アポプラスト抽出法による植物産生組換えタンパク質の純度向上

植物系からの組換えタンパク質の精製は、通常、植物性タンパク質によって課題となります。この研究は、Nicotiana benthamianaのアポプラストから分泌された組換えタンパク質を効果的に抽出および精製する方法を提供します。

植物は、治療用タンパク質を産生するために研究されている新しく開発された真核生物の発現システムです。植物からの組換えタンパク質の精製は、生産プロセスにおける最も重要なステップの1つです。通常、タンパク質は全可溶性タンパク質(TSP)から精製され、その他の細胞内タンパク質とシトクロムの存在は、その後のタンパク質精製ステップに課題をもたらします。さらに、抗原や抗体などのほとんどの治療用タンパク質は、適切なグリコシル化を得るために分泌され、不完全に修飾されたタンパク質の存在は、抗原または抗体の構造の一貫性を失わせます。この研究では、植物のアポプラスト空間から高度に精製された組換えタンパク質を得るためのより効果的な方法を紹介します。組換え緑色蛍光タンパク質(GFP)は、 Nicotiana benthamiana のアポプラストに分泌されるように操作され、その後、浸潤遠心分離法を用いて抽出されます。抽出したアポプラストから得られたGFP-Hisは、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製されます。TSPの従来の方法とは対照的に、アポプラストからの精製では、高度に精製された組換えタンパク質が生成されます。これは、プラント生産システムの重要な技術改善を表しています。

今日では、抗体、ワクチン、生理活性タンパク質、酵素、および小さなポリペプチド1,2,3,4,5,6を含む、さまざまな植物産生組換え治療タンパク質が研究されています。植物は、その安全性、低コスト、および生産を迅速に拡大する能力により、治療用タンパク質を製造するためのますます利用されるプラットフォームになりつつあります^7,8。植物系におけるタンパク質の発現と修飾は、タンパク質の精製とともに、植物バイオリアクターの生産性を決定する重要な要素である^9,10。植物の生産性を向上させ、高純度の標的タンパク質を得ることは、植物ベースの生産システムが直面する主要な課題^です11,12。

組換えタンパク質の細胞内局在と修飾は、N末端にコードされる特定のシグナルペプチドに依存し、N末端は遺伝子発現中にタンパク質を最終オルガネラの目的地に標的とします。組換えタンパク質は、その固有の特性に基づいて、アポプラスト、小胞体(ER)、葉緑体、液胞、または細胞質に局在するように設計されています¹³。抗原および抗体については、分泌されたタンパク質が好ましい。分泌前に、タンパク質はERおよびゴルジ体を介して進行し、正しいフォールディングおよび翻訳後修飾^{を行います}14,15,16。

植物での生産後、組換えタンパク質は植物抽出物から精製する必要があります。典型的には、タンパク質は、豊富な細胞内タンパク質、誤って折り畳まれた未修飾の産物、およびシトクロムを含む全可溶性植物抽出物から精製される¹⁷。不純物を除去するために、植物抽出物は、リブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RuBisCO)特異的アフィニティークロマトグラフィー、フィチン酸沈殿、ポリエチレングリコール沈殿、温度と^pH18,19の調整など、広範な分画を受けます。このような不純物除去ステップは手間がかかり、タンパク質の品質を損なう可能性があります。

原形質膜を越えた植物細胞コンパートメントは、細胞壁、細胞間空間、および木部²⁰を包含するアポプラストとして定義されます。水相は一般にアポプラスト洗浄液(AWF)と呼ばれます。AWFは、細胞によって分泌される分子を含んでおり、輸送、細胞壁代謝、およびストレス応答^21,22のような多数の生物学的進行を調節する。TSPとは対照的に、AWFの分子成分はそれほど複雑ではありません。AWFから組換えタンパク質を抽出することで、細胞内タンパク質、誤って折り畳まれた製品、および細胞質の残骸による汚染を回避できる可能性があります。簡単に言えば、抽出脂質は負圧下で気孔を通じて葉に入り、AWFは穏やかな遠心分離によって収集されます²³。AWFの単離は、アポプラスト^24,25,26,27内の生物学的進歩を研究するために広く採用されていますが、植物ベースの生産システムでは利用されていません。

植物の生産性を向上させ、高純度の標的タンパク質を得ることは、植物生産システムにとって中心的な課題である²⁸。典型的には、タンパク質は、細胞内タンパク質、誤って折り畳まれた未修飾の産物、およびシトクロム²⁹を多く含む全可溶性植物抽出物から精製され、これらはその後の精製³⁰に多大なコストを必要とする。アポプラストに分泌される外因性組換えタンパク質の抽出にAWFタンパク質抽出法を使用すると、組換えタンパク質の均一性を効果的に改善し、タンパク質精製のコストを削減できます。ここでは、シグナルペプチドPR1aを用いてアポプラスト空間への外因性タンパク質の分泌を可能にするとともに、 N. benthamianaのAWFから組換えタンパク質を精製するための詳細な方法を紹介します。

1. N. benthamiana植物の調製

1. 苗ブロックをトレイに置き、1 Lの水を加え、完全に飽和するまで約2時間浸します。
2. 野生型の N.ベンタミアナ の種子を苗ブロックに均等に振りかけ、蓋をして1週間発芽させます。 N. benthamianaを 18時間の日長、24°C、相対湿度45%の温室で栽培し、2週間ごとに施肥します。
3. 種子が発芽したら、根に損傷を与えないように注意しながら、ピンセットを使用して苗をそっと取り除きます。新しいトレイの中央に小さな穴を掘り、その中に苗を置き、根を土で軽く覆います。蓋をして成長を続けます。
4. ふたをした状態で、苗に3枚の葉ができるまで育てます。4^枚目の 本葉が出てきたらフタを外します。
5. 植物が農業浸透する前に、さらに2週間成長を続けるのを待ちます。

2. 組換えGFP-Hisの構築

1. 遺伝子配列に基づく N. benthamiana コドンの最適化と GFP および PR1a の合成 (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) を行います。
2. Xba IおよびSac I酵素を使用して、pCAMBIA1300ベクターの二重消化を行います( 材料表を参照)。
3. アップストリームプライマー(TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT
   TGTTCTCTTTTC)およびダウンストリームプライマー(TCCTCG
   CCCTTGCTCACCATGTCGCCCCGGCACCCAAGA
   GTGGG)、アップストリームプライマーを用いたGFPの増幅(CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG
   CAAGGGCGAGGA)およびダウンストリームプライマー(GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG
   GTGAGATCTTCCGGACTTGT) です。
4. 相同組換えを用いて、PR1aおよびGFPをpCAMBIA1300植物発現ベクターにクローニングします。 大腸菌に移管した後、単一のクローンを選択し、シーケンシングのために会社に送ってください。シーケンシング結果と右プラスミドとの比較は、組換えプラスミドpCAMBIA1300-PR1a-GFP-His(p35s-PR1a-GFP-His)です。

3. N. benthamianaにおけるGFP-Hisの作製

1. 50μLの アグロバクテリウム 受容体細胞GV3101にGFPプラスミド1μLを加え、穏やかに混合して電極カップに加え、エレクトロショックャーで感電死した後に除去します。
2. 形質転換 したAgrobacterium tumefaciensを 、50 μg/mL のカナマイシン(Kan)と 50 μg/mL のリファンピシン(Rif)を入った LB 固体培地プレートに広げます。インキュベートし、28°Cで48時間逆転させます。pCAMBIA1300ベクターはカン耐性があり、アグロバクテリウムはリフ耐性です。正しい アグロバクテリウム だけがkanとrifのプレートで成長することができます。モノクローナルクローンは、 A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG) と名付けられた正の形質転換体でした。
3. 滅菌したつまようじを使用して適量のAtGPGを拾い上げ、KanとRifを液体LBの4mLに接種します。28°C、220-300rpmで24時間培養します。
4. 細菌を1:50で新鮮なLB(50 μg/mL Kan、10 mM 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)、20 μMアセトシリンゴン(AS))に継代培養し、28°C、220-300 rpmで10-12時間インキュベートします。
5. 1500 x g で 10 分間遠心分離して細菌を回収し、1 mL の MMA (10 mM MgCl₂、10 mM MES pH 5.6、100 μM AS) でペレットを再懸濁します。
6. MMAを使用して、AtGPGの光学密度(OD)をOD₆₀₀ = 0.8に測定および調整します。細菌を室温でさらに2〜4時間インキュベートします。無針注射器で細菌溶液を引き上げ、葉の裏側に軽く押し付け、溶液を葉に浸透させるように圧力をかけます。植物ごとに真ん中の3〜4枚の葉だけを注入します。
7. タンパク質抽出のために葉を収穫する前に、温室で N.benthamianaを 3〜4日間栽培し続けます。

4. GFPの細胞内局在の観察

1. 農業浸透の48時間後、平らな葉を選択し、6 mmの穴パンチを使用してパンチング用のブレードをクランプします。
2. スライドガラスに30%ショ糖溶液を滴下し、葉のサンプルを裏面を上にして置き、カバーガラスで覆います。
3. 励起波長を488nmに設定し、400倍に倍率した後、490-550nmで緑色蛍光を検出します。スライドの準備が整ったら最初の写真を撮り、10分後に別の写真を撮ります。

5. 植物からのGFPの抽出

1. AWF 抽出
   1. アグロインフィルトレーションの3日後に、組換えGFPを発現する無傷の新鮮な N.benthamiana の葉を採取します。葉を優しく扱い、葉の完全性を維持して、細胞内タンパク質の流出を防ぎます。タンパク質の分解を避けるために、収集した葉をすぐに次のステップに使用してください。
   2. 葉身を予冷滅菌したddH₂Oですすぎ、破片を取り除きます。
   3. 新鮮な葉を秤量し、20 gの葉(軸面を下にして)を100 mLの予冷済み100 mMリン酸緩衝液(PB 100 mM Na₂HPO₄ および100 mM NaH₂PO₄ を別々に構成し、200 mLの広口ビーカーで2.2:1 pH 7.0)で混合します。100メッシュのナイロン細メッシュ糸( 材料の表を参照)とプラスチックプレートで葉を覆います。
      注:予冷はタンパク質の分解を防ぎます。バッファ容量は、実験スケールに基づいて調整できます。すべての葉が浸されていることを確認してください。
   4. ビーカーを真空ポンプに入れます。0.8MPaの真空を1分間印加した後、すぐに大気圧に戻します。
   5. 緩衝液から葉を取り除き、吸収紙でやさしく吸い取ります。葉を巻き上げ、メッシュ糸で包み、50mLの遠心チューブに5gの葉を入れます。AWFを回収するには、チューブキャップでメッシュ糸を固定したチューブに、葉の先端を上にしてロールします。
   6. 4°C、500 x g で5分間遠心分離します。葉を取り除き、ピペットを使用してチューブの底にAWFを回収します。各チューブから約5mLのAWFを採取できます。
      注:細胞内タンパク質からの干渉を最小限に抑え、最大量のAWFタンパク質を抽出するために、抽出は2x〜3x繰り返すことができますが、3xを超えることはできません。
2. 全可溶性タンパク質抽出
   1. 20 gの葉を液体窒素中で微粉末に挽きます。抽出バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、10% グリセロール、1% Triton X-100、0.034% β-メルカプトエタノール( 材料表を参照))を 1:2 の比率で添加します。
   2. ホモジネートを縦型ミキサーで4°Cで30分間振とうします。 ホモジネートを13,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
   3. 上清を新しいチューブに移し、遠心分離を15分間繰り返します。透明にした上清を別のチューブに移します。.
   4. 0.22 μmフィルター( 材料の表を参照)で上清をろ過し、全可溶性タンパク質抽出物を得ます。

6. ニッケル(Ni)アフィニティークロマトグラフィーによるGFP-Hisの精製

注意: すべての手順を4°Cで実行します。

1. Niセファロースエクセル樹脂( 材料表を参照)を、ステップ5.1.6のタンパク質抽出物容量に対して1:1000の比率でチューブに添加します。樹脂の量は、タンパク質抽出物の体積の1/1000^に 等しい。
2. Ni樹脂を10倍の樹脂容量のddH₂OとPB(pH 7.0)で別々に3回洗浄し、上清を取り除きます。
3. タンパク質抽出物をNi樹脂と2時間インキュベートして、完全に結合させます。500 x g で5分間遠心分離し、上清中の未結合タンパク質を除去します。PBの20倍のレジンボリュームで3回洗浄します。500 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
4. 250 mM イミダゾール (50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、10% グリセロール、250 mM イミダゾール) の 10x 樹脂量を添加して GFP-His を溶出し、上清を回収します。

7. タンパク質のクマシーブルー染色

1. 10 μL の 5x SDS ローディングバッファーを 40 μL のタンパク質サンプルに加え、10 分間煮沸した後、15% SDS-PAGE で 110 V で 60 分間分析します。
2. タンパク質ゲルをクマシーブルー溶液(0.1%R-250、25%イソプロパノール、10%氷酢酸)で2時間染色します。
3. 溶液を注ぎ、脱色液で2時間洗浄します。ゲルを観察します。ゲル上のタンパク質は青色に着色されます。

8. タンパク質のウェスタンブロッティング

1. 10 μL の 5x SDS ローディングバッファーを 40 μL のタンパク質サンプルに加え、10 分間煮沸した後、15% SDS-PAGE で 110 V で 60 分間分析します。
2. タンパク質を280mAの0.45μmニトロセルロースメンブレンに移します。5%スキムミルクでメンブレンを1時間ブロックします。
3. 抗Hisタグ抗体を1:5000で希釈し、メンブレンを抗体と1時間インキュベートします。トリス緩衝生理食塩水とTween 20(TBST)を使用して、メンブレンを4回5分間洗浄します。
4. 抗マウス抗体を1:10000に希釈し、メンブレンを抗体と1時間インキュベートします。TBSTを使用して、メンブレンを4回5分間洗浄します。
5. 現像液( 材料の表を参照)を1:1の比率で混合します。メンブレンに400μLを加え、1分間反応させます。ビジュアライザーで1分間の露光後に写真を撮ります。

9. タンパク質濃度アッセイ

1. Bradford 1x 色素試薬 1 mL に 5 μL のタンパク質を添加し、5 分間反応させます。
2. ゼロ調整後のOD₅₉₅ 値を決定し、標準曲線からタンパク質濃度を計算します。

10. タンパク質の定量 ³¹

1. タンパク質サンプルのウェスタンブロッティングを標準試料と一緒に行います。
2. ImageJ 1.5.0グレースケール分析を使用して、標準に対する比率によるGFPの定量化を実行します。

GFP-Hisは、N. benthamianaのアポプラスト空間への分泌を標的としています
GFPは、分泌用のN末端PR1aシグナルペプチドと精製用のC末端Hisタグを備えたpCAMBIA1300プラスミドにクローニングされ、p35s-PR1a-GFP-Hisが生成されました (図1A)。この組換えタンパク質は 、N. benthamiana で一過性に発現し、アグロインフィルトレーションの3日後に抗His抗体を用いたウェスタンブロットにより30 kDaのバンドが検出されました (図1B)。プラズマ分解は、細胞壁を細胞膜³²から分離するために高張溶液を用いて葉を処理することである。GFPがアポプラストに存在するかどうかを判断するために、30%スクロースを使用して葉をプラズマ分解しました。蛍光顕微鏡法により、アポプラスト内のGFP-Hisの存在が示されました (図1C)。真空浸透遠心分離法で抽出したAWFタンパク質には、GFP-Hisも含まれていました (図1D)。これらの結果は、GFP-Hisが N. benthamiana の葉のAWFに分泌され、そこから抽出して下流の精製が可能であることを示しています。

AWFによるタンパク質精製
AWF抽出の有効性は、最終的なGFP収量に強く影響します。公表されている AWF 抽出プロトコル^{24、25、26、27} に基づいて、分泌された GFP-His の回収を最適化するためのさまざまな溶液をテストしました。ここでは、25 mM Tris-HCl(pH 7.4)、100 mM NaH₂PO₄(pH 4.5)、50 mM NaCl(pH 7.1)、40 mM KCl(pH 7.0)、20 mM CaCl₂(pH 5.7)、100 mM PB(pH 7.0)、10 mM MES(pH 5.6)、ddH₂O(pH 7.0)の8つの抽出溶液を検討しました。PBは、AWFとGFP-Hisの最大量を抽出し、他の溶液を4倍以上上回りました(図2A、B)。さまざまな pH で PB を比較すると、中性から軽度のアルカリ性条件 (pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0;図2C、D)。さらに、50 mM、100 mM、および 150 mM の濃度の PB で抽出効率を比較しました。その結果、100 mM PBは、AWFとGFP-Hisの両方の回復に最大の有効性を示したことが示されました(図2E、F)。

これらの最適化実験に基づき、N. benthamianaからの大規模なAWF抽出には、100 mM PB、pH 7.0を選択しました。このバッファーを使用して、新鮮な葉材料1グラムあたり495μgの総AWFタンパク質をアポプラストから回収しました(図2G)。抽出されたAWFには10μgのGFP-Hisが含まれていました(図2H)これは、TSP中のGFP-His全体の約18%に相当します(図2I)。Niアフィニティークロマトグラフィーの後、GFP-Hisの純度はAWF抽出から84.3%に達し、全可溶性タンパク質抽出によって達成された44.9%の純度よりも大幅に高くなりました(図2J)。

図1:GFP-Hisは、N. benthamianaのアポプラストへの分泌を標的としている(A)pCAMBIA1300植物発現ベクターにおけるPR1a-GFP-His構造の概略図。(B)N. benthamianaにおけるGFP-His産生を検出するウェスタンブロット。ここでは、10μLのタンパク質サンプルをロードして検出しました。N. benthamianaの葉にMMAを同時に注射したところ、ネガティブコントロールとして用いた。同量のサンプルを植物の大きなサブユニットを使用してローディングコントロール(C)GFP-His(緑)の細胞内局在を示す共焦点顕微鏡法として検査および染色しました。N. benthamianaの葉は、30%のスクロースでプラズマ化されました。白い破線は原形質膜を示します。赤い矢印は、アポプラスト中のGFP-Hisの蓄積を示しています。(D)抽出されたアポプラスト液中のGFP-Hisの存在を示すウェスタンブロット。ここでは、10μLのタンパク質サンプルをロードして検出しました。N. benthamianaの葉にMMAを同時に注射したところ、ネガティブコントロールとして用いた。 略語:35s = 2xカリフラワーモザイクウイルス35sプロモーター;PR1a = タバコ病因関連タンパク質1aシグナルペプチド;彼の = 彼のタグの 6 倍。Nos = ノパリン合成酵素ターミネーター。BS = プラズマ分解前;PS = プラズマ分解後。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:AWFからのタンパク質抽出法の最適化 (A-B) 異なるバッファーを使用したAWFからのタンパク質の抽出。AWF からのタンパク質抽出については、25 mM Tris-HCl (pH 7.4)、100 mM NaH₂PO₄ (pH 4.5)、50 mM NaCl (pH 7.0)、40 mM KCl (pH 7.0)、20 mM CaCl₂ (pH 5.7)、100 mM PB (pH 7.0)、10 mM MES (pH 5.6)、ddH₂O (pH 7.0) の 8 つの溶液を試験しました。抽出効率はSDS-PAGEで解析し(A)、GFP-Hisは抗His抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出しました(B)。(C-D)異なるpH値のPBを使用した抽出。pH 6.0、6.5、7.0、7.5、および 8.0 の PB を AWF からの抽出に使用しました。抽出効率はSDS-PAGEで検出し(C)、GFP-Hisは抗His抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出しました(D)。(E-F)異なる濃度のPBを使用した抽出。50 mM、100 mM、および 150 mM の PB を AWF からの抽出に使用しました。抽出効率はSDS-PAGEで解析し(E)、GFP-Hisは抗His抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出しました(F)。(G-H)抽出したタンパク質の定量分析。タンパク質は 100 mM PB(pH 7.0)を使用して抽出しました。総可溶性タンパク質(G)とGFP-His(H)を定量して統計解析しました。(I) 総GFPに対するAWF GFPの割合の統計分析。(J) N.ベンタミアナ またはAWFの全可溶性タンパク質からのGFP-Hisの精製。タンパク質は100 mM PB(pH 7.0)を用いて抽出し、GFP-HisはNiアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製はSDS-PAGEで分析しました。右端のレーンは 1 μg BSA 標準です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

植物を使用して治療用タンパク質を生産することは、近年急速に拡大しています1,2,3,4,5,6。タンパク質をコードする遺伝子は、発現ベクターにクローニングされ、アグロインフィルトレーションを介して植物組織に送達されます。植物細胞で生産されたタンパク質は、下流のアプリケーションのために精製されます。通常、組換えタンパク質はTSP抽出物から精製されます。しかし、抽出中に植物細胞から放出される豊富な植物タンパク質およびシトクロムは、精製を妨げる可能性がある³³。一方では、植物性シトクロムは分離カラムを詰まらせ、処理を遅らせる可能性があります¹⁷;一方、RuBisCOのような非常に豊富なタンパク質は除去が難しく、純度^{が低下します18,19}。これらの問題は、標的タンパク質が低レベルで発現している場合に問題になります。AWFから精製することで、これらの問題を回避し、より高い純度を実現することができます(図2J)。

AWF抽出は植物生物学24,25,26,27で広く使用されていますが、分子農業パイプラインで利用されることはほとんどありません。ここでは、植物製のGFPモデルを使用して、AWFベースのタンパク質精製を実証します。AWFからのGFPの抽出は、シグナルペプチドを添加してアポプラスト空間へのGFP分泌を可能にすることによって行った。この方法は、より均質なタンパク質を抽出し、下流のタンパク質処理コストを削減します。植物バイオリアクターにおけるAWF精製の実施については、いくつかの検討事項が検討に値します。まず、効率的な分泌には、特定のN末端シグナルペプチドの融合が必要です。第二に、AWFの品質を維持するためには、収穫後、無傷の葉を凍結せずに迅速に処理する必要があり、細胞内内容物が放出されます。第三に、PBはAWFタンパク質³⁴を効果的に抽出するが、緩衝液のpHおよび塩濃度は個々の組換えタンパク質に合わせて調整する必要がある(図2C-D)。第四に、200 gのベンタミアナ菌から、実験室条件で何度も精製されたタンパク質を安定した純度と収率で達成しました。工場内でのスケールアップには、容器や真空ポンプの大型化、より効果的な精製方法が求められており、真空時間や回収回数などの条件の最適化が必要になるかもしれません。

この方法は、外因性タンパク質がAWFに分泌され、原形質膜内のタンパク質が放棄されるという事実によって制限されます(図2H-I)。これは、正しい修飾で高精製タンパク質を得るという利点をもたらしますが、収率は高くなります。AWFベースの精製の主な技術的ボトルネックは、AWF内の標的タンパク質レベルの改善です。強力なプロモーターと最適化された分泌システムとの結合により、植物発現プラットフォームが改善され、高純度と高収率の両方が得られます。このボトルネックを克服するために、今後の仕事では、より高い生産システムとより効果的な分泌システムが求められます。

著者は、利益相反を宣言しません。

この作業は、Youth Innovation Promotion Association CAS(2021084)と、中国科学院微生物学研究所の3カ年行動計画の主要展開プロジェクト支援基金の支援を受けています。