طريقة قائمة على استخراج أبوبلاست لتحسين نقاء البروتين المؤتلف المنتج من النبات

عادة ما تواجه البروتينات النباتية تحديا في تنقية البروتينات المؤتلفة من الأنظمة النباتية. يوفر هذا العمل طريقة لاستخراج وتنقية البروتين المؤتلف المفرز بشكل فعال من أبوبلاست نيكوتيانا بينثاميانا.

النباتات هي نظام تعبير حقيقي النواة تم تطويره حديثا يتم استكشافه لإنتاج بروتينات علاجية. تعد تنقية البروتينات المؤتلفة من النباتات واحدة من أهم الخطوات في عملية الإنتاج. عادة ، تم تنقية البروتينات من البروتينات الكلية القابلة للذوبان (TSP) ، ويشكل وجود بروتينات متنوعة داخل الخلايا والسيتوكرومات تحديات لخطوات تنقية البروتين اللاحقة. علاوة على ذلك ، يتم إفراز معظم البروتينات العلاجية مثل المستضدات والأجسام المضادة للحصول على الجليكوزيل المناسب ، ويؤدي وجود البروتينات المعدلة بشكل غير كامل إلى عدم اتساق هياكل المستضد أو الأجسام المضادة. يقدم هذا العمل طريقة أكثر فعالية للحصول على بروتينات مؤتلفة عالية النقاء من الفضاء اللدائن للنبات. تم تصميم البروتين الفلوري الأخضر المؤتلف (GFP) ليتم إفرازه في منطقة نيكوتيانا بينثاميانا ثم يتم استخراجه باستخدام طريقة الطرد المركزي للتسلل. ثم يتم تنقية GFP-His من apoplast المستخرج بواسطة كروماتوغرافيا تقارب النيكل. على عكس الطرق التقليدية من TSP ، ينتج التنقية من apoplast بروتينات مؤتلفة عالية النقاء. وهذا يمثل تحسنا تكنولوجيا هاما لنظم الإنتاج النباتي.

في الوقت الحاضر ، هناك العديد من البروتينات العلاجية المؤتلفة المنتجة في النباتات قيد الدراسة ، بما في ذلك الأجسام المضادة واللقاحات والبروتينات النشطة بيولوجيا والإنزيمات والببتيدات الصغيرة^{1،2،3،4،5،6}. أصبحت النباتات منصة مستخدمة بشكل متزايد لإنتاج البروتينات العلاجية نظرا لسلامتها وتكلفتها المنخفضة وقدرتها على توسيع نطاق الإنتاج بسرعة ^7,8. يعد التعبير عن البروتين وتعديله في الأنظمة النباتية ، إلى جانب تنقية البروتين ، من العوامل الحاسمة التي تحدد إنتاجية المفاعلات الحيوية النباتية ^9,10. يعد تعزيز إنتاجية النبات والحصول على بروتينات مستهدفة عالية النقاء من التحديات الأساسية التي تواجه أنظمة الإنتاج النباتية^11,12.

يعتمد توطين البروتينات تحت الخلوية وتعديلها على ببتيد الإشارة المحدد المشفر في N-terminus ، والذي يستهدف البروتين إلى وجهته العضية النهائية أثناء التعبير الجيني. تم تصميم البروتينات المؤتلفة للتوطين في apoplast أو الشبكة الإندوبلازمية (ER) أو البلاستيدات الخضراء أو الفجوة أو السيتوبلازم ، بناء على خصائصها الفريدة¹³. بالنسبة للمستضدات والأجسام المضادة ، يفضل البروتينات المفرزة. قبل الإفراز ، تتقدم البروتينات من خلال ER و Golgi للطي الصحيح والتعديلات اللاحقة^{للترجمة 14،15،16}.

بعد الإنتاج في النباتات ، يجب تنقية البروتينات المؤتلفة من المستخلصات النباتية. عادة ، يتم تنقية البروتينات من المستخلصات النباتية الكلية القابلة للذوبان ، والتي تحتوي على بروتينات وفيرة داخل الخلايا ، ومنتجات غير مطوية وغير معدلة ، والسيتوكرومات¹⁷. لإزالة الشوائب ، تخضع المستخلصات النباتية لتجزئة واسعة النطاق ، بما في ذلك كروماتوغرافيا التقارب الخاصة بالريبولوز -1،5-ثنائي فوسفات الكربوكسيلاز / الأكسجين (RuBisCO) ، ترسيب الفيتات ، ترسيب البولي إيثيلين جلايكول ، وتعديل درجة الحرارة ودرجة الحموضة^18,19. خطوات إزالة الشوائب هذه شاقة ويمكن أن تضر بجودة البروتين.

تعرف الحجرة الخلوية للنبات الواقعة خارج الغشاء البلازمي بأنها البلاستيدات الأبوبلية، وتشمل الجدار الخلوي، والفراغات بين الخلوية، ونسيج^{الخشب 20}. يطلق على المرحلة المائية عادة اسم سائل غسيل apoplast (AWF). يحتوي AWF على جزيئات تفرزها الخلايا لتنظيم العديد من التطورات البيولوجية مثل النقل ، واستقلاب جدار الخلية ، واستجابات الإجهاد ^21,22. على عكس TSP ، فإن المكونات الجزيئية ل AWF أقل تعقيدا. قد يؤدي استخراج البروتينات المؤتلفة من AWF إلى تجنب التلوث بالبروتينات داخل الخلايا والمنتجات غير المطوية والبقايا السيتوبلازمية. باختصار ، تدخل دهون الاستخراج الأوراق عبر الثغور تحت ضغط سلبي ، ويتم جمع AWF عن طريق الطرد المركزي اللطيف²³. في حين يتم استخدام عزل AWF على نطاق واسع لدراسة التقدم البيولوجي داخل apoplast^{24،25،26،27} ، لم يتم استغلاله في أنظمة الإنتاج النباتية.

يعد تحسين إنتاجية النبات والحصول على بروتينات مستهدفة عالية النقاء من التحديات الرئيسية لأنظمة الإنتاج النباتي²⁸. عادة ، يتم تنقية البروتينات من إجمالي المستخلصات النباتية القابلة للذوبان التي تحتوي على كميات كبيرة من البروتينات داخل الخلايا ، والمنتجات غير المطوية وغير المعدلة ، والسيتوكرومات²⁹ ، والتي تتطلب تكاليف كبيرة للتنقية اللاحقة³⁰. يمكن أن يؤدي استخدام طرق استخراج البروتين AWF لاستخراج البروتينات الخارجية المؤتلفة التي تفرز في apoplast إلى تحسين تجانس البروتينات المؤتلفة بشكل فعال وتقليل تكلفة تنقية البروتين. هنا ، نستخدم إشارة الببتيد PR1a لتمكين إفراز البروتين الخارجي في فضاء apoplast وإدخال طريقة مفصلة لتنقية البروتين المؤتلف من AWF من N. benthamiana.

1. تحضير نباتات N. benthamiana

1. ضع كتل الشتلات في صينية ، أضف 1 لتر من الماء وانقعه لمدة 2 ساعة تقريبا حتى يتشبع تماما.
2. يرش بالتساوي بذور N. benthamiana من النوع البري على كتل الشتلات ، ويغطى بغطاء ، وينبت لمدة 1 أسبوع. تنمو N. benthamiana في دفيئة مع فترة ضوئية 18 ساعة ، 24 درجة مئوية ، 45 ٪ رطوبة نسبية ، وتخصيب كل أسبوعين.
3. بمجرد أن تنبت البذور ، استخدم الملقط لإزالة الشتلات برفق ، مع الحرص على عدم التسبب في تلف جذورها. احفر حفرة صغيرة في وسط صينية جديدة ، ضع الشتلات فيها ، وقم بتغطية الجذور برفق بالتربة. مع تغطية غطاء والاستمرار في النمو.
4. تنمو حتى الشتلات لديها ثلاث أوراق ، مع الغطاء. قم بإزالة الغطاء عندما تظهر^{الورقة الحقيقية 4} .
5. اسمح للنباتات بالاستمرار في النمو لمدة أسبوعين آخرين قبل التسلل الزراعي.

2. بناء GFP المؤتلف - HIS

1. إجراء تحسين كودون N. benthamiana وتوليف GFP و PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) بناء على تسلسل الجينات.
2. إجراء الهضم المزدوج لناقل pCAMBIA1300 باستخدام إنزيمات Xba I و Sac I (انظر جدول المواد).
3. إجراء تضخيم PR1a باستخدام الاشعال المنبع (TTGGAGAGAACACGGGACTCTAGAATGGGATT
   TGTTCTCTTTTC) والبادئات النهائية (TCCTCG
   CCCTTGCTCACCATGTCACCCCCCGGCACGGCAAGA
   GTGGG) ، تضخيم GFP باستخدام الاشعال المنبع (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGGGCATGGTGAGTGAGTGAG
   CAAGGGCGAGGA) والبادئات النهائية (GGGGAAATTCGAGCTCGTGGTGGTGGTGGTG
   GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
4. باستخدام إعادة التركيب المتماثل ، استنساخ PR1a ، و GFP في ناقل التعبير النباتي pCAMBIA1300. بعد النقل إلى الإشريكية القولونية ، حدد استنساخا فرديا وأرسلها إلى الشركة للتسلسل. مقارنة نتائج التسلسل والبلازميد الأيمن هو البلازميد المؤتلف pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His، المشار إليه باسم p35s-PR1a-GFP-His.

3. إنتاج هيئة أجيال السلام في شمال بنثاميانا

1. أضف 1 ميكرولتر من بلازميد GFP إلى 50 ميكرولتر من خلايا مستقبلات Agrobacterium GV3101 ، واخلطها برفق وأضفها إلى كوب القطب ، ثم أزلها بعد الصعق بالكهرباء على الصعق الكهربائي.
2. انتشار Agrobacterium tumefaciens المحولة على صفيحة متوسطة صلبة LB تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين (كان) و 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين (ريف). احتضان مقلوب عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ناقل pCAMBIA1300 مقاوم للكان ، و Agrobacterium مقاوم للريف. فقط Agrobacterium الصحيح يمكن أن تنمو على لوحات مع كان والريف. كانت المستنسخة وحيدة النسيلة هي المحولات الإيجابية ، المسماة A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).
3. استخدم عود أسنان معقم لالتقاط كمية مناسبة من AtGPG وتلقيحها في 4 مل من LB السائل مع Kan و Rif. الثقافة عند 28 درجة مئوية ، 220-300 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
4. بكتيريا الاستزراع الفرعي 1:50 إلى LB طازج (50 ميكروغرام / مل Kan ، 10 mM 2- (N-Morpholino) حمض إيثان سلفونيك (MES) ، 20 ميكرومتر أسيتوسيرينجون (AS)) وتحضن عند 28 درجة مئوية ، 220-300 دورة في الدقيقة لمدة 10-12 ساعة.
5. حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 10 دقائق وإعادة تعليق الحبيبات ب 1 مل من MMA (10 mM MgCl₂ ، 10 mM MES pH 5.6 ، 100 μM AS).
6. قياس وضبط الكثافة البصرية (OD) من AtGPG إلى OD₆₀₀ = 0.8 باستخدام MMA. احتضان البكتيريا لمدة 2-4 ساعات أخرى في درجة حرارة الغرفة. ارسم المحلول البكتيري باستخدام حقنة عديمة الإبر ، واضغط عليه على ظهر الأوراق برفق ، واضغط لاختراق المحلول في الأوراق. حقن فقط الأوراق الوسطى 3-4 لكل نبات.
7. استمر في زراعة N. benthamiana في الدفيئة لمدة 3-4 أيام قبل حصاد الأوراق لاستخراج البروتين.

4. مراقبة التوطين تحت الخلوي ل GFP

1. بعد 48 ساعة من التسلل الزراعي ، حدد ورقة مسطحة واستخدم ثقب 6 مم لربط الشفرة للتثقيب.
2. قم بتقطير محلول السكروز بنسبة 30٪ على شريحة زجاجية ، ضع عينة الورقة بحيث يكون الظهر متجها لأعلى وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي.
3. اضبط الطول الموجي للإثارة على 488 نانومتر واكتشف التألق الأخضر عند 490-550 نانومتر بعد تكبير 400x. التقط الصورة الأولى بمجرد إعداد الشريحة وصورة أخرى بعد 10 دقائق.

5. استخراج GFP من النبات

1. استخراج AWF
   1. اجمع أوراق N. benthamiana الطازجة السليمة التي تعبر عن GFP المؤتلف في 3 أيام بعد التسلل الزراعي. عالج الورقة برفق وحافظ على سلامة الأوراق لتجنب تدفق البروتين داخل الخلايا. استخدم الأوراق المجمعة للخطوة التالية على الفور لتجنب تدهور البروتين.
   2. اشطف شفرة الورقة ب ddH₂O المعقم المبرد مسبقا لإزالة الحطام.
   3. قم بوزن الأوراق الطازجة واغمر 20 جم من الأوراق (الجانب المحوري لأسفل) في 100 مل من محلول فوسفات 100 مللي متر المبرد مسبقا (PB 100 mM_{Na 2}HPO₄ و 100 mM NaH₂PO₄ تم تكوينهما وخلطهما بشكل منفصل بنسبة 2.2: 1 درجة حموضة 7.0) في دورق واسع الفم سعة 200 مل. قم بتغطية الأوراق بخيوط شبكية دقيقة من النايلون 100 شبكي (انظر جدول المواد) ولوحة بلاستيكية.
      ملاحظة: التبريد المسبق يمنع تدهور البروتين. يمكن تعديل أحجام التخزين المؤقت بناء على المقياس التجريبي. تأكد من غمر جميع الأوراق.
   4. ضع الكأس الزجاجية في مضخة تفريغ. تطبيق فراغ 0.8 ميجا باسكال لمدة 1 دقيقة ، ثم استعادة بسرعة إلى الضغط الجوي.
   5. قم بإزالة الأوراق من المخزن المؤقت وجففها برفق بورق ماص. نشمر الأوراق ونلفها بخيوط شبكية ونضع 5 جم من الأوراق في كل أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. لجمع AWF ، يترك الأوراق الملفوفة في الموضع جانبا لأعلى في أنابيب مع خيوط شبكية مثبتة بواسطة أغطية الأنابيب.
   6. أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 500 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الأوراق وجمع AWF في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام ماصة. يمكن الحصول على حوالي 5 مل من AWF من كل أنبوب.
      ملاحظة: من أجل تقليل التداخل من البروتينات داخل الخلايا واستخراج أكبر قدر ممكن من بروتينات AWF ، يمكن تكرار الاستخراج 2x-3x ، ولكن ليس أكثر من 3x.
2. استخراج البروتين الكلي القابل للذوبان
   1. طحن 20 غرام يترك في مسحوق ناعم في النيتروجين السائل. أضف محلول الاستخراج (50 mM Tris-HCl pH 7.4 ، 150 mM NaCl ، 10٪ جلسرين ، 1٪ Triton X-100 ، 0.034٪ β-mercaptoethanol (انظر جدول المواد)) بنسبة 1: 2.
   2. رج المزيج في خلاط عمودي لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجانس أجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   3. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وكرر الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة. نقل طافت تطهيرها إلى أنبوب آخر.
   4. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) للحصول على مستخلص البروتين الكلي القابل للذوبان.

6. تنقية GFP-His مع كروماتوغرافيا تقارب النيكل (Ni)

ملاحظة: نفذ جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية.

1. أضف راتنج Ni sepharose excel (انظر جدول المواد) إلى أنبوب بنسبة 1: 1000 بالنسبة إلى حجم مستخلص البروتين من الخطوة 5.1.6. حجم الراتنج يساوي 1/1000^عشر من حجم مستخلص البروتين.
2. اغسل راتنج النيكل 3x بحجم راتنج 10x من ddH₂O و PB (درجة الحموضة 7.0) بشكل منفصل بدوره وقم بإزالة المادة الطافية.
3. احتضان مستخلص البروتين مع راتنج النيكل لمدة 2 ساعة للسماح بالربط الكامل. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة البروتينات غير المنضمة في المادة الطافية. اغسل 3x بحجم راتنج 20x من PB. أجهزة الطرد المركزي في 500 × غرام لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
4. Elute GFP-His عن طريق إضافة 10x حجم الراتنج من 250 mM إيميدازول (50 mM Tris-HCl pH 7.4 ، 150 mM كلوريد الصوديوم ، 10٪ الجلسرين ، 250 mM إيميدازول) وجمع المادة الطافية.

7. تلطيخ كوماسي الأزرق للبروتينات

1. أضف 10 ميكرولتر من 5x SDS تحميل المخزن المؤقت إلى 40 ميكرولتر من عينات البروتين ، ثم غلي لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتشغيله على 15٪ SDS-PAGE عند 110 فولت لمدة 60 دقيقة.
2. جل بروتين البقع مع محلول Coomassie الأزرق (0.1٪ R-250 ، 25٪ أيزوبروبانول ، 10٪ حمض الخليك الجليدي) لمدة 2 ساعة.
3. اسكب المحلول واغسله بمحلول إزالة اللون لمدة 2 ساعة. مراقبة الجل. سيتم تلوين البروتينات الموجودة على الجل باللون الأزرق.

8. النشاف الغربي للبروتينات

1. أضف 10 ميكرولتر من 5x SDS تحميل المخزن المؤقت إلى 40 ميكرولتر من عينات البروتين ، ثم غلي لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتشغيله على 15٪ SDS-PAGE عند 110 فولت لمدة 60 دقيقة.
2. نقل البروتينات إلى غشاء نيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر عند 280 مللي أمبير. سد الغشاء مع 5 ٪ الحليب منزوع الدسم لمدة 1 ساعة.
3. تمييع الأجسام المضادة المضادة لعلامة His-tag في 1: 5000 واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة. استخدم محلول ملحي مخزن تريس وتوين 20 (TBST) لغسل الغشاء 4x لمدة 5 دقائق.
4. تمييع الأجسام المضادة للفأر في 1: 10000 واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة. استخدم TBST لغسل الغشاء 4x لمدة 5 دقائق.
5. امزج المطور (انظر جدول المواد) بنسبة 1: 1. أضف 400 ميكرولتر إلى الغشاء واتركه يتفاعل لمدة 1 دقيقة. التقط صورا بعد 1 دقيقة من التعرض باستخدام متخيل.

9. مقايسة تركيز البروتين

1. أضف 5 ميكرولتر من البروتين إلى 1 مل من كاشف صبغة برادفورد 1x وتفاعل لمدة 5 دقائق.
2. حدد قيمة OD₅₉₅ بعد التصفير واحسب تركيز البروتين من المنحنى القياسي.

10. تقدير كمية البروتين ³¹

1. أداء النشاف الغربي لعينات البروتين جنبا إلى جنب مع المعايير.
2. إجراء تقدير كمي ل GFP حسب النسبة إلى المعايير باستخدام تحليل التدرج الرمادي ImageJ 1.5.0.

يستهدف GFP-His للإفراز في الفضاء الأوسلجي ل N. benthamiana
تم استنساخ GFP في بلازميد pCAMBIA1300 مع ببتيد إشارة PR1a N-terminal للإفراز وعلامة His-terminal C للتنقية ، مما يولد p35s-PR1a-GFP-HIS (الشكل 1 أ). تم التعبير عن البروتين المؤتلف بشكل عابر في N. benthamiana وتم الكشف عن نطاق 30 كيلو دالتون بواسطة اللطخة الغربية باستخدام الجسم المضاد ل His في 3 أيام بعد التسلل الزراعي (الشكل 1 ب). انحلال البلازما هو علاج الأوراق باستخدام محلول مفرط التوتر لفصل جدار الخلية عن غشاء الخلية³². لتحديد ما إذا كان GFP موجودا في apoplast ، استخدمنا 30٪ سكروز لعمل تحلل البلازما للأوراق. أوضح الفحص المجهري الفلوري وجود GFP-His داخل apoplast (الشكل 1C). تحتوي بروتينات AWF المستخرجة عن طريق الطرد المركزي للتسلل الفراغي أيضا على GFP-HIS (الشكل 1 د). توضح هذه النتائج إفراز GFP-His في AWF لأوراق N. benthamiana ، والتي يمكن استخراجها منها لتنقية المصب.

تنقية البروتين من AWF
تؤثر فعالية استخراج AWF بشدة على العائد النهائي ل GFP. بناء على بروتوكولات استخراج AWF المنشورة^{24،25،26،27} ، اختبرنا حلولا مختلفة لتحسين استعادة GFP-His. هنا ، تم فحص ثمانية محاليل استخراج: 25 mM Tris-HCl (pH 7.4) ، 100 mM NaH₂PO₄ (pH 4.5) ، 50 mM NaCl (pH 7.1) ، 40 mM KCl (pH 7.0) ، 20 mM CaCl₂ (pH 5.7) ، 100 mM PB (pH 7.0) ، 10 mM MES (pH 5.6) و ddH₂O (pH 7.0). استخرج PB أكبر كمية من AWF و GFP-His ، متجاوزا الحلول الأخرى بأكثر من 4x (الشكل 2A ، B). كشفت مقارنة PB عند درجة حموضة متفاوتة عن تحسن AWF و GFP-His في ظروف محايدة إلى قلوية معتدلة (الرقم الهيدروجيني 6.0 و 6.5 و 7.0 و 7.5 و 8.0 ؛ الشكل 2 ج ، د). بالإضافة إلى ذلك ، تمت مقارنة PB بتركيزات 50 mM و 100 mM و 150 mM لفعالية الاستخراج. أشارت النتائج إلى أن 100 mM PB أظهرت أقصى فعالية لاستعادة كل من AWF و GFP-HIS (الشكل 2E ، F).

بناء على تجارب التحسين هذه ، تم اختيار 100 mM PB ، pH 7.0 ، لاستخراج AWF على نطاق واسع من N. benthamiana. باستخدام هذا المخزن المؤقت ، تم استرداد 495 ميكروغرام من إجمالي بروتينات AWF لكل جرام من مادة الأوراق الطازجة من apoplast (الشكل 2G). احتوى AWF المستخرج على 10 ميكروغرام من GFP-His (الشكل 2H) ، وهو ما يتوافق مع حوالي 18٪ من إجمالي GFP-His في TSP (الشكل 2I). بعد كروماتوغرافيا تقارب النيكل ، وصلت نقاء GFP-His إلى 84.3٪ من استخراج AWF ، وهي أعلى بكثير من نقاء 44.9٪ الذي تم تحقيقه من خلال استخراج البروتين الكلي القابل للذوبان (الشكل 2J).

الشكل 1: GFP-His مستهدف للإفراز في أبوبلاست N. benthamiana. (أ) رسم تخطيطي ل PR1a-GFP-بنائه في ناقل التعبير النباتي pCAMBIA1300. (ب) اللطخة الغربية التي تكشف عن GFP-His Production في N. benthamiana. هنا ، تم تحميل واكتشاف 10 ميكرولتر من عينات البروتين. تم استخدام أوراق N. benthamiana المحقونة في وقت واحد مع MMA كعنصر تحكم سلبي. تم فحص نفس الحجم من العينات وتلطيخها باستخدام وحدات فرعية كبيرة للنبات مثل الفحص المجهري متحد البؤر للتحكم في التحميل (C) الذي يوضح التوطين تحت الخلوي ل GFP-His (الأخضر). تم تحلل أوراق N. benthamiana مع 30 ٪ السكروز. تشير الخطوط البيضاء المتقطعة إلى غشاء البلازما. تشير الأسهم الحمراء إلى GFP-تراكمه في apoplast. (د) اللطخة الغربية التي توضح وجود GFP-His في السائل اللدائن المستخرج. هنا ، تم تحميل واكتشاف 10 ميكرولتر من عينات البروتين. تم استخدام أوراق N. benthamiana المحقونة في وقت واحد مع MMA كعنصر تحكم سلبي. الاختصارات: 35s = 2x فيروس فسيفساء القرنبيط 35s المروج ؛ PR1a = بروتين مرتبط بإمراض التبغ 1a إشارة الببتيد ؛ له = 6x علامته ؛ Nos = نوبالين سينسيز الفاصل. BS = قبل انحلال البلازما ؛ PS = بعد انحلال البلازما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحسين طريقة استخلاص البروتين من AWF. (أ-ب) استخلاص البروتينات من AWF باستخدام مخازن مختلفة. تم اختبار ثمانية محاليل لاستخراج البروتين من AWF: 25 mM Tris-HCl (pH 7.4) ، 100 mM NaH₂PO₄ (pH 4.5) ، 50 mM NaCl (pH 7.0) ، 40 mM KCl (pH 7.0) ، 20 mM CaCl₂ (pH 5.7) ، 100 mM PB (pH 7.0) ، 10 mM MES (pH 5.6) ، و ddH₂O (pH 7.0). تم تحليل كفاءة الاستخراج بواسطة SDS-PAGE (A) ، وتم الكشف عن GFP-His بواسطة النشاف الغربي باستخدام الجسم المضاد ل His (B). (ج-د) الاستخراج باستخدام PB عند قيم الأس الهيدروجيني المختلفة. تم استخدام PB مع الرقم الهيدروجيني 6.0 و 6.5 و 7.0 و 7.5 و 8.0 للاستخراج من AWF. تم الكشف عن كفاءة الاستخراج بواسطة SDS-PAGE (C) ، وتم الكشف عن GFP-His بواسطة النشاف الغربي بالجسم المضاد ل His (D). (إ-و) استخراج باستخدام PB بتركيزات مختلفة. تم استخدام PB عند 50 mM و 100 mM و 150 mM للاستخراج من AWF. تم تحليل كفاءة الاستخراج بواسطة SDS-PAGE (E) ، وتم الكشف عن GFP-His بواسطة النشاف الغربي بالجسم المضاد ل His (F). (ع-ح) التحليل الكمي للبروتينات المستخرجة. تم استخراج البروتينات باستخدام 100 mM PB (الرقم الهيدروجيني 7.0). تم قياس البروتين الكلي القابل للذوبان (G) و GFP-His (H) للتحليل الإحصائي. (ط) التحليل الإحصائي لنسبة الصندوق الأجيالي التقاعدي إلى مجموع هيئة أجيال السلام. (ي) تنقية GFP-HIS من البروتينات الكلية القابلة للذوبان من N. benthamiana أو AWF. تم استخراج البروتينات باستخدام 100 mM PB (pH 7.0) ، وتم تنقية GFP-His بواسطة كروماتوغرافيا تقارب Ni. تم تحليل التنقية بواسطة SDS-PAGE. الممر الموجود في أقصى اليمين هو معيار 1 ميكروغرام BSA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

توسع استخدام النباتات لإنتاج البروتينات العلاجية بسرعة في السنوات الأخيرة^{1،2،3،4،5،6}. يتم استنساخ الجينات المشفرة للبروتين في ناقلات التعبير وتسليمها إلى أنسجة النبات عن طريق الارتشاح الزراعي. بعد الإنتاج بواسطة الخلايا النباتية ، يتم تنقية البروتينات للتطبيقات النهائية. عادة ، يتم تنقية البروتينات المؤتلفة من مستخلصات TSP. ومع ذلك ، فإن البروتينات النباتية الوفيرة والسيتوكرومات المنبعثة من الخلايا النباتية أثناء الاستخراج يمكن أن تعيق التنقية³³. من ناحية ، يمكن للسيتوكرومات النباتية أن تسد أعمدة الفصل ، مما يؤدي إلى إبطاء المعالجة¹⁷ ؛ من ناحية أخرى ، يصعب إزالة البروتينات الوفيرة للغاية مثل RuBisCO ، مما يقلل من النقاء^18,19. تصبح هذه القضايا أكثر إشكالية عندما يتم التعبير عن البروتينات المستهدفة بمستويات منخفضة. يتجاوز التنقية من AWF هذه المشكلات ، مما يتيح نقاء أعلى (الشكل 2J).

بينما تم استخدام استخراج AWF على نطاق واسع في بيولوجيا النبات^{24،25،26،27} ، نادرا ما يتم استغلاله في خطوط أنابيب الزراعة الجزيئية. هنا ، نستخدم نموذج GFP نباتي الصنع لإثبات تنقية البروتين القائمة على AWF. تم إجراء استخراج GFP من AWF عن طريق إضافة ببتيد إشارة لتمكين إفراز GFP في مساحة apoplast. تستخرج هذه الطريقة البروتينات ذات التجانس العالي وتقلل من تكاليف معالجة البروتين النهائية. هناك عدة اعتبارات تستحق التحقيق في المستقبل لتنفيذ تنقية AWF في المفاعلات الحيوية النباتية. أولا ، يتطلب الإفراز الفعال اندماج ببتيدات إشارة N-terminal محددة. ثانيا ، للحفاظ على جودة AWF ، يجب معالجة الأوراق السليمة بسرعة بعد الحصاد دون تجميد ، مما يؤدي إلى إطلاق محتويات داخل الخلايا. ثالثا ، يستخرج PB بشكل فعال بروتينات AWF³⁴ ولكن يجب تصميم درجة الحموضة العازلة وتركيز الملح للبروتينات المؤتلفة الفردية (الشكل 2C-D). رابعا ، حققنا البروتين المنقى من 200 غرام من N. benthamiana عدة مرات في ظروف المختبر مع نقاء مستقر والعائد. ليتم توسيع نطاقها للاستخدام في المصنع ، يطلب من الأوعية الكبيرة ومضخات التفريغ وطريقة تنقية أكثر فعالية ، وقد تحتاج إلى تحسين ظروف مثل مدة الفراغ وعدد عمليات الاسترداد وما إلى ذلك.

هذه الطريقة محدودة بحقيقة أن البروتينات الخارجية تفرز في AWF ، والبروتينات داخل غشاء البلازما مهجورة (الشكل 2H-I). إنه يجلب فائدة الحصول على بروتينات نقية أعلى مع التعديل الصحيح ولكن بتكلفة أعلى من العائد. يتمثل عنق الزجاجة التقني الرئيسي للتنقية القائمة على AWF في تحسين مستوى البروتين المستهدف داخل AWF. سيؤدي الاقتران مع المروجين الأقوياء وأنظمة الإفراز المحسنة إلى تحسين منصات التعبير النباتي لتحقيق نقاء عال وإنتاجية أكبر. للتغلب على عنق الزجاجة هذا ، يطلب نظام إنتاج أعلى ونظام إفراز أكثر فعالية في العمل المستقبلي.

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

ويدعم هذا العمل رابطة تشجيع الابتكار للشباب CAS (2021084) وصندوق دعم مشروع النشر الرئيسي لخطة العمل الثلاثية لمعهد علم الأحياء الدقيقة ، الأكاديمية الصينية للعلوم.