Метод экстракции апопластов для повышения чистоты рекомбинантного белка растительного происхождения

Очистка рекомбинантных белков из растительных систем обычно осложняется растительными белками. В данной работе представлен метод эффективного извлечения и очистки секретируемого рекомбинантного белка из апопласта Nicotiana benthamiana.

Растения являются недавно развивающейся эукариотической системой экспрессии, которая исследуется для производства терапевтических белков. Очистка растений от рекомбинантных белков является одним из наиболее важных этапов производственного процесса. Как правило, белки очищали от общего количества растворимых белков (TSP), и присутствие различных внутриклеточных белков и цитохромов создает проблемы для последующих этапов очистки белков. Более того, большинство терапевтических белков, таких как антигены и антитела, секретируются для получения надлежащего гликозилирования, а присутствие не полностью модифицированных белков приводит к несогласованным структурам антигенов или антител. В данной работе представлен более эффективный метод получения высокоочищенных рекомбинантных белков из апопластического пространства растений. Рекомбинантный зеленый флуоресцентный белок (GFP) секретируется в апопласт Nicotiana benthamiana , а затем экстрагируется методом инфильтрации-центрифугирования. GFP-His из экстрагированного апопласта затем очищается с помощью аффинной хроматографии никеля. В отличие от традиционных методов из TSP, при очистке от апопластов образуются высокоочищенные рекомбинантные белки. Это представляет собой важное технологическое усовершенствование для систем растениеводства.

В настоящее время изучаются различные рекомбинантные терапевтические белки растительного происхождения, включая антитела, вакцины, биоактивные белки, ферменты и малые полипептиды 1,2,3,4,5,6. Растения становятся все более используемой платформой для производства терапевтических белков благодаря их безопасности, низкой стоимости и способности быстро масштабировать производство ^7,8. Экспрессия и модификация белка в растительных системах, наряду с очисткой белка, являются критическими факторами, определяющими производительность растительных биореакторов ^9,10. Повышение продуктивности растений и получение целевых белков высокой чистоты являются основными задачами, стоящими перед производственными системами на растительной основе^11,12.

Субклеточная локализация и модификация рекомбинантных белков зависит от специфического сигнального пептида, кодируемого на N-конце, который нацелен на белок до его конечного назначения в органелле во время экспрессии генов. Рекомбинантные белки предназначены для локализации в апопласте, эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), хлоропласте, вакуоле или цитоплазме на основе их уникальных свойств¹³. В отношении антигенов и антител предпочтение отдается секретируемым белкам. Перед секрецией белки проходят через ER и Гольджи для правильного сворачивания и посттрансляционных модификаций 14,15,16.

После производства в растениях рекомбинантные белки должны быть очищены от растительных экстрактов. Как правило, белки очищаются от общих растворимых растительных экстрактов, которые содержат большое количество внутриклеточных белков, неправильно свернутых и немодифицированных продуктов, а также цитохромов¹⁷. Для удаления примесей растительные экстракты подвергаются обширному фракционированию, включающему рибулоз-1,5-бисфосфаткарбоксилазу/оксигеназу (RuBisCO)-специфическую аффинную хроматографию, осаждение фитатов, осаждение полиэтиленгликоля, а также регулировку температуры и pH^18,19. Такие этапы удаления примесей трудоемки и могут ухудшить качество белка.

Компартмент растительной клетки за пределами плазматической мембраны определяется как апопласт, охватывающий клеточную стенку, межклеточные пространства и ксилему²⁰. Водная фаза обычно называется апопластной промывочной жидкостью (AWF). AWF содержит молекулы, секретируемые клетками для регуляции многочисленных биологических процессов, таких как транспорт, метаболизм клеточной стенки и реакции на стресс^21,22. В отличие от TSP, молекулярные составляющие AWF менее сложны. Экстракция рекомбинантных белков из AWF может предотвратить контаминацию внутриклеточными белками, неправильно свернутыми продуктами и цитоплазматическими остатками. Вкратце, экстракционный липид поступает в листья через устьица под отрицательным давлением, а AWF собирается путем щадящего центрифугирования²³. В то время как выделение AWF широко используется для изучения биологического прогресса внутри apoplast 24,25,26,27, оно не использовалось в системах производства на растительной основе.

Повышение продуктивности растений и получение целевых белков высокой чистоты являются центральными задачами для систем растениеводства²⁸. Как правило, белки очищают от общих растворимых растительных экстрактов, содержащих большое количество внутриклеточных белков, неправильно свернутых и немодифицированных продуктов, а также цитохромов²⁹, которые требуют больших затрат на последующую очистку30. Использование методов экстракции белка AWF для экстракции экзогенных рекомбинантных белков, секретируемых в апопласт, позволяет эффективно улучшить гомогенность рекомбинантных белков и снизить затраты на очистку белков. В данной работе мы используем сигнальный пептид PR1a для обеспечения секреции экзогенного белка в апопластное пространство и представляем подробный метод очистки рекомбинантного белка из AWF N. benthamiana.

1. Подготовка растений N. benthamiana

1. Поместите рассадные блоки в лоток, добавьте 1 л воды и замочите примерно на 2 часа до полного насыщения.
2. Равномерно рассыпьте по рассадным блокам семена N. benthamiana дикого типа, накройте крышкой, и проращивайте в течение 1 недели. Выращивайте N. benthamiana в теплице с 18-часовым фотопериодом, 24 °C и относительной влажностью 45% и удобряйте каждые 2 недели.
3. Как только семена прорастут, аккуратно извлеките саженец с помощью пинцета, стараясь не повредить его корни. Выкопайте в центре нового лотка небольшую ямку, поместите в нее саженец, а корни слегка присыпьте почвой. Накрываем крышкой и продолжаем расти.
4. Выращивайте до тех пор, пока у рассады не появится три листочка, с закрытой крышкой. Снимите крышку, когда появится^4-й настоящий лист.
5. Дайте растениям продолжить рост еще две недели до агроинфильтрации.

2. Построение рекомбинантного GFP-HIS

1. Провести оптимизацию кодонов N. benthamiana и синтез GFP и PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) на основе последовательностей генов.
2. Проведите двойное разложение вектора pCAMBIA1300 с использованием ферментов Xba I и Sac I (см. таблицу материалов).
3. Выполнение амплификации PR1a с использованием восходящих праймеров (TTGGAGAGAGAACGGGGGACTCTAGAATGGGATT
   TGTTCTCTTTTC) и последующими праймерами (TCCTCG
   CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
   GTGGG), амплификация GFP с использованием восходящих праймеров (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGGGGACATGGTGAG
   CAAGGGCGAGGA) и последующими праймерами (GGGGAAATTCGAGCTCAGTGGTGATGGTGGTG
   GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
4. Использование гомологичной рекомбинации, клонирования PR1a и GFP в вектор экспрессии растений pCAMBIA1300. После переноса в E. coli выберите отдельные клоны и отправьте их в компанию для секвенирования. Сравнение результатов секвенирования и правильной плазмиды представляет собой рекомбинантную плазмиду pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, обозначаемую как p35s-PR1a-GFP-His.

3. Производство GFP-His в N. benthamiana

1. Добавьте 1 мкл плазмиды GFP в 50 мкл рецепторных клеток агробактерий GV3101, аккуратно перемешайте и добавьте в электродную чашку, снимите после поражения электрическим током на электрошокере.
2. Распределите трансформированные Agrobacterium tumefaciens на твердой средней пластине LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина (Kan) и 50 мкг/мл рифампицина (Rif). Инкубировать в перевернутом состоянии при 28 °C в течение 48 ч. Вектор pCAMBIA1300 устойчив к кану, а Agrobacterium устойчив к рифам; только правильная Агробактерия может расти на пластинах с каном и рифом. Моноклональные клоны представляли собой позитивные трансформанты, получившие название A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).
3. Используйте стерилизованную зубочистку, чтобы собрать нужное количество AtGPG и ввести его в 4 мл жидкого LB с Kan и Rif. Культивировать при 28 °C, 220-300 об/мин в течение 24 ч.
4. Субкультурируют бактерии 1:50 в свежие LB (50 мкг/мл Kan, 10 мМ 2-(N-Morpholino) этансульфоновую кислоту (MES), 20 мкМ ацетосирингон (AS)) и инкубируют при 28 °C, 220-300 об/мин в течение 10-12 ч.
5. Соберите бактерии центрифугированием при 1500 x g в течение 10 мин и повторно суспендируйте гранулу 1 мл MMA (10 мМ MgCl₂, 10 мМ MES pH 5,6, 100 мкМ AS).
6. Измерьте и отрегулируйте оптическую плотность (OD) AtGPG до OD₆₀₀ = 0,8 с помощью MMA. Инкубируйте бактерии еще 2-4 часа при комнатной температуре. Наберите бактериальный раствор с помощью безыгольного шприца, слегка прижмите его к тыльной стороне листьев и дайте давление для проникновения раствора в листья. Впрыскивайте только средние 3-4 листа на одно растение.
7. Продолжайте выращивать N. benthamiana в теплице за 3-4 дня до уборки листьев для извлечения белка.

4. Наблюдение за субклеточной локализацией GFP

1. После 48 часов агроинфильтрации выберите плоский лист и с помощью дырокола диаметром 6 мм зажмите лезвие для пробивки.
2. Капните 30% раствор сахарозы на предметное стекло, положите образец листа обратной стороной вверх и накройте покровным стеклом.
3. Установите длину волны возбуждения на 488 нм и определите зеленую флуоресценцию на длине волны 490-550 нм после увеличения 400x. Сделайте первую фотографию после того, как слайд будет готов, а еще одну через 10 минут.

5. Извлечение GFP из растения

1. Экстракция AWF
   1. Соберите неповрежденные свежие листья N. benthamiana, экспрессирующие рекомбинантный GFP, через 3 дня после агроинфильтрации. Обращайтесь с листом бережно и поддерживайте его целостность, чтобы избежать внутриклеточного оттока белка. Собранные листья используйте для следующего шага сразу, чтобы избежать деградации белка.
   2. Промойте листовую пластинку предварительно охлажденным ддН₂О для удаления мусора.
   3. Взвесьте свежие листья и погрузите 20 г листьев (абаксиальной стороной вниз) в 100 мл предварительно охлажденного 100 мМ фосфатного буфера (PB 100 mM Na₂, HPO₄ и 100 мМ₂PO₄ были сконфигурированы отдельно и перемешаны в соотношении 2,2:1 pH 7,0) в стакан объемом 200 мл с широким горлышком. Накройте листья нейлоновой мелкоячеистой нитью 100 меш (см. Таблицу материалов) и пластиковой тарелкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное охлаждение предотвращает расщепление белка. Объемы буфера можно регулировать в зависимости от экспериментального масштаба. Убедитесь, что все листья погружены в воду.
   4. Поместите стакан в вакуумный насос. Подайте вакуум 0,8 МПа на 1 мин, затем быстро восстановите до атмосферного давления.
   5. Извлеките листья из буфера и аккуратно промокните насухо впитывающей бумагой. Сверните листья, оберните сетчатой пряжей и поместите по 5 г листьев в каждую центрифугу объемом 50 мл. Чтобы собрать AWF, расположите свернутые листья кончиком вверх в трубках с сетчатой нитью, скрепленной колпачками трубок.
   6. Центрифуга при 4 °C, 500 x g в течение 5 минут. Удалите листья и соберите AWF на дно пробирки с помощью пипетки. Из каждой пробирки можно получить около 5 мл AWF.
      Примечание: Чтобы свести к минимуму интерференцию от внутриклеточных белков и извлечь максимальное количество белков AWF, экстракцию можно повторить 2-3 раза, но не более 3 раз.
2. Экстракция общего растворимого белка
   1. 20 г листьев измельчить в мелкий порошок в жидком азоте. Добавьте экстракционный буфер (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 1% Triton X-100, 0,034% β-меркаптоэтанол (см. Таблицу материалов)) в соотношении 1:2.
   2. Встряхните гомогенат в вертикальном миксере в течение 30 минут при температуре 4 °C. Центрифуга гомогенирует при давлении 13 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
   3. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и повторите центрифугирование в течение 15 минут. Переложите очищенную надосадочную жидкость в другую трубку.
   4. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) для получения общего растворимого белкового экстракта.

6. Очистка GFP-His с помощью никель(Ni)-аффинной хроматографии

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги при температуре 4 °C.

1. Добавьте смолу Ni sepharose excel (см. Таблицу материалов) в пробирку в соотношении 1:1000 относительно объема экстракта белка из шага 5.1.6. Объем смолы равен 1/1000-й^части объема белкового экстракта.
2. Промойте никелевую смолу 3x с 10-кратным объемом смолы ddH,₂O и PB (pH 7,0) отдельно по очереди и удалите надосадочную жидкость.
3. Инкубируйте белковый экстракт со смолой Ni в течение 2 часов, чтобы обеспечить полное связывание. Центрифугируйте при 500 х г в течение 5 мин для удаления несвязанных белков в надосадочной жидкости. Постирайте 3 раза с 20-кратным объемом смолы PB. Центрифугируйте при давлении 500 х г в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость.
4. Выведите GFP-His путем добавления 250 мМ имидазола в 10-кратном объеме смолы (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 250 мМ имидазола) и соберите надосадочную жидкость.

7. Кумасси синий окрашивание белков

1. Добавьте 10 μL загрузочного буфера 5x SDS к 40 μL образцов белка, кипятите в течение 10 минут, затем запустите на 15% SDS-PAGE при 110 В в течение 60 минут.
2. Окрашивать протеиновые гели раствором синего Кумасси (0,1% R-250, 25% изопропанол, 10% ледяная уксусная кислота) в течение 2 ч.
3. Слейте раствор и простирайте обесцвечивающим раствором в течение 2 ч. Понаблюдайте за гелем; Белки на геле будут окрашены в синий цвет.

8. Вестерн-блоттинг белков

1. Добавьте 10 μL загрузочного буфера 5x SDS к 40 μL образцов белка, кипятите в течение 10 минут, затем запустите на 15% SDS-PAGE при 110 В в течение 60 минут.
2. Перенос белков на мембрану из нитроцеллюлозы размером 0,45 мкм при давлении 280 мА. Закройте мембрану 5% обезжиренным молоком на 1 час.
3. Разбавьте антитела против His-tag в дозе 1:5000 и инкубируйте мембрану с антителами в течение 1 ч. Используйте трис-буферный физиологический раствор и подросток 20 (TBST) для промывания мембраны 4 раза в течение 5 минут.
4. Разведите антитела против мышей в соотношении 1:10000 и инкубируйте мембрану с антителами в течение 1 ч. Используйте TBST для промывки мембраны 4 раза в течение 5 минут.
5. Смешайте проявитель (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:1. Добавьте 400 μл в мембрану и дайте вступить в реакцию в течение 1 минуты. Делайте фотографии через 1 минуту выдержки с помощью документ-камеры.

9. Определение концентрации белка

1. Добавьте 5 мкл белка в 1 мл красителя Bradford 1x и вступайте в реакцию в течение 5 минут.
2. Определите значение OD₅₉₅ после обнуления и рассчитайте концентрацию белка по стандартной кривой.

10. Количественное определение белка ³¹

1. Проведите вестерн-блоттинг белковых проб вместе со стандартами.
2. Выполняйте количественную оценку GFP по отношению к стандартам с помощью анализа оттенков серого ImageJ 1.5.0.

GFP-His предназначен для секреции в апопластическое пространство N. benthamiana
GFP клонировали в плазмиду pCAMBIA1300 с N-концевым сигнальным пептидом PR1a для секреции и C-концевой His-меткой для очистки, генерируя p35s-PR1a-GFP-His (рис. 1A). Рекомбинантный белок был временно экспрессирован в N. benthamiana, и полоса в 30 кДа была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против His через 3 дня после агроинфильтрации (рис. 1B). Плазмолиз – это лечение листьев с помощью гипертонического раствора для отделения клеточной стенки от клеточной мембраны³². Чтобы определить, находится ли GFP в апопласте, мы использовали 30% сахарозу для проведения плазмолиза листьев. Флуоресцентная микроскопия показала присутствие GFP-His в апопласте (рис. 1C). Белки AWF, экстрагированные вакуумной инфильтрацией-центрифугированием, также содержали GFP-His (рис. 1D). Эти результаты демонстрируют секрецию GFP-His в AWF листьев N. benthamiana , из которых его можно извлечь для последующей очистки.

Очистка белка от AWF
Эффективность экстракции AWF сильно влияет на конечный выход GFP. Основываясь на опубликованных протоколах экстракции AWF 24,25,26,27, мы протестировали различные решения для оптимизации восстановления секретируемых GFP-His. Здесь были исследованы восемь экстракционных растворов: 25 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 100 мМ₂PO₄ (pH 4,5), 50 мМ NaCl (pH 7,1), 40 мМ KCl (pH 7,0), 20 мМ CaCl₂ (pH 5,7), 100 мМ PB (pH 7,0), 10 мМ MES (pH 5,6) и ddH₂O (pH 7,0). PB извлекал наибольшее количество AWF и GFP-His, превосходя другие решения более чем в 4 раза (рис. 2A, B). Сравнение PB при различных значениях pH показало улучшение экстракции AWF и GFP-His при нейтральных и слабощелочных условиях (pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 и 8,0; Рисунок 2C,D). Кроме того, сравнивали ПБ с концентрациями 50 мМ, 100 мМ и 150 мМ по эффективности экстракции. Результаты показали, что 100 мМ PB показали максимальную эффективность для восстановления как AWF, так и GFP-His (Рисунок 2E, F).

На основе этих экспериментов по оптимизации был выбран 100 мМ PB с pH 7,0 для крупномасштабной экстракции AWF из N. benthamiana. С помощью этого буфера из апопласта было извлечено 495 мкг общих белков AWF на грамм свежего листового материала (рис. 2G). Экстрагированный AWF содержал 10 г GFP-His (Рисунок 2H), что соответствовало примерно 18% от общего количества GFP-His в TSP (Рисунок 2I). После хроматографии Ni-affinity чистота GFP-His достигла 84,3% от экстракции AWF, что значительно выше, чем чистота 44,9%, достигнутая при экстракции общего растворимого белка (рис. 2J).

Рисунок 1: GFP-His предназначен для секреции в апопласт N. benthamiana. (A) Схема конструкции PR1a-GFP-His в векторе экспрессии растений pCAMBIA1300. (Б) Вестерн-блоттинг с обнаружением продукции GFP-His у N. benthamiana. Здесь было загружено и обнаружено 10 мкл образцов белка. Листья N. benthamiana, одновременно вводимые с ММА, использовали в качестве отрицательного контроля. Тот же объем образцов исследовали и окрашивали с использованием крупных субъединиц растений в качестве контроля нагрузки (С) Конфокальная микроскопия, показывающая субклеточную локализацию GFP-His (зеленый). Листья N. benthamiana были плазмолизированы 30% сахарозой. Белыми пунктирными линиями обозначена плазматическая мембрана. Красными стрелками обозначены GFP-Его накопление в апопласте. (D) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий присутствие GFP-His в экстрагированной апопластической жидкости. Здесь было загружено и обнаружено 10 мкл образцов белка. Листья N. benthamiana, одновременно вводимые с ММА, использовали в качестве отрицательного контроля. Сокращения: 35s = 2x промотор вируса мозаики цветной капусты 35s; PR1a = сигнальный пептид, связанный с патогенезом табака 1a; Его = в 6 раз больше его тега; Nos = терминатор нопалинсинтазы. BS = перед плазмолизом; PS = постплазмолиз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Оптимизация метода экстракции белка из AWF. (A-B) Экстракция белков из AWF с использованием различных буферов. Для экстракции белка из AWF были протестированы восемь растворов: 25 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 100 мМ₂PO₄ (pH 4,5), 50 мМ NaCl (pH 7,0), 40 мМ KCl (pH 7,0), 20 мМ CaCl₂ (pH 5,7), 100 мМ PB (pH 7,0), 10 мМ MES (pH 5,6) и ddH₂O (pH 7,0). Эффективность экстракции анализировали с помощью SDS-PAGE (A), а GFP-His детектировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против His (B). (К-Д) Экстракция с использованием ПБ при различных значениях рН. Для экстракции из AWF использовали PB с pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 и 8,0. Эффективность экстракции определяли с помощью SDS-PAGE (C), а GFP-His определяли с помощью вестерн-блоттинга анти-His антителами (D). (Э-Ж) Экстракция с использованием ПБ в различных концентрациях. Для извлечения из AWF использовали PB в концентрациях 50 мМ, 100 мМ и 150 мМ. Эффективность экстракции анализировали с помощью SDS-PAGE (E), а GFP-His детектировали с помощью вестерн-блоттинга антителами против His (F). (Г-Х) Количественный анализ экстрагированных белков. Белки экстрагировали с использованием 100 мМ PB (pH 7,0). Общий растворимый белок (G) и GFP-His (H) были количественно определены для статистического анализа. i) Статистический анализ доли АЖФ в общем объеме ОФВ. (J) Очистка GFP-His от общего количества растворимых белков N. benthamiana или AWF. Белки экстрагировали с использованием 100 мМ PB (pH 7,0), а GFP-His очищали с помощью Ni-аффинной хроматографии. Очистка была проанализирована с помощью SDS-PAGE. Крайняя правая полоса движения соответствует стандарту 1 μg BSA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Использование растений для производства терапевтических белков в последние годы быстро расширилось 1,2,3,4,5,6. Гены, кодирующие белки, клонируются в векторы экспрессии и доставляются в ткани растений с помощью агроинфильтрации. После производства растительными клетками белки очищаются для последующего применения. Как правило, рекомбинантные белки очищаются из экстрактов TSP. Однако большое количество растительных белков и цитохромов, выделяемых растительными клетками во время экстракции, может препятствовать^{очистке.} С одной стороны, растительные цитохромы могут закупоривать разделительные колонки, замедляя^{процесс17}; с другой стороны, высокораспространенные белки, такие как RuBisCO, трудно удаляются, что снижает чистоту^18,19. Эти проблемы становятся более проблематичными, когда целевые белки экспрессируются на низких уровнях. Очистка из AWF позволяет избежать этих проблем, обеспечивая более высокую чистоту (Рисунок 2J).

В то время как экстракция AWF широко используется в биологии растений 24,25,26,27, она редко используется в молекулярном сельском хозяйстве. Здесь мы используем растительную модель GFP для демонстрации очистки белка на основе AWF. Экстракцию GFP из AWF проводили путем добавления сигнального пептида, позволяющего секреции GFP в пространство апопластов. Этот метод позволяет извлекать белки с более высокой однородностью и снижает затраты на последующую обработку белка. Несколько соображений заслуживают дальнейшего изучения для внедрения очистки AWF в биореакторах на заводах. Во-первых, эффективная секреция требует слияния специфических N-концевых сигнальных пептидов. Во-вторых, для сохранения качества AWF неповрежденные листья должны быть быстро обработаны после сбора урожая без замораживания, что приводит к высвобождению внутриклеточного содержимого. В-третьих, PB эффективно экстрагирует белки AWF³⁴, но буферный pH и концентрация соли должны быть адаптированы к отдельным рекомбинантным белкам (рисунок 2C-D). В-четвертых, мы получили очищенный белок из 200 г N. benthamiana многократно в лабораторных условиях со стабильной чистотой и выходом. Для масштабирования для использования на заводе требуются более крупные емкости и вакуумные насосы, а также более эффективный метод очистки, а также могут потребоваться такие условия, как продолжительность вакуума, количество рекупераций и т. д.

Этот метод ограничен тем, что экзогенные белки секретируются в AWF, а белки внутри плазматической мембраны покидают (рисунок 2H-I). Это дает преимущество в получении более очищенных белков с правильной модификацией, но при более высокой стоимости выхода. Основным техническим узким местом для очистки на основе AWF является повышение целевого уровня белка внутри AWF. Сочетание с сильными промоторами и оптимизированными системами секреции улучшит платформы экспрессии растений для обеспечения высокой чистоты и увеличения урожайности. Чтобы преодолеть это узкое место, в будущей работе требуется более высокая система производства и более эффективная система секреции.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Эта работа поддерживается Ассоциацией содействия инновациям молодежи CAS (2021084) и Фондом поддержки ключевых проектов развертывания Трехлетнего плана действий Института микробиологии Китайской академии наук.