Method Article
В данной рукописи представлен протокол хирургического удаления постганглионарных поясничных симпатических нейронов у мыши. Эта процедура будет способствовать проведению множества исследований, направленных на изучение роли симпатической иннервации в дистальных тканевых мишенях.
Повреждения периферических нервов встречаются часто, а полное функциональное восстановление после травмы достигается только у 10% пациентов. Симпатическая нервная система играет много важных ролей в поддержании гомеостаза организма, но она редко изучается в контексте повреждения периферических нервов. Степень постганглионарных симпатических нейронных функций в дистальных мишенях на периферии в настоящее время неясна. Чтобы лучше изучить роль симпатической иннервации периферических мишеней, хирургическая модель «нокаута» предлагает альтернативный подход. Хотя это может быть достигнуто химическим путем, химическая деструкция постганглионарных симпатических нейронов может быть неспецифической и дозозависимой. Использование хирургической поясничной симпатэктомии у мышей, которое когда-то считалось «практически непрактичным» у мелких животных, позволяет целенаправленно воздействовать на постганглионарные симпатические нейроны, которые иннервируют задние конечности. В данной рукописи описывается, как хирургическое удаление поясничных симпатических ганглиев L2-L5 у мыши в качестве операции по выживанию, которая надежно снижает потовую реакцию задней лапы и количество симпатических аксонов в седалищном нерве.
Повреждения периферических нервов (ПНИ) могут приводить к двигательному, сенсорному и симпатическому дефициту в дистальных тканевых мишенях, которые редко полностью функционально восстанавливаются1. Исследования PNI часто сосредоточены на моторной и сенсорной регенерации; Тем не менее, почти четверть седалищного нерва крысы состоит из немиелинизированных симпатическихаксонов2. Роль симпатической иннервации в периферических тканях, тем не менее, до конца не изучена3. Симпатическая нервная система играет важную роль в поддержании гомеостаза организма, участвуя в иммунной регуляции, терморегуляции, тонусе сосудов, митохондриальном биогенезе и т.д. 4,5,6,7,8,9,10,11. При утрате симпатической иннервации в нервно-мышечном соединении наблюдается стойкая мышечная слабость и синаптическая нестабильность, несмотря на поддержание иннервации мотонейрона12. Было показано, что эта симпатическая регуляция синаптической передачи в нервно-мышечном соединении снижается с возрастом13,14, что способствует саркопении, определяемой как возрастное снижение мышечной массы, силы и мощности15. Лучшее понимание роли симпатической иннервации периферических тканей необходимо для разработки методов лечения, которые оптимизируют функциональные результаты у пациентов с ПНИ и другими формами симпатической дисфункции.
Симпатэктомия является мощным экспериментальным инструментом, который позволит исследовать роль симпатической иннервации в дистальных тканях-мишенях. В частности, удаление симпатических ганглиев уровня L2-L5 удаляет большую часть симпатической иннервации нижних конечностей, что особенно полезно для исследователей, интересующихся седалищным нервом.
В этом протоколе подробно описывается удаление постганглионарных симпатических нейронов уровня L2-L5 у мыши в качестве операции по выживанию. Эта процедура требует от грызунов микрохирургических навыков и знакомства с анатомией мыши, и при эффективном выполнении не вызывает каких-либо видимых фенотипических различий. Хирургическая поясничная симпатэктомия использовалась в исследованиях на грызунах, в большей степени на крысах, чем на мышах 16,17,18,19,20,21; Однако подробного протокола, описывающего этот протокол, в настоящее время не существует. Предыдущие исследования с использованием поясничной симпатэктомии в первую очередь были сосредоточены на роли симпатической иннервации в болевой реакции, которая, как правило, ослабляется симпатэктомией в различных моделях повреждения нервов. В меньшем количестве исследований этот метод использовался на мышах22, вероятно, из-за меньшего размера анатомических ориентиров, поскольку использование хирургической симпатэктомии считалось «практически непрактичным» у мелких животных23,24. Локализованная симпатэктомия в форме микросимпатэктомии также использовалась в моделях грызунов, также в основном в контексте болевого поведения 25,26,27. Микросимпатэктомия, в отличие от тотальной поясничной симпатэктомии, использует дорсальный доступ, посредством которого сегмент серой ветви к определенному спинномозговому нерву отсоединяется и удаляется, что позволяет проводить очень целенаправленную симпатэктомию, которая позволит избежать более широких побочных эффектов.
Поскольку мышиные модели имеют решающее значение для многих исследований, требующих генетических манипуляций, эта процедура будет иметь универсальное применение и за пределами широты повреждений периферических нервов. Используя трансабдоминальный доступ, поясничные симпатические ганглии могут быть надежно визуализированы и удалены от мыши без видимых побочных эффектов. Несмотря на то, что существуют протоколы химического разрушения постганглионарных симпатических нейронов, такие как использование 6-гидроксидопамина (6-OHDA)23,24, эта хирургическая процедура позволяет анатомически специфично нацеливаться на постганглионарные поясничные симпатические ганглии. Использование хирургической симпатэктомии также позволяет избежать неспецифических и дозозависимых проблем, связанных с фармакологическими методами28,29.
Использование химических симпатэктомий путем введения 6-OHDA было описано в 1967 году как простой способ достижения избирательного разрушения адренергических нервных окончаний, поскольку хирургическая симпатэктомия у мелких животных не была предпочтительной. 6-OHDA представляет собой катехоламинергический нейротоксин, который эндогенно образуется у пациентов с болезнью Паркинсона, а его токсичность обусловлена его способностью образовывать свободные радикалы и ингибировать цепь переноса электронов в митохондриях30,31. Благодаря механизмам транспортировки норадреналина Uptake-1, 6-OHDA способен накапливаться в норадренергических нейронах, таких как постганглионарные симпатические нейроны28. В конце концов, нейрон разрушается 6-OHDA; Тем не менее, терминали в периферической нервной системе регенерируют с восстановлением функциональной активности даже тогда, когда уровень аминов все еще снижен. Различные пороговые дозы также присутствуют для разных органов в ответ на 6-OHDA, и было показано, что более высокие дозы 6-OHDA проявляют более неспецифические эффекты, распространяя его нейротоксические последствия на нейроны, не содержащие катехоламин, и даже на ненейрональные клетки. Помимо норадренергических нейронов, дофаминергические нейроны также поражаются 6-OHDA29, что делает химическую симпатэктомию в конечном итоге менее специфичной для постганглионарных симпатических нейронов, чем хирургическая симпатэктомия.
Таким образом, хирургическая поясничная симпатэктомия позволяет целенаправленно абляционировать симпатическую иннервацию нижних конечностей, что может быть сочетано с различными экспериментальными методами и генетическими манипуляциями на мышах для изучения того, как симпатическая нервная система способствует различным травмам и болезненным состояниям.
Все эксперименты были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Эмори (в соответствии с протоколом IACUC No PROTO201700371). В этом исследовании были использованы четыре взрослые самки мышей дикого типа C57BL/6J в возрасте 14 недель и весом от 16 до 21 г. Подробная информация об используемых здесь реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.
1. Предоперационная подготовка
2. Разрезы
3. Идентификация поясничных симпатических ганглиев L2-L5
4. Застежка на коже
5. Пилокарпиновый анализ на пот
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки истощения симпатической функциональной активности после поясничной симпатэктомии через 7 дней после поясничной симпатэктомии был проведен анализ пилокарпинового пота.
6. Иммуногистохимия
Примечание: Для оценки дегенерации симпатических аксонов в периферических нервах после поясничной симпатэктомии двусторонние седалищные нервы были собраны на 21-е сутки после операции.
Этот протокол описывает хирургическое удаление постганглионарных поясничных симпатических нейронов у мыши. Две мыши получили поясничную симпатэктомию, а две мыши служили контрольной группой. Для достижения успешной хирургической поясничной симпатэктомии должна быть достигнута адекватная визуализация, по крайней мере, L2 и L3 двусторонних поясничных симпатических ганглий, как показано на рисунке 1. Удаление ганглиев L4 и L5 приведет к полной симпатической денервации нижней части тела; Однако визуализация нижних ганглиев может быть затруднена мочеполовыми органами. Предыдущие исследования ретроградной трассировки показали, что большинство нейронов в ганглиях L2-L5 расположены в ганглиях L2 и L3. Несмотря на то, что для получения репрезентативных результатов использовались только самки мышей соответствующего возраста, эта хирургическая процедура была воспроизведена много раз как у самцов, так и у самок мышей, при этом не наблюдалось существенных анатомических различий с точки зрения расположения яичковой или яичниковой артерии и симпатических ганглий.
После удаления ганглиев реакция потливости в ответ на пилокарпин быстро снижается, со значительными различиями, наблюдаемыми к 7-му дню после операции (Рисунок 2). 7-й день после операции был выбран в связи с экспоненциальным снижением симпатически опосредованной потоотделения в течение 7 дней после различных повреждений седалищного нерва у34 крыс. Поскольку дегенерация аксонов может занять до 14 дней, а также из-за потенциальных трудностей с визуализацией ганглиев L4 и L5 во время операции (мочевой пузырь и половые органы могут препятствовать обзору), реакция на потливость может быть не полностью абляирована35,36.
Плотность тирозингидроксилаза-положительных (TH+) аксонов была значительно снижена к 21-му дню после операции без изменения плотности тяжелой цепи нейрофиламентов (NF-H) (рис. 3). Маловероятно, что TH+ аксоны будут полностью истощены из-за наличия сенсорных аксонов TH+, иннервирующих низкопороговые механорецепторы, и потенциальных трудностей с визуализацией полной поясничной симпатической цепи37.
Рисунок 1: Интраоперационный вид поясничных симпатических ганглий. (A) Схема с ожидаемыми ориентирами. (Б) Репрезентативное интраоперационное изображение с маркированными ориентирами. Поясничные симпатические ганглии расположены позади нисходящей брюшной аорты и нижней полой вены (отклоняются). Ганглии оттягиваются вправо мыши за счет отклонения брюшных сосудов и располагаются на правой поясничной мышце, проходя снизу и вверху. Двусторонние L2-ганглии могут быть визуализированы между левой почечной артерией и левой тестикулярной или яичниковой артерией, а L3-ганглии видны ниже левого яичка или яичниковой артерии. Масштабная линейка: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Хирургическая поясничная симпатэктомия уменьшает количество пятен потливости на задней лапе. (A) Схема расположения подушечек лап на подошвенной поверхности задней лапы мыши. (B) Репрезентативное изображение реакции на потливость через 8 минут после инъекции пилокарпина у интактного животного. (В') Увеличенное изображение с белыми стрелками, обозначающими выбранное количество пятен потоотделения. (C) Репрезентативное изображение реакции на потливость через 8 минут после инъекции пилокарпина у симпатэктомированного животного на 7-й день после операции. (С') Увеличенное изображение с белыми стрелками, обозначающими выбранное количество пятен потоотделения. (D) Общее количество пятен потливости на всех шести подушечках задней лапы у неповрежденных и симпатэктомированных мышей. Данные отображаются линией, представляющей медиану. Тест Манна-Уитни. *p < 0.05. Масштабные линейки: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Хирургическая поясничная симпатэктомия (Sympx) уменьшает количество симпатических аксонов в седалищном нерве. (A) Тирозингидроксилаза (TH)-положительные аксоны на мкм седалищного нерва (ширина нерва) на 21-й день после операции. Репрезентативные участки нерва окрашивания ТГ у интактной (В) и симпатэктомированной (В') мыши. (C) Нейрофиламент-тяжелая цепь (NF-H)-положительные аксоны на мкм седалищного нерва. Репрезентативный нервный срез окрашивания NF-H у интактной (D) и симпатэктомированной (D') мыши. Пурпурные пунктирные линии представляют собой возможные случайно расположенные вертикальные линии, которые охватывают ширину участка нерва, используемого для вычисления плотности аксонов в нерве. Пурпурные стрелки указывают на выбранное количество аксонов, которые пересекают случайно расположенные вертикальные линии. Данные отображаются в виде среднего ± SEM. Непарный t-критерий. **p < 0,01. Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Поясничные симпатические ганглии – это очень мелкие структуры, расположенные позади многих критически важных органов брюшной полости и крупных сосудов. Поэтому данная процедура требует значительной точности и аккуратности. Большая часть трудностей заключается в интраоперационной идентификации симпатических ганглий. Предлагается, чтобы обучаемый сначала смог идентифицировать ганглии в трупе мыши, прежде чем пытаться выполнить эту процедуру на живой мыши. Устранение неполадок часто необходимо при выявлении симпатических ганглиев после отведения кишечника. Чтобы обеспечить адекватную визуализацию, нисходящая ободочная кишка должна быть видна. Кишечный отвод за пределы брюшной полости должен включать слепую кишку. Кроме того, мочевой пузырь может быть полным и увеличенным, что может препятствовать обзору нисходящей ободочной кишки и, впоследствии, нисходящей брюшной аорты и нижней полой вены. В идеале мочевой пузырь сцеживается вручную, как только мышь находится под наркозом, прежде чем делать первоначальный разрез кожи. Однако, если мочевой пузырь не сцеживается и интраоперационный обзор заблокирован, возможно мягкое сцеживание с помощью 2 стерильных аппликаторов с ватным наконечником. Следите за тем, чтобы не повредить мочеточники, которые прикрепляются к задней части мочевого пузыря. После того, как брюшная аорта и нижняя полая вена идентифицированы позади нисходящей ободочной кишки, адекватное отклонение и стабилизация сосудов имеют решающее значение для визуализации симпатических ганглий. Фасция относительно жесткая, и если шов накладывается исключительно через слой фасций и нейронных соединений, а не через стенки сосудов, сосуды должны быть оттянуты не менее чем на 1 мм от средней линии. Фасцию, расположенную над симпатическими ганглиями, можно аккуратно рассечь с помощью пинцета. Если во время процедуры лопнет небольшой сосуд, надавите стерильным аппликатором с ватным наконечником не менее чем на 10 с, чтобы обеспечить достаточный гемостаз перед закрытием. Если во время операции были проколоты крупные сосуды брюшной полости, мышь следует быстро усыпить.
Несмотря на то, что этот метод позволяет осуществлять прямую визуализацию и удаление симпатических ганглий, тем самым обеспечивая более специфическое нацеливание на эти постганглионарные симпатические нейроны по сравнению с химическими симпатэктомиями23, существуют некоторые ограничения. Результатом этой операции является удаление поясничных симпатических ганглиев L2-L5; однако из-за обструкции зрения, вызванной жизненно важными мочеполовыми органами, нижние ганглии, такие как ганглии уровня L4-L5, труднее визуализировать и удалить во время этой процедуры. Большинство нейронов, иннервирующих нижние конечности, расположены в больших L2-ганглиях. Ганглии L5 чрезвычайно малы и содержат меньше нейронов, как видно в предыдущих экспериментах по флуоресцентной ретроградной трассировке38; Тем не менее, неспособность удалить эти нейроны может исказить анализ результатов из наиболее дистальных структур, таких как стопы. Чтобы обеспечить лучшие результаты при изучении дистальных мишеней в стопах, было бы целесообразно проверить извлеченную ткань для подсчета количества удаленных ганглий. Это можно сделать с помощью флуоресцентной мыши-репортера, у которой можно легко визуализировать постганглионарные симпатические нейроны, или с помощью флуоресцентного ретроградного индикатора, введенного в дистальную мишень перед операцией. Некоторые флуоресцентные репортерные мыши для этой цели включают ThCre:mTmG (см. Таблицу материалов), которая имеет крайне разреженную маркировку тирозингидроксилаза-положительных нейронов39, Phox2bCre:tdTomato (см. Таблицу материалов), которая имеет умеренную маркировку постганглионарных симпатических нейронов40,41, и ThCre:tdTomato (см. Таблицу материалов), который имеет обширную маркировку постганглионарных симпатических нейронов42. Это далеко не полный список доступных линий.
Кроме того, из-за большого разреза, необходимого для этой хирургической процедуры, мышам может потребоваться более длительный период восстановления, прежде чем можно будет проводить дальнейшие эксперименты. Мыши должны находиться под наблюдением не менее 3 дней для правильной дефекации, мочеиспускания и кормления. Кроме того, неправильный гемостаз может привести к неустраненному внутрибрюшному кровотечению, что может привести к летальному исходу у мышей в неожиданные моменты времени. Таким образом, обеспечение гемостаза до хирургического закрытия имеет решающее значение для успеха будущих экспериментов. Симпатические нейроны также могут быть подвергнуты химическому воздействию, как указанов пункте 24.
Использование хирургических симпатэктомий позволит провести множество исследований, направленных на изучение роли постганглионарной симпатической иннервации в дистальных мишенях, таких как роль симпатической иннервации в нервно-мышечном соединении12. Кроме того, методы флуоресцентной ретроградной трассировки могут быть использованы для количественной оценки симпатической реиннервации дистальных тканей, поскольку этот протокол может быть адаптирован для извлечения ганглиев en bloc у мышей с фиксированным параформальдегидом38. В контексте повреждений периферических нервов эта хирургическая модель «нокаута» позволит лучше охарактеризовать ожидаемое симпатическое функциональное восстановление в ранее иннервированных тканях.
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта NIH под номером K01NS124912 и частично грантом на развитие от финансируемого NIH Специализированного центра передового опыта исследований в области половых различий U54AG062334 и Программой подготовки ученых-медиков Медицинской школы Университета Эмори. Благодарим Дэвида Кима, постбакалавра, за рассечение седалищных нервов и ХаоМин СиМа, специалиста по исследованиям, за 3D-печать крепления для телефона для нашего стереомикроскопа, которое позволило снять видео.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
5-0 absorable suture | CP Medical | 421A | |
5-0 nylon suture | Med-Vet International | MV-661 | |
70% ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-4L | |
Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific VetFlo | VetFlo-0530XS | |
Anesthesia Vaporizer | Kent Scientific VetFlo | 13-005-202 | |
Betadine | HealthyPets | BET16OZ | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | #000664 | |
Chicken anti-neurofilament-heavy | Abcam | ab72996 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Data Analysis Software | Prism | ||
Fine-tipped tweezers | World Precision Instruments | 500233 | |
Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | |
Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A32931 | |
Goat anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21245 | |
Heating pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Image Analysis Software | Fiji | ||
Imaging Software | Nikon | NIS-Elements | |
Isoflurane | Med-Vet International | RXISO-250 | |
Meloxicam | Med-Vet International | RXMELOXIDYL32 | |
Needle driver | Roboz Surgical Store | RS-7894 | |
Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
Ophthalmic ointment | Refresh | Refresh P.M. | |
Phox2bCre:tdTomato mutant mice | Jackson Laboratory | #016223, #007914 | |
Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Abcam | ab112 | |
Small straight scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | |
Sterile cotton swabs 2x2 | Dynarex | 3252 | |
Sterile cotton tipped applicators | Dynarex | 4301 | |
Sterile drape | Med-Vet International | DR4042 | |
Sterile saline solution | Med-Vet International | 1070988-BX | |
ThCre:mTmG mutant mice | Mutant Mouse Resource and Research Centers | strain #017262-UCD | Jackson Laboratory, strain #007576 |
ThCre:tdTomato mutant mice | European Mouse Mutant Archive | strain #00254 | Jackson Laboratory, strain #007914 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены