Ограниченная подстилка и гнездование как модель неблагоприятных условий в раннем возрасте у мышей

Этот протокол описывает животную модель для изучения того, как невзгоды в раннем возрасте, спровоцированные бедной окружающей средой и непредсказуемой материнской заботой в ранний постнатальный период, влияют на развитие мозга и будущий риск психических расстройств.

Неблагоприятные условия в раннем возрасте, такие как жестокое обращение, пренебрежение, нехватка ресурсов и непредсказуемая домашняя обстановка, являются известным фактором риска развития нервно-психических расстройств, таких как депрессия. Животные модели ELA использовались для изучения влияния хронического стресса на развитие мозга и, как правило, полагаются на манипулирование качеством и/или количеством материнской помощи, поскольку это основной источник опыта ранней жизни у млекопитающих, включая человека. Здесь представлен подробный протокол использования модели Limited Bedding and Nesting (LBN) на мышах. Эта модель имитирует среду с ограниченными ресурсами, которая провоцирует фрагментарные и непредсказуемые модели материнской заботы во время критического окна развития (послеродовые дни 2-9) путем ограничения количества материалов для гнездования, предоставляемых матери для строительства гнезда для ее детенышей, и отделения мышей от подстилки с помощью сетчатой платформы в клетке. Представлены репрезентативные данные, иллюстрирующие изменения в поведении матерей, а также уменьшение веса детенышей и долгосрочные изменения базальных уровней кортикостерона, которые являются результатом модели LBN. Было показано, что во взрослом возрасте потомство, выращенное в среде LBN, демонстрирует аберрантную реакцию на стресс, когнитивный дефицит и поведение, подобное ангедонии. Таким образом, эта модель является важным инструментом для определения того, как созревание чувствительных к стрессу мозговых цепей изменяется под действием ELA и приводит к долгосрочным изменениям в поведении, которые придают уязвимость к психическим расстройствам.

Ранний постнатальный период является критическим окном развития, в котором воздействие окружающей среды может изменить траекторию развития. Например, неблагоприятные обстоятельства в раннем возрасте (ЭЛА) могут изменить развитие мозга, провоцируя долгосрочные изменения в когнитивных и эмоциональных функциях. Примеры ЭЛА включают физическое или эмоциональное насилие, пренебрежение, неадекватные ресурсы и непредсказуемую домашнюю обстановку, происходящую в детстве или подростковом возрасте¹. Известно, что ЭЛА является фактором риска развития таких расстройств, как депрессия, расстройство, связанное с употреблением психоактивных веществ, посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) и тревога 2,3,4,5. Это важно, учитывая, что уровень детской бедности в США за последнее время вырос более чем в два раза, с 5,2% в 2021 году до 12,4% в 2022 году⁶, и хотя бедность сама по себе не обязательно является ELA, она действительно увеличивает вероятность различных типов ELA⁷.

Животные модели уже давно играют важную роль в понимании влияния стресса в раннем возрасте на развитие мозга и результаты взрослой жизни. Двумя основными животными моделями, используемыми в последние годы для анализа этого явления, являются материнское разделение (РС) и обедненная окружающая среда, вызванная ограниченным количеством подстилочных и гнездовых материалов (LBN). РС был разработан как модель родительской депривации⁸. В нем грызунов-самок отнимают у их детенышей, обычно на несколько часов, каждый день до^{отлучения} от груди 8 лет. Было обнаружено, что парадигма рассеянного склероза приводит к депрессивному и тревожному поведению во взрослом^{возрасте, а} также к аберрантной реакции на хронический стресс^10,11. С другой стороны, модель LBN, впервые разработанная в лаборатории^{Baram 12}, не отделяет самку от детенышей, а скорее модифицирует среду, в которой выращиваются детеныши, имитируя среду с низкими ресурсами^12,13. Уменьшение количества гнездового материала и предотвращение прямого доступа к подстилке в этой модели приводит к нарушению материнского ухода со стороны матерей³. Поскольку для правильного развития когнитивных и эмоциональных цепей мозга требуется надежная и предсказуемая материнская^{помощь14}, фрагментарная материнская помощь со стороны LBN может привести к целому ряду исходов, включая гиперактивную гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось (HPA), смещение возбуждающе-ингибиторного баланса в нескольких областях мозга, повышение уровня кортикотропин-рилизинг-гормона (CRH) и депрессивное поведение^{у потомства.} 15,16,17,18,19.

Точный механизм, с помощью которого ЭЛА приводит к повышенному риску развития нервно-психических расстройств, до конца не изучен. Считается, что это связано с изменениями в схемах оси HPA^19,20, и последние данные показывают, что это может быть вызвано изменениями в микроглиальном синаптическом обрезании19. Было показано, что модель LBN является важным инструментом для понимания влияния перинатальной среды на развитие мозга и долгосрочные поведенческие результаты. Хотя эта модель первоначально была разработана для крыс, она также была адаптирована для мышей, чтобы воспользоваться преимуществами существующих трансгенных^{инструментов.} Примечательно, что модель очень похожа у обоих видов и провоцирует очень сходящиеся результаты, такие как изменения в оси HPA, когнитивный дефицит и депрессивное поведение, тем самым подчеркивая ее межвидовую полезность и трансляционный потенциал. В этой статье будет подробно описано, как использовать модель ограниченной подстилки и гнездования у мышей, собирая и анализируя материнское поведение и исходы потомства для проверки эффективности модели и ожидаемых результатов.

Все процедуры с участием животных были выполнены в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университета штата Джорджия (номер одобрения A24011). Мышей разводили и содержали в помещениях для животных Университета штата Джорджия. Эксперименты проводились на штамме C57BL/6J в перинатальном периоде (постнатальный день [P] 2-10) и включали мужчин и женщин. Реагенты и оборудование, использованные для данного исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Настройка материала

1. Разрежьте сетчатый разделитель в соответствии с размерами клетки, оставив лишний 3 см на более длинных сторонах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сетка, указанная в таблице материалов, разрезается производителем.
2. Загните края, включая излишки, таким образом, чтобы создать платформу, точно прилегающую к краям клетки и имеющую высоту ~2,5 см над полом. Это позволит моче и фекалиям проходить через сетчатый разделитель, при этом животные не смогут извлечь подстилку из кукурузных початков. Наконец, убедитесь, что все острые края загнуты, чтобы предотвратить причинение вреда животным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатые разделители являются многоразовыми и должны быть тщательно очищены между использованием горячей водой с мылом с последующим распылением 70% этанола.
3. Установите камеры на штативы и подготовьте систему записи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать программное обеспечение для управления видео. В результате этих записей .mp4 файлы, которые автоматически объединяются в сегменты по 1 часу.
4. Настройте параметры для непрерывной записи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные рекомендуемые настройки: разрешение 1920 x 1080 и 30 кадров/с.
5. Разделите полученные .mp4 файлы на сегменты по 1 часу, если это не делается автоматически программным обеспечением для управления видео.
6. Если вы анализируете период выключения света, используйте инфракрасное освещение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить блики при записи на боковой стороне клетки, рекомендуется отключить инфракрасное (ИК) излучение от камеры. Вместо этого используйте инфракрасные прожекторы в комнате во время записи темной фазы.

2. Парадигма ограниченной подстилки и гнездования (LBN)

1. Спаривайте 1-4 самки с одноместным заводчиком-самцом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый возраст для первого спаривания у экспериментальных самок - P75. Использование нерожавших самок является идеальным, но в ситуациях, когда это невозможно, например, с ценными трансгенными линиями мышей, повторнородящие самки могут продолжать размножение в течение примерно четырех месяцев после этого. Рекомендуется, хотя и не обязательно, ежедневно проверять наличие вагинальных пробок, чтобы подтвердить день спаривания (эмбриональный день [E]0).
   1. Как только плотины забеременеют, сведите к минимуму возмущения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Многородящие самки, как правило, могут быть повторно использованы для производства до пяти пометов, прежде чем фертильность снизится. Если плотины используются повторно для эксперимента, их следует предпочтительно использовать для одного и того же условия каждый раз или переключать только с контрольного на LBN, но никогда наоборот, чтобы избежать любых остаточных долгосрочных эффектов LBN на плотину.
2. На E17 (или если пробки не были проверены, когда самки выглядят явно беременными) разделите самок в их собственную стандартную клетку из плексигласа и дайте им одно хлопчатобумажное гнездо (5 х 5 см) для постройки гнезда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимально перемещать отделенных самок в тихое, небольшое помещение вдали от основного помещения колонии с 12-часовым циклом света/темноты и минимальными помехами со стороны персонала для контроля и установки LBN.
3. Запишите дату рождения (около E19).
4. В точке P2 посчитайте и полезуйте щенков. Случайным образом назначайте подстилки в LBN или контрольные условия (если это первая подстилка матери). Это взаимодействие со щенками должно быть завершено в период от 1 до 4 часов после включения света.
   1. Аккуратно поместите щенков в новую, чистую клетку, чтобы отсортировать по полу. Аногенитальное расстояние между анусом и гениталиями больше у самцов, чем у самок, и может использоваться в качестве идентификатора.
   2. Разделите самцов и самок на группы, чтобы сосчитать их.
   3. Отбраковывайте пометы с более чем 8 щенками и отбраковывайте пометы с менее чем 4 детенышами. Оптимальный размер помета – 4-8 щенков, так как все, что выходит за пределы этого диапазона, может помешать распределению материнской заботы во время исследования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переменные, на которые может повлиять размер помета, — это вес щенка, возможность кормления и взаимодействие матери и щенка, что может затруднить проведение эксперимента. В идеале мыши не должны подвергаться перекрестному вскармливанию, поскольку у них меньше шансов выжить, чем у крыс.
5. Настройте условия Control и LBN, как показано на рисунке 1.
   1. Управление: Используйте клетку для обуви для мыши стандартного размера (19,4 см x 13,0 см x 38,1 см) с ~220 г подстилки из кукурузных початков (в зависимости от размеров клетки, стремясь к высоте ~1 см) и одним стандартным квадратным хлопчатобумажным гнездом (5 x 5 см).
      1. Чтобы помочь мышам акклиматизироваться к этой незнакомой среде, поместите по одной из их фекальных гранул из старой клетки в каждый угол новой клетки. Кроме того, поместите небольшое количество использованного хлопчатобумажного гнезда из предыдущей клетки поверх нового гнезда.
   2. LBN: Поместите заранее подготовленный сетчатый разделитель в стандартную клетку из-под обуви с ~110 г подстилки из кукурузных початков (стремясь к высоте ~0,5 см). Сетка должна предотвращать прямой контакт между мышами и подстилкой из кукурузных початков.
      1. Наконец, добавьте половину квадрата хлопчатобумажного гнезда (2,5 х 5 см). Повторите все описанные выше шаги, чтобы помочь с акклиматизацией.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется содержать клетки для обувных коробок на стандартных, невентилируемых стеллажах, поскольку было доказано, что такая установка бесшумна и не вызывает переохлаждения у щенков, выращенных в клетках^{LBN 21}. Однако это может быть не так при повышенном потоке воздуха в вентилируемых клетках; Поэтому исследователи должны измерять уровень шума и температуру ядра детенышей в своей системе, если они используют вентилируемые клетки.
6. Посадите щенков в предназначенную для этого клетку и поместите их на вершину гнезда. Далее поместите дамбу в клетку лицом к детенышам, так как это поможет ей быстрее заметить их присутствие. Убедитесь, что в организм включено достаточное количество пищи и воды в течение как минимум 8 дней, чтобы не беспокоить клетку до конца эксперимента на уровне P10.
7. Поместите камеру на штатив перед клеткой, чтобы обеспечить четкий боковой обзор плотины и ее детенышей. При необходимости разместите зеркала вокруг клетки, чтобы лучше захватить все углы. Несмотря на то, что необходимо анализировать только 1 час видеозаписи в день, камера настроена на непрерывную запись 24/7 во время эксперимента, чтобы можно было отслеживать помехи.
   Примечание: За мышами также можно наблюдать лично, а поведение матери можно измерять вручную, хотя предпочтительнее видеозапись, чтобы предотвратить любые нарушения из-за присутствия экспериментатора в комнате. Если используются вентилируемые стеллажи, также может потребоваться использовать другую процедуру для установки камер для записи ухода за матерью, отличную от описанной здесь.
8. Утром P10 верните всех животных в стандартные условия содержания в клетке (в идеале идентичные контрольным условиям, описанным выше) и взвесьте щенков.
9. Относитесь ко всем щенкам одинаково и отлучите от груди в P21 в группы по 2-5 однополых однополых однопометников.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь по возможности размещать однополых однопометников вместе, но при необходимости размещайте однополых детей из разных пометов в одинаковых условиях. Рекомендуется избегать одновременного контроля содержания и потомства LBN (см. Yang et al. о влиянии кагематного состава на поведенческие фенотипы²²).

Рисунок 1: Пример настройки каркаса. На клере в левой части изображения показана стандартная контрольная клетка (CTL), содержащая полное количество подстилки и полное гнездо. В клетке с правой стороны показана ограниченная подстилка и гнездование (LBN) с половиной количества подстилки, половиной гнезда и сетчатой перегородкой для отделения животных от подстилки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Оценка материнского поведения

1. Несмотря на то, что в этой конфигурации собираются непрерывные записи, анализируйте только 1 час от P3 до P6. Рекомендуется анализировать видео, записанные не ранее, чем через 1 час после смены освещения, чтобы дать возможность привыкнуть, и анализировать видео в одно и то же время каждый день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Период от Р3 до Р6 обычно содержит наибольшие различия в уходе за матерями из-за LBN; Поэтому стоит только проанализировать эти дни. Предлагаемое время наблюдения/регистрации позволяет фиксировать активность после перехода от активного к неактивному циклу или наоборот. Тем не менее, неактивная фаза — это когда самка с наибольшей вероятностью будет заниматься материнским уходом, и ранее было показано, что она содержит наибольшие групповые различия^{в поведении матерей}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Записывайте P2 позже, чем в другие дни, потому что мышам требуется не менее 1 часа, чтобы привыкнуть к смене клетки. Если эта переменная не представляет интереса, исключите этот день из анализа.
2. Оцените все поведения, как показано в таблице 1. Как правило, поведение оценивается в течение первых 50 минут после начала сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать вручную или в электронном виде с помощью интерактивного программного обеспечения для поведенческих наблюдений (BORIS, программное обеспечение с открытым исходным кодом) или аналогичного программного обеспечения. Приведенные ниже инструкции предназначены для подсчета очков рук и могут быть адаптированы для любого выбранного программного обеспечения.
3. В распечатанной таблице запишите наблюдаемое поведение, используя аббревиатуру, время начала и продолжительность боя, а также любые описательные примечания. Например, если самка активно кормит грудью, а затем покидает гнездо, но к ней все еще прикреплены детеныши, обратите на это обозначение как AN, за которым следует O. Описание щенков (и их количества) следует сохранить в виде примечания сбоку на случай, если это понадобится позже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любое поведение длиной менее 3 секунд не анализируется. Это правило помогает отфильтровать сиюминутное поведение из-за внешних возмущений, таких как шум окружающей среды. Исключение составляют случаи, когда происходит видимое прерывание поединка с АН (например, из-за большого движения или растяжения), которое быстро возобновляется. В этом случае отмечается поведение AN, за которым следует N-AN, как описано в таблице 1.
4. В случае одновременного выполнения нескольких действий запишите наиболее активное из них. Примером этого может служить ситуация, когда самка плохо кормится, но позже начинает вылизывать и ухаживать за собой, отмечается, что низкий уровень кормления прекращается, и следующее поведение должно быть помечено как LG с пометкой, что это произошло во время LN.

Таблица 1: Описание поведения по уходу за матерью.

4. Анализ данных о поведении матерей

1. Сведите результаты подсчета баллов в таблицу.
2. Если видео анализировались в электронном виде, удалите поведения с боями короче 3 с, как описано в шаге 3.
3. Рассчитайте среднюю продолжительность схватки, среднюю частоту и общую продолжительность вылизывания и груминга для каждого дня наблюдения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описательная статистика может быть проведена для любого из оцененных моделей поведения, но вылизывание и груминг, как правило, представляют собой наиболее очевидное нарушение с точки зрения фрагментации LBN (т.е. более короткие и частые схватки). Эти переменные могут быть проанализированы как среднее значение по P3-P6 или как повторяющиеся измерения по дням, чтобы найти любые изменения с течением времени, если это представляет интерес.

5. Расчет энтропии

Примечание: Энтропия, или непредсказуемость, поведения матери при уходе за матерью рассчитывается на основе метода, предложенного Vegetabile et ^al.23. Этот метод основан на предположении, что материнское поведение действует как цепь Маркова, которая может быть использована для оценки уровня энтропии поведенческой последовательности. Последовательность поведения каждой плотины характеризуется с помощью эмпирической матрицы переходов ij> _{i,j = 1... 7} условных вероятностей перехода от одного поведения (i) к другому поведению (j), и из этого вычисляется коэффициент энтропии как описано ранее ^3,23 и следующим образом:

где p_ij — условная вероятность того, что поведение j будет наблюдаться после того, как плотина выполнит поведение i, π_i — частота, с которой наблюдается поведение i, а M (=7) — общее количество различных поведений. Читатель может обратиться к Вегетабиле и ^др.23 для обсуждения теоретических основ уравнений; здесь основное внимание уделяется тому, как применить метод в модели LBN.

1. Чтобы вычислить это, настройте формат, необходимый для анализа.
   1. Объедините AN, LN, SN и N-AN в одну переменную с именем N, сложив время, так как все они связаны с сестринским делом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Таблице 1 для описания поведения при оказании материнской помощи.
   2. Добавьте в О поведения, которые не связаны с поведением, направленным на себя или щенка (М и О).
   3. Введите LG, E, SG, C и NB по отдельности, чтобы получить 7 вариантов поведения.
2. Создайте таблицу со столбцами в следующем порядке: ID мыши, ID помета, Litter #, Treatment, Day, Time, Behavior и Status.
   1. В идентификаторе мыши добавьте линию мыши/генотип матери.
   2. В идентификаторе помета используйте идентификатор плотины, за которым следует номер помета.
   3. В помете # укажите количество пометов, которое было на плотине.
   4. Убедитесь, что лечение является LBN или Control, в соответствии с условиями, в которых были помещены животные.
   5. Укажите день как соответствующий анализируемый послеродовой день.
   6. Укажите время в качестве временной метки в видео, когда поведение начало и окончание (относительно начала записи).
   7. Выберите поведение из семи описанных ранее (N, O, LG, E, SG, C и NB) (Таблица 1).
   8. Отметьте два типа статусов: СТАРТ и СТОП. Следовательно, каждое поведение будет отображаться дважды; Первая нотация обозначает начало, а вторая — стоп.
3. Следуя этому формату, включите информацию обо всех анализируемых днях.
4. В среде R импортируйте наборы данных, которые были отформатированы как указано выше.
5. Установите пакеты, доступные в https://github.com/bvegetabile/entropyRate.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение этого кода приводит к созданию папки с именем LBN; Независимо от условия, в этой папке содержится вычисленная энтропия. Кроме того, энтропия каждого дня может быть затем усреднена субъектом для P3-P6 и сравнена между условиями.

Репрезентативные результаты демонстрируют, как ELA, вызванная бедной средой в клетках LBN, влияет на материнскую заботу со стороны матерей и физиологические исходы потомства. Суточная энтропия в поведении матери при уходе за матерью выше в LBN в дни P3-P6 (F_1,58 = 7,21, p = 0,0094; Рисунок 2А), а также среднюю энтропию каждой плотины за этот период времени (t₁₅ = 3,03, p = 0,0085; Рисунок 2В). Примечательно, что не существует существенной разницы в среднем коэффициенте энтропии между разными пометами от одной и той же плотины при содержании в одной и той же группе обработки (F_1,699,4,247 = 0,57, p = 0,58; Рисунок 2C), предполагая, что уровень энтропии может быть относительно стабильным признаком для каждой плотины. Среди всех видов поведения, вылизывание и груминг являются наиболее фрагментированными в LBN³. Самки LBN демонстрируют более высокую частоту вылизывания и вылизывания своих детенышей (LG) (t₁₆ = 4,04, p = 0,0010; Рисунок 2D) и в более коротких схватках (t₁₆ = 3,25, p = 0,0050; Рисунок 2E). Однако существенной разницы в общей продолжительности LG между контрольной плотиной и плотиной LBN нет (t₁₆ = 1,52, p = 0,15; Рисунок 2F).

Рисунок 2: Анализ поведения матери. (A) Суточный коэффициент энтропии выше в плотинах с ограниченным подстиланием и гнездованием (LBN) по сравнению с управление (CTL), проанализированное с помощью модели смешанных эффектов (F_1,58 = 7,21, p = 0,0094). (B) Средняя скорость энтропии выше в плотинах LBN по сравнению с CTL (t₁₅ = 3,03, p = 0,0085). (C) Средний коэффициент энтропии (P3-P6) существенно не отличается для нескольких пометов в пределах одной и той же плотины при содержании в одной и той же группе обработки (F_1,699,4,247 = 0,57, p = 0,58). Каждая линия представляет собой одну плотину. (D) Совокупная частота вылизывания и груминга (LG) выше для матерей LG по сравнению с CTL (t₁₆ = 4,04, p = 0,0010). (E) Средняя продолжительность боя LG короче для матерей LG по сравнению с CTL (t₁₆ = 3,25, p = 0,0050). (F) Совокупное время, затраченное на LG, существенно не отличается из-за LBN (t₁₆ = 1,52, p = 0,15). Данные имеют среднее значение ± SEM, * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Детеныши, выращенные в условиях LBN, значительно меньше при P10 (t₆₁ = 6,30, p < 0,0001; Рисунок 3А). Эта разница обычно сохраняется в возрасте отъема (t₆₂ = 6,29, p = <0,0001; Рисунок 3В) но к зрелому возрасту уже не наблюдается (t₃₈ = 1,08, p = 0,29; Рисунок 3В). Тем не менее, уровни кортикостерона повышаются на исходном уровне во взрослом возрасте (t_18,79 = 2,23, p = 0,038; Рисунок 3D), предполагая устойчивые физиологические эффекты LBN. Таковы ожидаемые отличия в успешной экспериментальной установке. В случае неоптимальной конфигурации значения длины боя LG, энтропии и веса детеныша могут не иметь различий, вероятно, из-за стрессовой «контрольной» группы. Для целей данной статьи пол был схлопнут при анализе исходов потомства, потому что половые различия обычно не наблюдаются в описанных здесь физиологических исходах; Тем не менее, половые различия в других типах исходов, таких как когнитивное и эмоциональное поведение, обычно отмечаются в этой модели и должны быть исследованы далее⁴.

Рисунок 3: Исходы для потомства. (A) Ограниченная подстилка и гнездование (LBN) снижает вес детеныша, измеренный на уровне P10, непосредственно перед возвращением в стандартные клетки (t₆₁ = 6,30, p < 0,0001). (B) Вес все еще уменьшается на LBN в возрасте отъема (t₆₂ = 6,29, p < 0,0001). (C) Вес взрослой особи больше не отличается из-за LBN (t₃₈ = 1,08, p = 0,29). (D) Исходная концентрация кортикостерона во взрослом возрасте увеличивается на LBN, что анализируется с помощью t-критерия Уэлча (t_18,79 = 2,23, p = 0,038). На всех графиках самки показаны кружками, а самцы — треугольниками. Данные имеют среднее значение ± SEM, *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В этой статье представлен подробный протокол применения модели LBN на мышах. Эта модель является важным инструментом для понимания того, как этологически и трансляционно значимая форма хронического стресса в раннем возрасте способствует развитию психоневрологических расстройств^{у потомства}. Он также полезен для изучения материнского поведения и любых изменений в мозге матерей с молекулярной, нейроэндокринной или схемной^{точки зрения}. Для таких типов вопросов мультипаритет может быть более важной переменной, которую следует учитывать. Мы заметили, что показатели энтропии материнского поведения остаются постоянными в нескольких пометах в пределах одной и той же матери (рисунок 2C), предполагая, что энтропия может быть в некоторой степени стабильной чертой для каждой матери. Этот вывод может оправдать использование многоплодных самок мышей, когда невозможно использовать только нерожавших самок, например, в случае дорогостоящих или редких трансгенных мышей. Из-за возможного непреднамеренного влияния мультипаритета на другие переменные (например, внутриматочную среду) рекомендуется, чтобы экспериментатор проводил статистический контроль использования многоплодных самок во время анализа данных.

Важно отметить, что эта модель очень чувствительна к возмущениям окружающей среды. Несколько факторов могут нарушить работу животных, вызывая проблемы и неоптимальные результаты, такие как затопление клетки или громкие звуки, например, от близлежащей постройки. Как правило, эти нарушения приводят к тому, что контрольные животные испытывают стресс, и, следовательно, не будет никаких различий между контрольными и LBN условиями. Индикатором этих проблем может быть сходный вес у щенков контрольной группы и LBN на уровне P10 и сходные значения энтропии в поведении матери. Из-за этого идеальной обстановкой является комната материнского ухода, которая используется только для этой цели, тихо и вдали от колонии и другого лабораторного персонала. Нарушения также могут привести к каннибализму щенков, особенно у матерей моложе P75. Риск потери щенков из-за каннибализма ниже у матерей после P75 и часто после первого помета. Альтернативная версия этого метода сдвигает время экспериментальной манипуляции на P4-P11, чтобы^{еще больше снизить} риск каннибализма^. Хотя в нынешних лабораторных условиях в этом нет необходимости. Другая версия LBN не использует сетчатый разделитель, но все же ограничивает количество подстилки и материала для гнезда в течение всего послеродового^{периода до} отъема. Важно отметить, что изменение временной шкалы может привести к различным результатам, таким как агрессивное поведение матери, которое, в свою очередь, может привести к различным исходам для потомства, таким как тревожное поведение^25,28. Другие распространенные проблемы включают потерю данных о поведении матери из-за угла обзора камеры и большого размера гнезда; Чтобы помочь в этом, рекомендуется поставить зеркало в задней части клетки и обязательно предусмотреть только одно гнездо в контрольном состоянии, чтобы гнездо не стало слишком большим и не скрыло щенков от камеры. Наконец, важно убедиться, что сетка правильно прилегает к клетке, чтобы щенки не застряли или не поранились.

Преимущество модели LBN в том, что она легко настраивается и комбинируется с другими экспериментальными факторами. Примерами переменных, которые могут быть добавлены в этот протокол, являются диета^29,30, иммунные проблемы^30,31, различные трансгенные линии^32,33 и хемогенетика¹⁹. Более того, некоторые версии этой модели используют временные рамки P10-P17 и сочетают их с материнским разделением (MS)34,35,36. Эта парадигма также была адаптирована в качестве пренатального стрессора, когда самки размещаются в среде LBN от E14 до E19^37,38, но детеныши никогда не подвергаются стрессу напрямую. Наконец, в некоторых исследованиях используется двухударная модель, которая включает в себя ELA в сочетании с различными стресс-тестами на потомстве, когда они достигают взрослого возраста^19,39.

Одним из ограничений этого метода является то, что он не обладает высокой пропускной способностью. Объем данных, которые он производит, ограничен количеством камер и пространством, доступным одновременно, хотя помет можно легко распределить по времени. Ручная оценка материнского поведения занимает особенно много времени и может привести к систематической ошибке наблюдателя, но в настоящее время разрабатывается автоматизированная оценка⁴⁰ благодаря появлению подходов, основанных на машинном обучении. Если данные оцениваются вручную, рекомендуется, чтобы один и тот же человек оценивал все видео для одного эксперимента, чтобы уменьшить вариабельность между наблюдателями. Еще одним ограничением является то, что эта модель предназначена для грызунов, которые полагаются в первую очередь на материнскую заботу, что затрудняет изучение биродительской опеки. Тем не менее, некоторые группы приняли отцовскую депривацию в качестве альтернативы рассеянному склерозу у видов с двумя родителями, таких как калифорнийская мышь^41,42, поэтому вполне возможно, что LBN также может быть адаптирован для этих видов.

Помимо LBN, разлучение матерей является еще одной наиболее заметной моделью для ELA, потому что другие формы стресса, используемые у взрослых особей (например, стресс ограничения), не являются этологически релевантными и не влияют на щенков таким же образом. РС отличается от РС тем, что это форма хронического стресса, которая вызывает фрагментированное и непредсказуемое поведение матери, в то время как при РС депривация носит прерывистый характер и обычно происходит в предсказуемое время^{каждый день.} Интересно, что обе модели могут вызывать изменения в оси HPA и депрессивное поведение у грызунов, хотя LBN может быть более воспроизводимым протоколом с меньшим взаимодействием экспериментаторов и более высокой согласованностью между ^{лабораториями.} Хотя этот протокол полезен для смягчения некоторых источников изменчивости (например, связанных с экспериментаторами), другие аспекты, такие как различия в помещениях для животных, происхождение животных или штаммы, могут повлиять на результаты. Например, известно, что мыши BALB/c имеют более выраженную реакцию на хронический удерживающий стресс и могут быть дифференциально чувствительны к ELA, чем C57BL/6J ^27,44.

В заключение следует отметить, что модель LBN использует среду с ограниченными ресурсами и непредсказуемой материнской заботой и является полезным подходом к пониманию того, как стресс в раннем возрасте влияет на широкий спектр процессов, таких как физиологическая адаптация к стрессу, материнское поведение и развитие мозга. Примечательно, что эта модель была использована для понимания того, как и почему ЭЛА является фактором риска развития нервно-психических расстройств 1,5,9,12. В будущем использование LBN улучшит наше понимание биологических основ как психических, так и физических расстройств и поможет пролить свет на новые терапевтические мишени для лечения последствий стресса в чувствительный перинатальный период.

У авторов нет конфликта интересов.

Эта работа была поддержана премией NIMH K99/R00 Pathway to Independence Award #MH120327, грантом Фонда Уайтхолла #2022-08-051 и грантом NARSAD для молодых исследователей #31308 от Фонда исследований мозга и поведения и Фонда Джона и Полли Спаркс. Авторы хотели бы поблагодарить Отдел животных ресурсов Университета штата Джорджия за исключительную заботу о наших животных, а также Райана Слита за его отличную техническую поддержку в настройке и обслуживании нашей системы управления видео. Д-р Болтон также хотел бы поблагодарить д-ра Талли З. Барам за отличную подготовку по правильному внедрению модели LBN во время ее постдокторской стипендии.