструменты для таких приложений, как клонирование, диагностика и высокопроизводительное секвенирование 11,12,13,14,15.
Функциональные характеристики, кинетика и субстратная специфичность этих ферментов могут быть определены с помощью меченых субстратов ДНК/РНК, полученных путем отжига олигонуклеотидов. Слежение за подложками и продуктами традиционно достигалось путем введения радиоактивной метки (32P) либо на 5'-конце цепи, которая затем может быть обнаружена с помощью фотопленки или с помощью люминофорной системы визуализации16,17. В то время как радиоактивно меченые субстраты обладают повышенной экспериментальной чувствительностью и не изменяют химических свойств нуклеотида, потенциальная опасность для здоровья от работы с радиоизотопами способствовала разработке нерадиоактивных нуклеиновых кислот для обеспечения более безопасной альтернативы для обнаружения ДНК и РНК 18,19,20 . Среди нихнаиболее универсальными являются методы детектирования флуоресценции, в том числе прямое флуоресцентное детектирование, флуоресценция с временным разрешением и анализ переноса энергии/гашения флуоресценции. Обширный массив флуорофоров позволяет создавать различные конструкции субстратов ДНК/РНК с уникальными репортерами на каждом олигонуклеотиде25. Кроме того, стабильность флуорофоров по сравнению с радиоизотопами позволяет пользователям производить и сохранять значительные количества флуоресцентно меченых субстратов ДНК19. Эти меченые флуорофорами субстраты могут быть инкубированы с интересующим белком, а также с различными комбинациями металлических и нуклеотидных кофакторов для анализа связывания и/или активности фермента. Визуализацию связывания или активности можно наблюдать с помощью различных каналов флуорофорных красителей с помощью системы визуализации геля. Поскольку с помощью этого метода будут видны только флуоресцентно меченые олигонуклеотиды, любое увеличение или уменьшение размера меченого олигонуклеотида будет легко проследить. Гели также могут быть окрашены после этого с помощью красителей для окрашивания нуклеиновыми кислотами, чтобы визуализировать все полосы ДНК, присутствующие на геле.
Лигазы полинуклеиновых кислот представляют собой ферменты, которые соединяют фрагменты ДНК/РНК, катализируя герметизацию разрывов путем образования фосфодиэфирной связи между 5'-фосфорилированными концами ДНК и 3'-OH ДНК. Их можно разделить на две группы в зависимости от потребности в нуклеотидном субстрате. Высококонсервативные НАД-зависимые лигазы обнаружены у всех бактерий26, в то время как структурно разнообразные АТФ-зависимые ферменты могут быть идентифицированы во всех областях жизни 8,27. ДНК-лигазы играют важную роль в процессинге фрагментов Оказаки во время репликации, а также участвуют в различных путях репарации ДНК, таких как репарация нуклеотидов и эксцизионная репарация оснований, путем герметизации спонтанных зазубрин и зазубрин, которые остаются после репарации 8,10. Различные ДНК-лигазы демонстрируют различную способность присоединяться к различным конформациям разрывов ДНК, включая зазубрины в дуплексе, двухцепочечные разрывы, несоответствия и разрывы, а также гибриды РНК и ДНК 28,29,30. Разнообразный спектр лигабельных субстратов может быть собран путем отжига олигонуклеотидов с 5'-фосфатом для получения сопоставленных 5' и 3' концов в дуплексе нуклеиновых кислот 31,32,33. Наиболее распространенным методом анализа является разрешение мочевиной PAGE в формате анализа конечной точки; Тем не менее, последние инновации включают использование электрофореза в капиллярном геле, который обеспечивает высокую пропускнуюспособность34, масс-спектрометрическое профилирование35, а также гомогенный молекулярный анализ маяков, который позволяет проводить мониторинг с временным разрешением36.
Первым этапом реакции лигирования является аденилирование фермента лигазы аденозинтрифосфатом (АТФ) или никотинамидадениндинуклеотидом (НАД), в результате чего образуется промежуточный фермент ковалентного типа. Вторым этапом реакции является аденилирование субстрата нуклеиновой кислоты на 5'-конце ника ника, за которым следует лигирование нитей нуклеиновой кислоты. Многие ферменты лигазы, рекомбинантно экспрессируемые в E. coli, очищаются в аденилированной форме и, следовательно, способны успешно лигировать нуклеиновые кислоты без добавления нуклеотидного кофактора. Это затрудняет определение того, какой именно тип нуклеотидного кофактора им требуется для лигирования нуклеиновых кислот. В дополнение к описанию анализов для оценки активности ДНК-лигазы также представлен метод надежного определения использования кофактора путем деаденилирования фермента с использованием немеченых субстратов.
Нуклеазы представляют собой большую и разнообразную группу ферментов, модифицирующих ДНК/РНК, и каталитических РНК, которые расщепляют фосфодиэфирные связи между нуклеиновымикислотами. Функциональные возможности нуклеазных ферментов необходимы для репликации ДНК, репарации и процессинга РНК и могут быть классифицированы по их сахарной специфичности для ДНК, РНК или и того, и другого. Эндонуклеазы гидролизуют фосфодиэфирные связи внутри цепи ДНК/РНК, в то время как экзонуклеазы гидролизуют нити ДНК/РНК по одному нуклеотиду за раз от 3' или 5' конца и могут делать это либо от 3' до 5', либо от 5' до 3' конца ДНК38.
В то время как многие нуклеазные белки неспецифичны и могут участвовать в нескольких процессах, другие обладают высокой специфичностью в отношении определенной последовательности или повреждения ДНК 6,39,40. Последовательно-специфические нуклеазы используются в широком спектре биотехнологических приложений, таких как клонирование, мутагенез и редактирование генома. Популярными нуклеазами для этих применений являются нуклеазы рестрикции41, нуклеазы цинкового пальца42, эффекторные нуклеазы транскрипционного активатора, а в последнее время — РНК-управляемые CRISPR нуклеазы43. Недавно были идентифицированы поврежденные нуклеазы, такие как нуклеаза EndoMS, которая обладает специфичностью к несоответствиям в ДНК через свой специфичный для несоответствия RecB-подобный нуклеазный домен 5,44. Исторически сложилось так, что анализы нуклеазной активности проводились в виде прерывистых анализов с радиоактивно мечеными субстратами; Однако, в дополнение к своим другим недостаткам, они не позволяют идентифицировать сайт, который разрезается нуклеазным белком, что возможно при использовании флуоресцентно меченных субстратов 45,46. В последнее время были разработаны непрерывные нуклеазные анализы, которые работают с использованием различных красителей ДНК, взаимодействующих с ДНК в разных состояниях; например, излучение более высокого флуоресцентного сигнала при взаимодействии с дцДНК, чем в ее несвязанном состоянии, или специфическое связывание с короткими РНК47. В других непрерывных нуклеазных анализах используются шпильки ДНК с флуорофорной группой на 5'-конце и гасителем на 3'-конце, так что флуоресценция увеличивается по мере деградации олигонуклеотида из-за разделения флуорофора и гасителя48. В то время как эти анализы позволяют охарактеризовать кинетику белков, разрушающих ДНК, они требуют предварительных знаний о функции фермента и субстрате, а также ограничены ферментами, которые изменяют конформацию ДНК, вызывая разницу в связывании красителей. По этой причине по-прежнему желательны конечные анализы, которые разрешают отдельные нуклеазные продукты, чтобы дать представление о модификациях ДНК, вызванных активностью белка.
Здесь подробно описана процедура разработки флуоресцентно меченных олигонуклеотидов ДНК/РНК, которые могут быть смешаны и согласованы для получения субстратов для тестирования активности новых ферментов нуклеазы, полимеразы и лигазы. Валидация этого базового набора олигонуклеотидных последовательностей упрощает планирование эксперимента и способствует экономичному профилированию широкого спектра ферментативных функций без необходимости приобретения большого количества специализированных субстратов. Подробно описана процедура проведения стандартного ферментного анализа ДНК с этими субстратами на примере активности ДНК-лигазы и модификаций для анализа и анализа нуклеазных и полимеразных ферментов. Кроме того, приведен модифицированный анализ для определения кофакторной специфичности фермента ДНК-лигазы с высокой точностью, а для оценки сборки многокомпонентных лигаторов используются зонды с двойной меткой. Наконец, обсуждаются модификации базового формата анализа, позволяющие использовать его для определения белок-ДНК-взаимодействий с теми же субстратами с помощью анализа электрофоретического сдвига подвижности (EMSA).
1. Разработка и закупка олигонуклеотидов
Примечание: Проектирование одноцепочечных олигонуклеотидов для сборки и отжига в желаемые дуплексы. Одна или несколько цепей в дуплексе должны содержать флуоресцентный фрагмент для отслеживания процесса олигонуклеотида интересующим ферментом. Базовый набор одноцепочечных последовательностей, которые могут быть собраны для ряда действий, представлен в таблице 1.
2. Сборка и отжиг дуплексов нуклеиновых кислот
3. Стандартная настройка анализа
4. Анализ результатов анализов
5. Деаденилирование ДНК-лигазы для проверки специфичности кофактора
6. Использование подложек с двойной маркировкой для шинирования лигирования или сборки из нескольких частей
7. Оценка связывания ДНК с помощью электрофоретического анализа сдвига подвижности (EMSA) на нативном геле
Лигирование по ДНК-лигазе
Ферментативная активность ДНК-лигазы приведет к увеличению размера флуоресцентно меченного олигонуклеотида при визуализации на геле мочевины PAGE. В случае субстратов для лигирования ДНК и РНК, перечисленных в таблице 2, это соответствует удвоению размера с 20 до 40 нт (рисунок 3A). Оптимальная активность фермента может быть определена по изменяющимся условиям, таким как температура, концентрация белка или время инкубации (рисунок 3B), нуклеотидные кофакторы, кофакторы металлов (рисунок 3C). Относительная активность лигазы на различных подложках может быть сравнена параллельно (рисунок 3D).
Количественное определение полос продукта и субстрата выражается в процентах от общего лигированного субстрата и, как показано на рисунке 3, может быть использовано для оценки специфической активности фермента или для определения оптимальных значений активности, таких как предпочтительность двухвалентных катионов, температура или pH.
Бактериальная ДНК-лигаза DV-1-1-Lig (рис. 3) способна лигировать нестыковочные и несоответствующие субстраты ДНК и может использовать как магний, так и марганец для лигирования, отдавая предпочтение магнию. Более подробная информация об этом ферменте представлена впункте 51.
Удлинение праймера ДНК-полимеразой
Активность ДНК-полимеразы за счет удлинения флуоресцентно меченого праймера на 20 нт приведет к увеличению размера до 40 нт при использовании представленного здесь набора олигонуклеотидов (рис. 4А). Частично расширенные товары будут отображаться в виде лестницы товаров до размера шаблона (Рисунок 4B и Рисунок 4C). Показанный здесь анализ удлинения праймера (рис. 4C) привел к полному синтезу праймерной цепи.
Деградация нуклеазой
Активность нуклеазы приводит к уменьшению размера флуоресцентно меченного олигонуклеотида при визуализации на геле мочевины PAGE. Нуклеазы со специфической эндонуклеазной активностью могут приводить к образованию одного 20-нтного продукта (рис. 5A-C). Нуклеазы с экзонуклеазной активностью приводят к образованию флуоресцентно меченых олигонуклеотидов различных размеров (рисунок 5D-F). Здесь показаны результаты работы бактериального нуклеазного белка антарктического метагенома, который проявляет специфическую эндонуклеазную активность на субстрате двухцепочечного аосновного сайта и неспецифическую экзонуклеазную активность на одноцепочечном субстрате (рис. 5C и рис. 5F соответственно).
Анализ использования деаденилирования лигазы и нуклеотидного кофактора
Многие рекомбинантно экспрессируемые ферменты лигазы очищаются в уже аденилированном состоянии из АТФ или НАД, собранных из их хозяина 51,52,53,54,55. Удаление этого ковалентного промежуточного продукта АМФ необходимо для точной идентификации диапазона нуклеотидных кофакторов, которые фермент может использовать для лигирования субстратов нуклеиновых кислот51. Оборот фермента аденилированной лигазы с немеченым субстратом в отсутствие экзогенного нуклеотидного кофактора приведет к истощению промежуточного продукта аденилирования. При использовании флуоресцентно меченых субстратов ДНК и добавлении нуклеотидного кофактора только на втором этапе, любой продукт лигирования, видимый при использовании флуоресцентного канала (Fluorescein-FITC) на гелевом имиджоре, является результатом аденилирования нуклеотидным кофактором, добавленным на этом этапе.
Анализы активности, проведенные с помощью бактериальной ДНК-лигазы, экспрессируемой в системе E. coli, показывают, что она была очищена в предварительно аденилированной форме и продемонстрировала фоновую способность лигировать поврежденную ДНК без дополнительного кофактора (рис. 6Ai-ii). Добавление АТФ к аденилированной лигазе действительно увеличивает количество лигированного продукта, образующегося в реакции, но это не всегда надежно, поскольку эта базальная активность может дать неверное представление об использовании кофактора широкого спектра действия, или дальнейшее добавление нуклеотидных кофакторов в реакцию может ингибировать лигирование субстрата. При первой инкубации лигазы с немеченой версией подложки ДНК с трещинами АМФ переворачивают, и лигирование на субстрате меченой ДНК не наблюдается, если в реакцию не добавляется АТФ. Второй анализ активности (рис. 6B) показывает, что деаденилированная ДНК-лигаза улучшает активность лигирования на субстрате ник-ДНК с добавлением АТФ и АДФ. Также наблюдается некоторое улучшение лигирования с добавлением ГТФ, которое больше, чем фоновое лигирование, наблюдаемое в контроле без кофактора. Лигирование, наблюдаемое в реакциях с NAD, сравнимо с лигированием, наблюдаемым в реакциях контроля без кофактора, что исключает NAD в качестве кофактора для лигирования.
Результаты анализа с двойной маркировкой
Ортогональные флуорофоры могут быть использованы для установления активности в различных частях сложного субстрата. Пример на рисунке 7 показывает активность недавно описанной ДНК-лигазы R2D56 по сравнению с ДНК-лигазой Т4 на сплинированном дуплексе ДНК/РНК. Лигирование акцептора ДНК к донорскому участку субстрата РНК было обнаружено с помощью 6-FAM, в то время как лигирование акцептора РНК к донору ДНК было обнаружено с помощью 5-TAMRA (рис. 7A). Относительная степень лигирования ДНК на обоих концах РНК-субстрата может быть оценена по наличию полосы продукта с флуоресценцией в каналах 6-FAM и 5-TAMRA, которая отображается как желтая на составном изображении, в то время как отдельные 6-FAM и 5-TAMRA имеют зеленый и желтый цвета соответственно (рис. 7B). Как подробно описано в предыдущей публикации56, только R2D-лигаза была способна лигировать ДНК до 5'-конца РНК, в то время как обе лигазы были способны лигировать ДНК до 3'-конца РНК. При лигировании обеих молекул ДНК к РНК в одиночных реакционных смесях, R2D-лигаза может лигировать олигопласты ДНК на оба конца РНК, поскольку полоса смещается вверх и наблюдается изменение цвета на желтый (рис. 7C).
Во втором примере на рисунке 8 используется подход с двойным мечением для демонстрации лигирования множественных олигонуклеотидов при различном pH. Субстрат, собранный из смеси семи олигонуклеотидов, был использован для демонстрации способности R2D-лигазы собирать короткие фрагменты. 5'-цепь имеет меченую флуорофором FAM 14-нтную цепь, в то время как цепь комплемента имеет флуорофор TAMRA на 3'-конце 16-нтного олигонуклеотида. Успешное лигирование можно увидеть по дополнительным более высоким полосам для олиго FAM (зеленого) и олиго TAMRA (красного). Перекрытие обоих флуорофоров дает нуклеотидную полосу желтого цвета в виде полностью лигированных нитей одинакового размера.
Результаты связывания ДНК из фермента ДНК-лигазы с помощью EMSA
Связывание фермента ДНК-лигазы с фосфорилированной никнутой ДНК приводит к образованию комплекса, который имеет более высокую молекулярную массу, чем только олигонуклеотид (рис. 9А). Здесь показано связывание бактериальной АТФ-зависимой ДНК-лигазы с субстратом ник-ДНК. При высоких концентрациях белка большая часть меченого субстрата ДНК связывается и видна в более высоких молекулярных диапазонах; при более низких концентрациях белка преобладает субстрат свободной ДНК (рис. 9B).
Рисунок 1: Схемы различных субстратов нуклеиновых кислот, предназначенных для тестирования ферментативной активности лигазы. Звездочки представляют мечение 6-карбоксифлуоресцеином на 5'-конце (5' FAM). Меченые нити обозначаются черной или темно-синей/красной (в случае дуплексов ДНК/РНК) линией, в то время как немеченые участки дуплексов субстрата обозначаются серой или светло-голубой/красной (в случае дуплексов ДНК/РНК) линией. Меченые пряди имеют длину 20 нт, а если пряди перевязаны, то образуют продукт 40 нц. 5'-фосфорилированные участки обозначены буквой P в круге. Олигонуклеотидные цепи помечены, а их названия приведены в Таблице 1 и Таблице 2. (А) Дизайн двухцепочечных субстратов ДНК с различными типами разрывов, используемых для тестирования ферментативной активности ДНК-лигаз. (B) Дизайн двухцепочечных субстратов РНК и РНК/ДНК, включающих ДНК и РНК-олигонуклеотиды. Субстраты содержат один сайт ника и используются для проверки способности лигаз запечатывать разрывы ников дуплексов РНК/ДНК. Красная линия представляет олигонуклеотиды РНК, а синие линии — олигонуклеотиды ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Схемы различных субстратов нуклеиновых кислот, предназначенных для тестирования ферментативной активности нуклеазы. Звездочками обозначена маркировка 6-карбоксифлуоресцеином на 5'-выводе (5' FAM). Помеченные нити обозначаются черной линией, в то время как неразмеченные участки субстратных дуплексов обозначаются серой линией. 5'-фосфорилированные участки обозначены буквой P в круге. Олигонуклеотидные цепи помечены, а их названия приведены в Таблице 1 и Таблице 2. (А) Проектирование оснований с двух- и одноцепочечными участками. (B) Конструкцию двухцепочечных субстратов ДНК модифицируют для получения одноцепочечных лоскутов на 3' или 5' конце (Flapped 3', flapped 5' или flapped both ends (spaced)). (C) Проектирование двухцепочечных подложек с поврежденными основаниями или несоответствиями в центральном положении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Тестирование лигионной активности бактериальной АТФ-зависимой ДНК-лигазы DV-1-1-Lig. (A) Схема ферментных анализов активности лигазы на ДНК-субстратах с результатами, проанализированными на геле TBE urea PAGE. Звездочки обозначают мечение 6-карбоксифлуоресцеином на 5'-терминале (5' FAM). Помеченные пряди обозначены черной линией, в то время как непомеченные части дуплексов субстрата, которые не видны во время анализа, обозначены серыми линиями. (B) Количественная оценка лигирования DV-1-1-Lig на поврежденной ДНК в различные моменты времени. Воздействие на каждый субстрат проводилось в двух экземплярах. Реакции инкубировали в течение различных временных периодов (0,5 ч, 1 ч, 2 ч, 3 ч и 4 ч) при 25 °С, с конечной концентрацией белка 4 мкМ, конечной концентрацией АТФ 1 мМ и конечной концентрацией ионов магния 10 мМ. (C) Лигирование поврежденного субстрата ДНК магнием (Mg) или марганцем (Mn). Реакции проводили в течение 3 ч при 25 °С с конечной концентрацией АТФ 1 мМ и конечной концентрацией ионов металлов 10 мМ. (D) Результаты лигирования на различных субстратах ДНК. Реакции проводили в течение 8 ч при 20 °С с конечной концентрацией белка 2 мМ, конечной концентрацией АТФ 1 мМ и конечной концентрацией магния 10 мМ. Добавление белка в реакцию обозначается символом плюса (+). Контрольные реакции обозначаются С, а отсутствие содержащегося белка – символом минус (-). Продукт (40 нт) и подложка (20 нт) обозначены красными стрелками. Результаты анализов активности визуализировались с помощью системы визуализации. Полосы количественно определяли путем интегрирования интенсивности с помощью программного обеспечения ImageJ49 , а графики строили с помощью графического программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: ДНК-полимеразный анализ. (А) Схема анализа удлинения праймера на ДНК-субстрате. Звездочки обозначают мечение 6-карбоксифлуоресцеином на 5'-терминале (5' FAM). Помеченные пряди обозначены черной линией, в то время как непомеченные части дуплексов субстрата, которые не видны во время анализа, обозначены серыми линиями. (B) Схема ожидаемых результатов геля TBE Urea PAGE, показывающих увеличение длины меченого праймера с добавлением нуклеотидов. (C) Пример удлинения праймера ферментом ДНК-полимеразой фрагмента E. coli Klenow. Добавление белка в реакцию обозначается символом плюса (+). Полоса 1, 12,5 U; Полоса 2, 2,5 U; Дорожка 3, 1.25U. Контрольные реакции обозначаются буквой С, а отсутствие содержащегося белка – символом минус (-). Реакции проводили в течение 15 мин при 25 °С и содержали 5 мМ MgCl2, 50 мМ Tris pH 8,0, 50 мМ NaCl2, 1 мМ DTT и 0,25 мМ dNTPs. Продукт (40 нт) и подложка (20 нт) обозначены красными стрелками. Результаты анализов активности визуализировались с помощью системы визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Тестирование активности бактериальной нуклеазы антарктического метагенома с использованием различных субстратов, металлов и температур инкубации. (А) Схематически специфическая эндонуклеазная активность нуклеазного белка на субстрате аосновного сайта (обозначено буквой x). Звездочки обозначают мечение 6-карбоксифлуоресцеином на 5'-терминале (5' FAM). Черные линии представляют меченые нити, а серые линии — немеченые нити ДНК. Специфическое разрезание нуклеазой показано с правой стороны аосновного сайта, но может происходить и с левой. (B) Схема денатурирующего геля мочевины PAGE с изображением неразрезанного субстрата (40 nt) при отсутствии белка, обозначенного символом минус (-), и продукта разреза (20 nt), при наличии нуклеазы, обозначенной символом плюс (+). (C) Пример геля PAGE мочевины ВЕ, демонстрирующий результаты специфической активности нуклеазы эндонуклеазы на двухцепочечном субстрате ДНК с аосновным сайтом. Анализ проводили с концентрацией белка 1,0 мкМ и 1 мМ MgCl2. Две контрольные реакции проводили при 20 °С, одну без белка (лунка 1) и одну без металла (лунка 2). Реакции инкубировали в течение 5 ч при повышении температуры от 1 °C до 50 °C, как указано выше на изображении геля. Добавление белка обозначается символом плюс (+), а отсутствие белка обозначается символом минуса (-). Субстрат и продукт обозначены красными стрелками. (D) Схема, показывающая неспецифическую экзонуклеазную активность нуклеазного белка на одноцепочечном субстрате. Звезды представляют мечение 6-карбоксифлуоресцеином на 5'-конце (5'FAM). Черные линии представляют обозначенные пряди. Неспецифическое разрезание нуклеазы приводит к образованию меченых нитей различной длины (<39 нт). (E) Схема, представляющая собой денатурирующий гель мочевины PAGE, показывающий неразрезанный субстрат (40 nt), в который не был добавлен белок (-), и показывающий разрезанный субстрат различной длины, где был добавлен белок (+), что может быть результатом активности неспецифической экзонуклеазы. (F) Гели TBE urea PAGE демонстрируют пример неспецифической экзонуклеазной активности той же антарктической метагеномной нуклеазы с одноцепочечным субстратом. Анализ проводили при 20 °С в течение 4 ч с белком в конечной концентрации 1,5 мкМ и конечной концентрацией иона металла при 10 мМ. Используемый ион металла указан над изображением. Добавление белка обозначается символом плюс (+), а отсутствие белка обозначается символом минуса (-). Подложка (40 нт) обозначена красной стрелкой, а изделия разной длины – красным зажимом. Результаты всех нуклеазных реакций визуализировались с помощью системы визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6: Результаты лигирования поврежденного субстрата ДНК аденилированными и деаденилированными версиями бактериальной ДНК-лигазы. (A) i) Количественная оценка лигирования ферментом аденилированной и деаденилированной лигазой, с АТФ и без него. Точки на графике представляют собой средние значения каждой реакции. Стандартные планки погрешностей включены. ii) Гель TBE urea PAGE, показывающий результаты лигирования на субстрате ДНК ника аденилированным и деаденилированным ферментом лигазой, с АТФ и без него. Реакции проводили в трех экземплярах. Деаденилированный фермент предварительно инкубировали в течение 2 ч при 25 °С с немеченым субстратом ДНК ника и ферментом 0,1 мкМ, а затем инкубировали в течение 1 ч с субстратом меченой ДНК ника. Аденилированный фермент не инкубировали предварительно с немеченым субстратом. АТФ (1 мМ) добавляли в реакции вместе с добавлением меченого субстрата ДНК. (B) i) Количественная оценка лигирования деадениллигазой на ДНК ника с различными кофакторами (АТФ, НАД, АДФ и ГТФ). Точки на графике представляют средние значения для каждой концентрации. В комплект входят полосы погрешностей стандартного отклонения. ii) TBE urea PAGE с указанием результатов лигирования лигазой, с добавлением и без добавления различных кофакторов. Воздействие на каждый субстрат проводилось в двух экземплярах. Реакции предварительно инкубировали в течение 2 ч при 25 °С с немеченым никелированным субстратом ДНК, 4 мкМ белком и 5 мМ ионом магния, а затем 4 ч инкубировали с добавлением меченого никелированного субстрата ДНК, 5 мМ магния и различных кофакторов при 1 мМ конечной концентрации. Добавление белка в реакцию обозначается символом плюса (+). Использовались контрольные реакции, которые не содержали белка (Controls, C) или кофактора (No cofactor). Продукт (40 нт) и подложка (20 нт) обозначены красными стрелками. Результаты анализов активности визуализировались с помощью системы визуализации. Полосы количественно определяли путем интегрирования интенсивности с помощью программного обеспечения ImageJ49. Графики были сгенерированы с помощью программного обеспечения для построения графиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7: Лигирование коротких флуоресцентно меченных ДНК-олигонуклеотидов на оба конца 5'-фосфорилированной РНК-олигополиго, расположенной с помощью ДНК-матриц. (A) Схема лигирования ДНК-РНК с помощью шинированной ДНК-РНК, показывающая, как возможные продукты лигирования могут быть визуализированы с использованием стратегии двойного мечения. (B) Схема возможных продуктов, которые должны быть видны на геле Urea-PAGE, изображенном в двух каналах. (C) Экспериментальные результаты двойного лигирования флуорофорами. Реакции лигирования тестировали с использованием T4 ДНК-лигазы и R2D-лигазы, как в изолированных реакциях, где ДНК лигировали либо на 5'-конец (дорожка 2-4), либо на 3'-конец (дорожка 5-7) РНК, или в одной реакции, где оба олигонуклеотида ДНК лигировали в одной и той же реакционной смеси (полоса 8-10). Без контроля белка (NPC) фермент не добавлялся. Условия реакции и специфические олигонуклеотиды, используемые в этом примере, такие же, как приведены впункте 56. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 8: Лигирование множественных коротких олигонуклеотидных сегментов тремя вариантами R2D с разным рН. (A) Схема стратегии многокомпонентного лигирования. (B) Репрезентативный гель, показывающий зависимость pH многокомпонентной сборки, визуализированный с помощью каналов FAM и TAMRA. Дорожка C без контроля ферментов, дорожка 1-3 pH 6,0, дорожка 4-6 pH 6,5, дорожка 7-9 pH 7 и дорожка 10-12 pH 7,5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 9: Результаты EMSA. Схематический и нативный гель TBE PAGE электрофоретического анализа сдвига подвижности (EMSA), визуализирующий связывающую активность АТФ-зависимой ДНК-лигазы (полученной из метагеномных данныхиз сухих долин М-с-Мурдо, Антарктида) на ДНК-субстрате. (А) Схема связывания EMSAs/ДНК лигазой ДНК на субстрате ДНК ника. Результаты связывания визуализируются на неденатурирующем геле TBE PAGE. ДНК-субстраты, связанные с ферментом лигаза, медленнее мигрируют через гель, в то время как субстраты без ферментов мигрируют быстрее, что приводит к смещению размера полосы (желтые прямоугольники), визуализированной на геле. Поскольку субстраты визуализируются на неденатурирующем геле, олигонуклеотиды остаются отожженными, что позволяет меченой FAM цепью (желтая звезда) присутствовать как на свободных, так и на связанных субстратах. Градиент концентрации белка может быть использован для определения концентрации белка для оптимального связывания. (B) Визуализация EMSA на нативном геле TBE PAGE, показывающая способность связывания АТФ-зависимой ДНК-лигазы с субстратом ник-ДНК при различных концентрациях белка. Фермент инкубировали с поврежденным субстратом ДНК в течение 30 мин при 25 °С, с конечной концентрацией АТФ 1 мМ и ЭДТА 40 мМ. Использовали три различные концентрации белка (5,5 мкМ, 2,3 мкМ и 1,5 мкМ). Реакции проводились на 10% нативном геле TBE, с нативным нагрузочным красителем в реакциях. Образцы, содержащие белок, были выбиты в трех экземплярах для различных концентраций белка. Контрольные полосы содержат поврежденный субстрат ДНК с 1 мМ, конечным АТФ и ЭДТА, но без белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Таблица 1: Олигонуклеотидные последовательности субстрата ДНК, используемые для построения подложек для анализа. Повреждения выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. Положения несоответствий и разрывов в итоговом дуплексе подчеркнуты. Сокращения: 5' 6-карбоксифлуоресценцин (5' FAM), 8-оксо-дезоксигуанозин (8OxodG), аосновной тетрогидрофуран (dSpacer). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Комбинации олигонуклеотидов, используемые для сборки мастер-смесей для различных ферментных анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 3: Настройка мастер-смесей с четырьмя олигонуклеотидами. В таблице 2 приведены комбинации олигонуклеотидов, которые можно использовать для различных субстратов для анализа, и текст для получения подробной информации о условиях реакции. Как минимум, требуется меченый олигонуклеотид – дополнительные участки дуплекса обозначены скобками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 4: Компоненты для меченой и немеченой мастер-смеси для получения дуплекса nick DNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 5: Настройка мастер-миксов EMSA для различных комбинаций дуплексов. В таблице 3 приведены комбинации олигонуклеотидов, которые можно использовать для различных субстратов EMSA, а в тексте приведены подробные сведения о условиях реакции. Субстраты EMSA разработаны с использованием тех же олигонуклеотидов, что и субстраты для анализов активности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Критические шаги в протоколе
Дизайн и покупка олигонуклеотидов: При покупке олигонуклеотидов для образования дуплекса важно учитывать дизайн последовательности. Рекомендуется использовать инструмент олигоанализатора для прогнозирования свойств нуклеотидной последовательности, таких как содержание GC, температура плавления, вторичная структура и потенциал димеризации, перед заказом57.
Сборка и отжиг дуплексов нуклеиновых кислот: При приготовлении дуплексов РНК/РНК-ДНК следует соблюдать осторожность для предотвращения загрязнения РНКазы путем использования реагентов и воды, не содержащих РНКазы, или добавления ингибитора РНКазы (при условии, что исследуемый фермент сам не является РНКазой). Оборудование, перчатки и рабочее место должны быть обработаны раствором для обеззараживания РНКазы перед сборкой мастер-смесей во избежание деградации олигонуклеотидов58. Основные запасы олигонуклеотидов РНК могут быть собраны в меньшие партии в случае загрязнения.
ДНК-лигазы всегда требуют нуклеотидного кофактора, либо АТФ, либо НАД, в конечной концентрации от 0,1 до 1 мМ. ДНК-полимеразам требуются dNTP для синтеза цепей, и они обычно добавляются в эквимолярных соотношениях по 50 мкМ каждого. При приготовлении мастер-смесей для дуплексов лигазы и полимеразы нуклеотидные кофакторы, такие как АТФ, НАД и дНТФ, должны быть добавлены в исходную смесь после того, как смесь была нагрета и охлаждена до комнатной температуры, поскольку они чувствительны к теплу.
10-кратный буфер для отжига олигонуклеотидов требует добавления DTT, который имеет короткий период полураспада и в идеале должен быть приготовлен свежим или замороженным перед использованием. Меньшие аликвоты 10-кратного буфера могут быть приготовлены заранее и храниться при температуре 4 °C, с добавлением DTT перед использованием.
Олигонуклеотидные запасы и мастер-смеси следует хранить при температуре -20 °C для длительного использования, а флуоресцентно меченные олигонуклеотиды или смеси должны быть завернуты в фольгу для предотвращения фотообесцвечивания флуорофора. Чтобы избежать повторных циклов замораживания-размораживания, которые могут нарушить целостность олигонуклеотидов, рекомендуется готовить и использовать меньшие объемы (>1 мл).
Постановка и анализ результатов анализа: Включение контрольных элементов имеет важное значение для правильной интерпретации результатов анализа. Следует использовать контроль без белка (субстрат ДНК с буферным раствором), чтобы убедиться, что кажущаяся активность на субстрате является результатом действия фермента. В случае нуклеазы экзогенная деградация субстрата приведет к образованию низкомолекулярных полос или лестничности в контроле, в то время как в случае лигазы или полимеразы неполная дуплексная денатурация приведет к высокомолекулярной полосе в контроле. Положительный контроль размера ожидаемого продукта представлен в таблице 2 и должен быть включен для проверки правильности размера продукта.
Важные параметры успешного электрофореза продукта анализа были описаны в предыдущем протоколе59. К ним относятся обеспечение соответствия процентного содержания акриламида размеру основания и использование соответствующего загружающего красителя в зависимости от размера основания и типа геля, необходимого для визуализации результатов. Трекинговый краситель бромфеноловый синий имеет приблизительный размер олигонуклеотида с 10 основаниями и, следовательно, подходит для описанного здесь набора олигонуклеотидов; Однако, если полоса красителя перекрывается с флуоресцентным продуктом или полосами субстрата при использовании более коротких нуклеотидов, отслеживающий краситель может быть заменен на ксилолцианол, который работает медленнее60.
Чтобы обеспечить хорошее разрешение полос субстрата/продукта, резервуар для геля следует нагревать либо снаружи с помощью водяной бани, либо с помощью высокого напряжения (например, 180 В). Предварительный запуск гелей мочевины PAGE в течение не менее 30 минут и промывка лунок пипеткой для удаления избытка мочевины необходимы для получения острых, прямых полос, пригодных для количественного определения.
Для количественного определения подложек и продуктов диапазон от 20% до 80% от общего объема материала должен быть преобразован в продукт, чтобы обеспечить точную интеграцию флуоресцентных гелевых полос. При анализе нового фермента рекомендуется провести градиент концентраций белка, чтобы можно было провести последующие измерения в этом диапазоне. Многие флуоресцентные тепловизоры имеют встроенные функции интеграции полос, которые могут быть использованы для этой цели. Если вы используете внешнюю программу, такую как ImageJ49, убедитесь, что изображение геля экспортируется в высоком качестве в формате tiff.
Модификации и устранение неисправностей техники
Дизайн и покупка олигонуклеотидов: Олигонуклеотиды, приведенные в данном протоколе, являются полезными отправными точками и могут быть расширены, как предложено в разделе «Способы», путем изменения олигонуклеотидных последовательностей и включения модификаций.
Стандартная постановка анализа и анализ результатов: Пилотные эксперименты необходимы при проверке активности нового фермента, поскольку оптимальные условия реакции будут варьироваться между различными белками; Параметры, приведенные в этом протоколе, предназначены только в качестве отправной точки. Такие факторы, как концентрация фермента, температура реакции, продолжительность инкубации, кофактор и буферный состав/pH, могут изменяться во время реакции мастер-смеси и анализа. Концентрации кофакторов особенно важны, поскольку избыток нуклеотидных кофакторов или ионов металлов может быть ингибиторным, и рекомендуется тестировать диапазон концентраций каждого из них. Для ДНК-полимераз рекомендуемые концентрации dNTP варьируются от 20 до 200 мкМ в целом, однако высокие концентрации dNTP снижают точность61. Аналогичным образом, полинуклеотидные лигазы обычно анализируют с 0,1-1,0 мМ нуклеотидным кофактором, но чрезмерные концентрации вызывают аденилирование накопленной ДНК и ингибирование реакции62.
Стандартный протокол здесь использует Mg в качестве двухвалентного катиона; однако некоторые ферменты более активны с марганцем (Mn) или цинком (Zn). Мастер-смеси, содержащие Mn или Zn, следует готовить с более низким pH буфера (<7,5), а металлы следует добавлять после нагревания. Мастер-смеси следует использовать в тот же день, чтобы избежать выпадения осадков и угнетения активности фермента.
Добавки, в том числе скученные агенты, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или стабилизаторы, такие как бычий сывороточный альбумин, могут быть использованы для повышения активности некоторых ферментов63,64. Их следует добавлять после этапа отжига из-за их термоэластичности. Все биологически полученные реагенты должны соответствовать требованиям молекулярной биологии, чтобы избежать введения загрязняющих нуклеаз.
Объем буфера для гашения формамида, используемый в данном протоколе, подходит для базового набора олигонуклеотидов. Однако для более длинных олигонуклеотидов объем формамида должен быть увеличен до 10-20 мкл, чтобы обеспечить полное разделение цепей, а закаленные реакции могут быть охлаждены на льду и храниться при 4 °C до электрофореза.
При использовании некоторых ферментов тесное связывание белка с субстратом/продуктом может препятствовать миграции олигонуклеотидов в гель во время электрофореза, особенно когда фермент используется в высоких концентрациях. Это проявляется в отсутствии полос продукта/субстрата на геле и часто в накоплении флуоресцентного материала (продукта и/или субстрата в комплексе с белком) в лунках. Чтобы разрушить эти комплексы, смесь для анализа можно обработать протеиназой К перед добавлением буфера для гашения, или добавить додецилсульфат натрия (SDS) во время гашения.
Активность ДНК-лигазы образует две дискретные полосы, которые легко поддаются количественной оценке. Можно использовать тот же метод для количественной оценки активности эндонуклеазы на субстрате повреждения ДНК, где предполагается наличие одного 20-нуклеотидного продукта, или для анализа EMSA, где четко различаются связанное/несвязанное состояния. Точное количественное определение активности полимеразы и процессной нуклеазы затруднено зонной интеграцией, и в целом рекомендуется использовать анализ в реальном времени с помощью зондов или маяков, как описано во введении.
Деаденилирование и кофакторная специфичность ДНК-лигазы: Может потребоваться некоторая оптимизация этого протокола для устранения всей фоновой активности, которая затем будет восстановлена путем добавления нуклеотидного кофактора (кофакторов). Если фоновая активность лигазы остается после деаденилирования (рассматриваемая как лигирование в контроле без кофактора), время инкубации стадии деаденилирования может быть увеличено или концентрация лигазы может быть уменьшена. Убедитесь, что дуплекс ДНК без метки более концентрирован, чем белок (> 4:1::субстрат: белок). Если добавление кофактора в присутствии меченой ДНК не восстанавливает лигирование ни для одного из тестируемых кофакторов, возможно, фермент денатурировал, и стадию деаденилирования следует сократить. Для новой лигазы или новой партии рекомбинантного фермента полезно определить степень фонового лигирования аденилированным ферментом в отсутствие дополнительных нуклеотидных кофакторов. Это включает в себя создание другой реакции, в которой одновременно инкубируют 10 мкл немеченой мастер-смеси, 10 мкл меченой мастер-смеси и 2,5 мкл свежего фермента, который не был деаденилирован.
Используйте подложки с двойной маркировкой: Этот протокол требует разработки и покупки олигонуклеотида с флуоресцентной группой, который имеет спектр возбуждения/излучения, отличный от первоначально использованного флуорофора, а затем сборки его в дуплекс таким образом, чтобы два ортогональных флуорофора помечали разные участки субстрата. В случае сомнений доступен ряд онлайн-просмотрщиков спектров для проверки спектров возбуждения и излучения, например, FPbase Spectra Viewer и BD Spectrum Viewer, которые могут быть использованы для проверки как совместимости пары флуорофоров, так и наиболее подходящих настроек тепловизора. Конкретные настройки, используемые для визуализации геля, будут зависеть от модели тепловизора и используемого флуорофора. Составное изображение будет записывать сигнал из обоих каналов на один гель, а полоса, где оба флуорофора прикреплены к одному и тому же продукту, будет отображаться как промежуточный цвет. Отдельные изображения из отдельных каналов могут быть проанализированы для количественной оценки степени лигирования или деградации на дифференциально меченых цепях.
Ограничения методики
Несмотря на то, что работа с флуоресцентно мечеными подложками имеет много преимуществ, таких как низкая опасность для здоровья, существуют некоторые ограничения, которые необходимо учитывать при работе с этими типами маркированных подложек. Одним из них является относительно высокая стоимость заказа этих олигонуклеотидов с флуорофорными метками или модификациями, такими как добавление поврежденных оснований, по сравнению с собственным радиоактивным мечением. Другая заключается в том, что для обнаружения меченых нитей требуется специализированное оборудование и программное обеспечение для визуализации. Тем не менее, эти функции в настоящее время включены в большинство новых систем визуализации геля. Следует также учитывать способность флуорофоров изменять связывающие свойства белков-мишеней, взаимодействующих друг с другом. Флуоресцеин и его производное FAM обычно используются для мечения олигонуклеотидов и чувствительны к изменениям pH и гаслению нуклеотидов65. Эти ограничения следует тщательно учитывать при принятии решения о типе и размещении флуорофоров на олигонуклеотиде для дуплексного дизайна.
SEG и UR являются сотрудниками компании ArcticZymes Technologies AS, которая занимается дистрибуцией R2D-лигазы. AW, ER-S и RS не имеют конкурирующих интересов.
AW поддерживается стипендией Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). РС является получателем стипендии Новой Зеландии для Постантарктической службы. SG и UR выражают благодарность Химическому институту при Университете Тромсё - Норвежскому арктическому университету за техническую поддержку.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1) | BioRad | 1610156 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Many suppliers | ||
Ammonium persulfate (APS) | Many suppliers | ||
Benchtop centrifuge | Many suppliers | ||
Borate | Many suppliers | ||
Bromophenol blue | Many suppliers | ||
Dithiothreitol (DTT) | Many suppliers | ||
Electrophoresis system with circulating water bath | Many suppliers | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Many suppliers | ||
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000 | Thermo Fisher Scientific | A32752 | |
Formamide | Many suppliers | ||
Gel casting system | Many suppliers | ||
Heating block | Many suppliers | ||
Magnesium Chloride | Many suppliers | Other metal ions may be preferred depending on the protein studied | |
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Many suppliers | ||
Micropipettes and tips | Many suppliers | 1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL | |
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) | Many suppliers | ||
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | NA | Thermo Fisher, Sigma-Aldrich, Genscript and others also supply these |
pasture pipette | Many suppliers | ||
PCR thermocycler | Many suppliers | ||
PCR tubes | Many suppliers | ||
RNAse away | ThermoFisher | 7002PK | Only needed when working with RNA oligos |
RNase AWAY | Merck | 83931-250ML | Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces |
RNAse-free water | New England Biolabs | B1500L | Only needed when working with RNA oligos |
Sodium Chloride | Many suppliers | ||
SUPERase IN RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based) |
SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides |
Tetramethylethylenediamine (TMED) | Many suppliers | ||
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane | Many suppliers | ||
Ultrapure water (Milli-Q) | Merck | ||
urea | Many suppliers | ||
Vortex | Many suppliers |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены