כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים

כתב יד זה מציג פרוטוקול להסרה כירורגית של תאי עצב סימפתטיים מותניים פוסט-גנגליונים מעכבר. הליך זה יאפשר מספר רב של מחקרים שמטרתם לחקור את התפקיד של עצבוב סימפתטי במטרות רקמות דיסטליות.

פגיעות עצביות היקפיות הן נפוצות, והתאוששות תפקודית מלאה לאחר פציעה מושגת רק ב-10% מהמטופלים. מערכת העצבים הסימפתטית ממלאת תפקידים קריטיים רבים בשמירה על הומאוסטזיס גופני, אך רק לעתים רחוקות היא נחקרה בהקשר של פגיעה עצבית היקפית. היקף התפקודים העצביים הסימפתטיים הפוסט-גנגליונים במטרות דיסטליות בפריפריה אינו ברור כרגע. כדי לחקור טוב יותר את התפקיד של עצבוב סימפתטי של מטרות היקפיות, מודל "נוק-אאוט" כירורגי מספק גישה חלופית. למרות שניתן להשיג זאת מבחינה כימית, הרס כימי של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים יכול להיות לא ספציפי ותלוי מינון. השימוש בכריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים, שבעבר נחשבה ל"כמעט בלתי מעשית" בבעלי חיים קטנים, מאפשר מיקוד ספציפי של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים המעצבבים את הגפיים האחוריות. כתב יד זה מתאר כיצד להסיר בניתוח את הגרעינים הסימפתטיים המותניים L2-L5 מעכבר כניתוח הישרדות, אשר מפחית באופן אמין את תגובת הזיעה של הכף האחורית ואת מספר האקסונים הסימפתטיים בעצב הסיאטי.

פגיעות עצביות היקפיות (PNIs) יכולות להוביל לליקויים מוטוריים, תחושתיים וסימפתטיים במטרות רקמה דיסטלית שרק לעתים רחוקות מתאוששים באופן מלא¹. מחקרי PNI התמקדו לעתים קרובות בהתחדשות המוטורית והחושית; עם זאת, כמעט רבע מהעצב הסיאטי של החולדה מורכב מאקסונים סימפתטיים לא מיאלינטים². התפקיד של עצבוב סימפתטי ברקמות ההיקפיות, עם זאת, אינו מובן במלואו³. מערכת העצבים הסימפתטית ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס גופני, משתתפת בוויסות חיסוני, ויסות תרמי, טונוס כלי דם, ביוגנזה מיטוכונדריאלית ועוד 4,5,6,7,8,9,10,11 . כאשר עצבוב סימפתטי בצומת הנוירומוסקולרי הולך לאיבוד, חולשת שרירים מתמשכת וחוסר יציבות סינפטית נצפים למרות שמירה על עצבוב מוטונורון¹². ויסות סימפתטי זה של העברה סינפטית בצומת העצבית-שרירית הוכח כיורד עם הזדקנות^13,14, מה שתורם לסרקופניה, המוגדרת כירידה תלוית גיל במסת שריר, כוח וכוח¹⁵. הבנה טובה יותר של תפקיד העצבוב הסימפתטי של רקמות היקפיות נחוצה לפיתוח טיפולים שימטבו את התוצאות התפקודיות עבור חולים עם PNIs וצורות אחרות של תפקוד לקוי סימפתטי.

כריתת סימפתטיה היא כלי ניסיוני רב עוצמה שיאפשר לחקור את תפקיד העצבוב הסימפתטי ברקמות המטרה הדיסטליות. באופן ספציפי, הסרת הגרעינים הסימפתטיים ברמת L2-L5 מסירה את רוב העצבוב הסימפתטי לגפיים התחתונות, דבר שימושי במיוחד עבור חוקרים המעוניינים בעצב הסיאטי.

פרוטוקול זה מפרט את הסרת תאי העצב הסימפתטיים הפוסט-גנגליונים ברמת L2-L5 מעכבר כניתוח הישרדות. הליך זה דורש מיומנויות מיקרוכירורגיות של מכרסמים והיכרות עם אנטומיה של עכבר, וכאשר הוא מבוצע ביעילות, אינו גורם להבדלים פנוטיפיים נראים לעין. כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית שימשה במחקר מכרסמים, יותר בחולדות מאשר בעכברים 16,17,18,19,20,21; עם זאת, פרוטוקול מפורט המתאר את הפרוטוקול אינו קיים כיום. מחקרים קודמים שהשתמשו בסימפטקטומיה המותנית התמקדו בעיקר בתפקיד של עצבוב סימפתטי בתגובת הכאב, אשר בדרך כלל מוחלשת על ידי סימפטקטומיה במודלים שונים של פגיעה עצבית. פחות מחקרים השתמשו בטכניקה זו בעכברים²², ככל הנראה בשל גודלם הקטן יותר של ציוני דרך אנטומיים, שכן השימוש בסימפטקטומיה כירורגית נחשב "כמעט לא מעשי" בבעלי חיים קטנים^23,24. סימפטקטומיות מקומיות בצורה של microsympathectomies שימשו גם במודלים של מכרסמים, גם בעיקר בהקשר של התנהגויות כאב 25,26,27. המיקרוסימפטקטומיה, בניגוד לכריתת הסימפטקטומיה המותנית הכוללת, משתמשת בגישה גבית שבאמצעותה מנתק ומוסר קטע מהרמוס האפור לעצב עמוד שדרה ספציפי, מה שמאפשר כריתת סימפתקטומיה ממוקדת מאוד שתמנע תופעות לוואי רחבות יותר.

מכיוון שמודלים של עכברים הם קריטיים עבור מחקרים רבים הדורשים מניפולציה גנטית, להליך זה יהיו יישומים מגוונים מעבר לרוחב של פגיעות עצביות היקפיות גם כן. באמצעות גישה טרנס-בטנית, ניתן להמחיש באופן אמין את הגרעינים הסימפתטיים המותניים ולכרות אותם מהעכבר ללא תופעות לוואי נראות לעין. למרות שקיימים פרוטוקולים להשמדה כימית של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים, כגון שימוש ב-6-הידרוקסידופמין (6-OHDA)^23,24, הליך כירורגי זה מאפשר מיקוד אנטומי ספציפי של הגרעינים הסימפתטיים המותניים הפוסט-גנגליונים. השימוש בסימפטקטומיה כירורגית גם מונע את החששות הלא ספציפיים ותלויי המינון הקשורים לשיטות פרמקולוגיות^28,29.

השימוש בסימפטקטומיות כימיות באמצעות מתן 6-OHDA תואר בשנת 1967 כדרך פשוטה להשיג הרס סלקטיבי של קצות עצבים אדרנרגיים, שכן ניתוחים בבעלי חיים קטנים לא היו מועדפים^23,24. 6-OHDA הוא רעלן עצבי קטכולמינרגי שנוצר אנדוגנית בחולי פרקינסון, ורעילותו נגזרת מיכולתו ליצור רדיקלים חופשיים ולעכב את שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה^30,31. באמצעות מנגנוני הובלה של ספיגת נוראדרנלין-1, 6-OHDA מסוגל להצטבר בתוך נוירונים נוראדרנרגיים, כגון נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים²⁸. בסופו של דבר, תא העצב נהרס על ידי 6-OHDA; עם זאת, טרמינלים במערכת העצבים ההיקפית אכן מתחדשים, עם שיקום הפעילות התפקודית גם כאשר רמות האמין עדיין מופחתות. ספי מינון שונים קיימים גם עבור איברים שונים בתגובה ל-6-OHDA, ומינונים גבוהים יותר של 6-OHDA הוכחו כבעלי השפעות לא ספציפיות יותר, המרחיבים את השלכותיו הנוירוטוקסיות לנוירונים שאינם מכילים קטכולאמין ואפילו לתאים שאינם נוירונים. מלבד נוירונים נוראדרנרגיים, נוירונים דופמינרגיים מושפעים גם מ-6-OHDA²⁹, מה שהופך את הסימפטקטומיה הכימית בסופו של דבר לפחות ספציפית לנוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים מאשר הסימפטקטומיה הכירורגית.

לכן, כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית מאפשרת אבלציה ממוקדת של העצבוב הסימפתטי לגפיים התחתונות, אותה ניתן לשלב עם מגוון טכניקות ניסיוניות ומניפולציות גנטיות בעכבר כדי לחקור כיצד מערכת העצבים הסימפתטית תורמת למצבי פציעה ומחלה שונים.

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אמורי (תחת פרוטוקול IACUC מספר PROTO201700371). במחקר זה נעשה שימוש בארבע נקבות עכברי בר בוגרות מסוג C57BL/6J, בנות 14 שבועות ובמשקל שבין 16-21 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים כאן מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה טרום ניתוחית

1. Autoclave כלי הניתוח: 1 זוג מספריים חדים, 2 פינצטה עדינה, 1 נהג מחט.
2. חממו כרית חימום ל-37°C והניחו אותה מתחת למשטח הניתוח.
3. רססו את אזור הניתוח, כולל תא ההרדמה, בחומר חיטוי ונגבו אותו היטב במגבות נייר.
4. הקפידו על חלוק תקין ושטיפת ידיים לפני הטיפול בעכבר.
5. להאכיל את העכבר עם meloxicam ב 5 מ"ג / ק"ג משקל הגוף, ולאפשר הרבה זמן עבור העכבר לבלוע לחלוטין את התרופה כדי למנוע שאיפה במהלך הזירוז.
6. יש להשרות את העכבר בהרדמה עם איזופלורן 3% בליטר חמצן אחד לדקה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות).
7. לאחר שהעכבר מורדם (אין תגובה לצביטה בבוהן), הניחו את העכבר על שולחן הניתוח, עם עמוד השדרה, עם אפו בחרוט אף מותאם.
8. לאחר שהעכבר מותאם כראוי לקונוס האף, התאם את האיזופלורן ל -2% לשמירה על הרדמה.
9. יש להניח ג'ל עיניים על עיני העכבר כדי למנוע keratoconjunctivitis sicca (עין יבשה).
10. ודא שהעכבר מאובטח כראוי באמצעות סרט כירורגי לשולחן הניתוח.
11. יש לעקוב ברציפות אחר נוחות הנשימה וקצב נשימה נאות.
12. לגלח את הפרווה מבטן העכבר מגובה איברי המין אל מתחת לצלעות.
13. לאחר הסרת הפרווה, יש לנגב תחילה את אזור הניתוח בתנועה מעגלית, ממרכז לפריפריה, עם 70% אתנול. לאחר מכן, נגבו את אזור הניתוח עם בטאדין באותה תנועה מעגלית. חזור על שני השלבים אתנול ובטאדין בסך הכל 3 פעמים.
14. עטפו את העכבר עם וילון כירורגי סטרילי עם חור בגודל מתאים שנחתך מהאמצע כדי לדמיין את שדה הניתוח. ניתן ליצור את צורת הרומבואיד על ידי קיפול הווילון לשניים וחיתוך משולש איזוצלס בגובה של ~10 מ"מ ובסיס של ~15 מ"מ.

2. חתכים

1. בעזרת זוג מספריים חדים ופינצטה עדינה, יוצרים חתך בקו האמצע מ~1 מ"מ מעל רמת סימפיזיס הערווה ל~2 מ"מ מתחת לצלעות.
2. זהה את הפאשיה האמצעית (linea alba) בין שרירי הבטן הדו-צדדיים. בעזרת הפינצטה, הרימו את שרירי הבטן הרחק מהאיברים שמתחתיהם וחתכו לאורך הלינאה אלבה כדי להיכנס לחלל הבטן.
   הערה: ניתן לזהות את linea alba על ידי משיכה עדינה של שרירי הבטן הדו-צדדיים של הרקטוס לרוחב כדי לחשוף קו פאשיה דק יותר שנמצא לאורך קו האמצע³². ביצוע החתך דרך linea alba מאפשר את השריר להיסגר בקלות רבה יותר.
3. משוך את שרירי הבטן והעור עם 5-0 תפרים לרוחב כדי לדמיין את השלבים הבאים כראוי.

3. זיהוי הגרעינים הסימפתטיים המותניים L2-L5

1. הגרעינים הסימפתטיים המותניים נמצאים אחוריים לאבי העורקים הבטני ולווריד הנבוב התחתון. כדי לדמיין את אבי העורקים, להסיר חלקית את המעיים מחלל הבטן.
   הערה: הגרעינים הסימפתטיים ברמת L2-L5 חוצים מרמת הביפורקציה של אבי העורקים לכלי הדם האיליאק לרמה של עורק הכליה השמאלי^21,33.
   1. הניחו ריבוע כותנה סטרילי רווי במי מלח סטריליים על החתך, מונח עליון ומשמאל לחתך. בזהירות, עם 2 אפליקטורים סטריליים עם קצוות כותנה, דוחפים את המעי הגס והמעי הדק באופן חלקי החוצה אל ריבוע הכותנה הספוג במי מלח.
      הערה: ודא כי הצקום והתוספתן נמצאים מחוץ לחלל הבטן וכי ניתן לדמיין את המעי הגס היורד.
   2. מכסים את המעיים החשופים בריבוע כותנה רווי מלח נוסף.
   3. מעת לעת לפקח פריסטלטיקה לאורך כל הניתוח, אשר ניתן לזהות על ידי תנועה קצבית של המעיים.
2. זהה את המעי הגס היורד, שהוא החלק של המעי שנע לכיוון פי הטבעת ופי הטבעת ועשוי להכיל חומר צואתי גלוי, ולהסיט מבנה זה שמאלה עם פינצטה סגורה כדי לחשוף את אבי העורקים הבטני ואת נבוב הווריד הנחות. שני כלי דם אלה קשורים ברקמת חיבור וצריכים לנוע כיחידה אחת.
   1. בעזרת זוג פינצטה, הרימו את כלי הדם הבטניים על ידי רקמת החיבור הסובבת אותם. בזמן שזה מורם, מניחים בזהירות תפר ניילון 5-0 דרך רקמת החיבור.
      אזהרה: אין לנקב את כלי הבטן עם המחט: זה יוביל לפירוק מהיר של העכבר ולמוות סביר.
   2. לאחר החדרת התפר דרך רקמת החיבור, הסיטו את כלי הדם הבטניים שמאלה. זה ייתן חלון משולש, המאפשר הדמיה ישירה של שרירי הפסואס הדו-צדדיים.
      הערה: בשל הקשרים האינטימיים שיש לגרעינים עם כלי הבטן, הגרעינים הסימפתטיים, למרות שהם ממוקמים בדרך כלל בקו האמצע, יוסטו מעט שמאלה (ימין העכבר) יחד עם כלי הדם. לאחר הסטת כלי הבטן, יש לדמיין משולש, כאשר שני הצדדים משמאל מורכבים מכלי הבטן המוסטים והצד הימני מוגדר על ידי קו האמצע של העכבר (בין שרירי הפסואס הדו-צדדיים). הגרעינים הסימפתטיים נמצאים במרכז המשולש הזה (איור 1A). הם נעים אנכית זה לצד זה ונראים שקופים. הם עשויים לחפוף כלי קטן שצולל לתוך קו האמצע של העכבר ושוכב שטוח על שריר הפסואס הימני שלו. השתמשו בפינצטה כדי לנתח בבוטות כל פאשיה שמעל כדי לחשוף את הגרעינים (איור 1B).
3. זהה את עורק הכליה השמאלי ואת עורק האשכים או השחלות השמאלי.
   הערה: מדובר בכלי דם גדולים שייצרו ריבוע, שדפנותיו מורכבות מעורק הכליה השמאלי בצורה עליונה, קו האמצע ואבי העורקים הבטני/הווריד הנבוב התחתון של החיה לרוחב, ועורק האשך השמאלי או השחלות נחות. הגרעינים ברמת L2 גדולים ונמצאים בתוך המרובע הזה (איור 1A). נתחו בזהירות כדי להיכנס למרובע הזה עם פינצטה ולזהות את גרעיני L2 הדו-צדדיים (איור 1B).
4. לאחר זיהוי החלקים התחתונים והעליונים של הגרעינים, תפסו את ההיבט התחתון של הגרעינים הדו-צדדיים הנראים לעין עם זוג פינצטות ומשכו כלפי מעלה. הדמיה של גרעינים במיקום נחות יותר, כגון L4 ו- L5, ניתן להגדיל על ידי דחיפה עדינה של כל האיברים החוסמים את הנוף בנחיתות עם זוג הפינצטה השני.
   הערה: הדמיה של כלי הניקוב בקו האמצע המוזכרת בשלב 3.2.2 תבטיח כריתת סימפתטומיה מותנית מלאה יותר. החזקת זוג פינצטה שני ביד השנייה, משכו את הפאשיה ואת הקשרים העצביים המחזיקים את הגרעינים בבטן ובמקביל משכו למעלה את הגרעינים עצמם עם זוג הפינצטה הראשון. רק זוג פינצטה אחד צריך להחזיק את הגרעינים, בעוד השני מנקה את הפאשיה ואת הקשרים העצביים. ברגע שזה מגיע לרמה של עורק האשך השמאלי או השחלות, זה עשוי להיות מועיל לזיהוי L2 אם גרעיני השרשרת התחתונה עדיין שלמים, מכיוון שגרעיני L2 ינועו כאשר יימשכו על ידי השרשרת התחתונה. ניתן לשבור את גרעיני L3-5 בעורק האשכים או השחלה לפני חילוץ גרעיני L2 מהמרובע באמצעות פינצטה. הגרעינים היחידים הנמצאים בתוך המרובע הם גרעיני L2.
5. הליך זה צריך להיות איבוד דם מינימלי. אם מתרחש דימום, יש לוודא המוסטזיס נאות לפני הסגירה.

4. סגירת העור

1. לאחר hemostasis נאות מושגת, להסיר את התפר מחזיק את כלי הבטן במקום.
2. בעזרת 2 אפליקטורים סטריליים עם קצוות כותנה, יש להחליף בזהירות את המעיים המוטים לחלל הבטן.
3. עם תפר נספג 5-0, בצע תפר ריצה כדי לקרב את שרירי הבטן.
4. עם תפר ניילון 5-0, השתמש בתפרים פשוטים קטועים כדי לסגור את העור.
5. החל שכבה נדיבה של משחה אנטיביוטית, כגון Neosporin, על אתר החתך.
6. הניחו את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום.
7. התבונן בעכבר כל 15 דקות עד שהוא ער ואמבולטורי. זה בדרך כלל לוקח פחות מ -30 דקות.

5. בדיקת זיעה פילוקרפין

הערה: כדי להעריך דלדול בפעילות התפקודית הסימפתטית לאחר כריתת סימפתטומיה מותנית, נעשה שימוש בבדיקת זיעה פילוקרפין 7 ימים לאחר כריתת סימפטקטומיה מותנית.

1. הכינו תמיסת פילוקרפין הידרוכלוריד 1% ב-0.9% NaCl לצד תערובת של 10% עמילן תפוחי אדמה בשמן קיק.
2. באמצעות מברשת צבע, לכסות את פני השטח plantar של כף הרגל עם betadine. הניחו לשכבה זו להתייבש לחלוטין.
3. לאחר ששכבת הבטאדין יבשה, השתמשו במברשת צבע נפרדת כדי למרוח שכבה של 10% עמילן בשמן קיק.
4. יש לתת 0.25 μL/g משקל גוף של 1% פילוקרפין תת עורית באמצעות מזרק לתוך העור הרפוי מעל הצוואר. הפעל טיימר מיד לאחר ניהול pilocarpine.
5. ב 8 דקות לאחר ההזרקה, לצלם תמונות של המשטח הפלנטרי של כף הרגל.
6. באמצעות פיג'י, ספרו את מספר הכתמים הכהים שנמצאים על כל ששת (6) משטחי כף הרגל (איור 2A).

6. אימונוהיסטוכימיה

הערה: כדי להעריך את הניוון של אקסונים סימפתטיים בעצבים ההיקפיים לאחר כריתת הסימפטקטומיה המותנית, העצבים הסיאטיים הדו-צדדיים נקצרו ביום ה-21 שלאחר הניתוח.

1. מרדימים את העכברים (לאחר שלב 1 של הפרוטוקול), קוצרים את העצבים הסיאטיים הדו-צדדיים, ולאחר מכן ממיתים מיד את בעל החיים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות).
2. הניחו את העצבים הסיאטיים ישירות לתוך 4% paraformaldehyde ב-0.01 M מלוחים חוצצי פוספט (PBS) למשך 20 דקות, ולאחר מכן העבירו אותם ל-20% סוכרוז ב-0.1 M PBS להגנה קריואקטיבית למשך הלילה ב-4°C.
3. חתכו את העצבים הסיאטיים לאורכם באמצעות קריוסטט ב-20 מיקרומטר, והניחו את המקטעים על שקופיות טעונות.
4. חסום את חלקי העצבים עם 10% סרום עיזים רגיל (NGS) במי מלח חוצצים עם 1% Tween 20 (TBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
5. הסר את המאגר החוסם והחלף אותו בנוגדנים העיקריים ארנב אנטי טירוזין הידרוקסילאז ועוף אנטי נוירופילמנט כבד מדולל במאגר החוסם (10% NGS ב TBST) ב 1:750 ו 1:1000, בהתאמה. אפשרו לנוגדנים הראשוניים לדגור במשך הלילה בתא לחות בטמפרטורת החדר.
6. יש לשטוף את המגלשה עם TBST 3 פעמים, 10 דקות כל כביסה, לפני מריחת הנוגדנים המשניים עז נגד ארנב 647 ועז נגד עוף 488, שניהם מדוללים בשעה 1:200 במאגר החסימה. אפשר לנוגדנים המשניים לדגור בתא לחות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
7. שטפו את המגלשה עם TBST 4 פעמים, 10 דקות כל כביסה, ואפשרו למגלשה להתייבש באזור מוגן אור לפני ההרכבה.
8. תמונה של חתכי עצב במרחק של לפחות 40 מיקרומטר זה מזה במיקרוסקופ פלואורסצנטי על המטרה 10x.
9. בפיג'י, יישרו את חלקי העצבים וציירו שלושה קווים אנכיים הממוקמים באופן אקראי לרוחב הקטע. ספרו את מספר האקסונים החוצים כל קו אנכי וחלקו אותו ברוחב הקטע בקו האנכי. חזור על הפעולה עבור כל אחד משלושת הקווים האנכיים בכל מקטע. ממוצע שלושת הערכים המתקבלים לכל קטע, ועוד יותר ממוצע את הערכים של שלושת החלקים לכל עצב.

פרוטוקול זה מתאר הסרה כירורגית של נוירונים סימפתטיים מותניים פוסט-גנגליונים מעכבר. שני עכברים עברו ניתוח לכריתת מותניים, ושני עכברים שימשו כקבוצת ביקורת. כדי להשיג כריתה מוצלחת של המותניים המותניים, יש לבצע הדמיה נאותה של לפחות הגרעינים הסימפתטיים הדו-צדדיים L2 ו-L3, כפי שניתן לראות באיור 1. הסרת גרעיני L4 ו-L5 תשיג ניתוק עצבים סימפתטי מלא של פלג הגוף התחתון; עם זאת, הדמיה של הגרעינים התחתונים עשויה להיחסם על ידי איברי האורגניטל. מחקרי מעקב מדרדרים קודמים הראו שרוב תאי העצב בגרעיני L2-L5 ממוקמים בגרעיני L2 ו-L3. למרות שרק עכברים נקבות תואמות גיל שימשו להשגת התוצאות המייצגות, הליך כירורגי זה שוכפל פעמים רבות הן בעכברים זכרים והן בנקבות ללא הבדלים אנטומיים משמעותיים שנצפו מבחינת מיקומי עורק האשכים או השחלה והגרעינים הסימפתטיים.

עם הסרת הגרעינים, תגובת ההזעה בתגובה לפילוקרפין פוחתת במהירות, עם הבדלים משמעותיים שנצפו ביום 7 שלאחר הניתוח (איור 2). יום 7 לאחר הניתוח נבחר בשל הירידה המעריכית בפעילות ההזעה בתיווך סימפתטי תוך 7 ימים לאחר פגיעות עצביות סיאטיות שונות בחולדות³⁴. מכיוון שניוון האקסון יכול להימשך עד 14 יום ובשל קושי פוטנציאלי לדמיין את גרעיני L4 ו- L5 תוך ניתוחיים (שלפוחית השתן ואיברי המין עשויים לחסום את הראייה), תגובת ההזעה עשויה שלא להיות אבלטית לחלוטין^35,36.

צפיפות האקסון החיובי לטירוזין הידרוקסילאז (TH+) ירדה באופן משמעותי ביום ה-21 שלאחר הניתוח, ללא שינוי בצפיפות השרשרת הנוירופילמנטית (NF-H) (איור 3). אקסוני TH+ לא צפויים להתרוקן לחלוטין בשל נוכחותם של אקסונים חושיים TH+ המעצבבים קולטנים מכניים בעלי סף נמוך וקשיים פוטנציאליים בהדמיה של השרשרת הסימפתטית המותנית המלאה³⁷.

איור 1: מבט תוך-ניתוחי על הגרעינים הסימפתטיים המותניים. (A) סכמטי עם ציוני דרך צפויים. (B) תמונה תוך ניתוחית מייצגת עם ציוני דרך מסומנים. הגרעינים הסימפתטיים המותניים ממוקמים מאחורי אבי העורקים הבטני היורד והווריד הנבוב התחתון (מוסט). הגרעינים נמשכים לימינו של העכבר עם הסטייה של כלי הבטן וממוקמים על הפסואה הימנית, חוצים בנחיתות ובעליונות. ניתן לדמיין את גרעיני L2 הדו-צדדיים בין עורק הכליה השמאלי לבין עורק האשך או השחלה השמאלי, וגרעיני L3 נראים נחותים לעורק האשך השמאלי או השחלות. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: כריתת סימפטקטומיה מותנית כירורגית מפחיתה את מספר כתמי ההזעה בכפה האחורית. (A) סכמטיות של מיקומי כריות כף הרגל על פני השטח הפלנטריים של כפו האחורית של העכבר. (B) תמונה מייצגת של תגובת ההזעה 8 דקות לאחר הזרקת פילוקרפין בחיה שלמה. (ב') תמונה מוגדלת עם חצים לבנים המציינים מספר נבחר של כתמי הזעה. (C) תמונה מייצגת של תגובת ההזעה 8 דקות לאחר הזרקת פילוקרפין בבעל חיים שעבר כריתת סימפתים ביום 7 שלאחר הניתוח. (ג') תמונה מוגדלת עם חצים לבנים המציינים מספר נבחר של כתמי הזעה. (D) המספר הכולל של כתמי הזעה על כל שש כריות כף הרגל של הכף האחורית בעכברים שלמים לעומת עכברים שעברו כריתת מוח. הנתונים מוצגים כשהקו מייצג את החציון. מבחן מאן-ויטני. *P < 0.05. פסי קנה מידה: 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית (Sympx) מפחיתה את מספר האקסונים הסימפתטיים בעצב הסיאטי. (A) טירוזין הידרוקסילאז (TH)-אקסונים חיוביים למיקרומטר של העצב הסיאטי (רוחב העצב) ביום ה-21 שלאחר הניתוח. חלקי עצב מייצגים של צביעת TH בעכבר שלם (B) וסימפטקטומי (B'). (C) שרשרת נוירופילמנטית כבדה (NF-H)-אקסונים חיוביים למיקרומטר של העצב הסיאטי. מקטע עצבי מייצג של צביעת NF-H בעכבר שלם (D) וסימפתאקטומי (D). קווים מקווקווים מגנטה מייצגים קווים אנכיים אפשריים הממוקמים באופן אקראי המשתרעים לרוחב קטע העצב המשמש לחישוב צפיפות האקסון בעצב. חיצי מגנטה מציינים מספר נבחר של אקסונים החוצים את הקווים האנכיים הממוקמים באופן אקראי. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. מבחן t לא משויך. **P < 0.01. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגרעינים הסימפתטיים המותניים הם מבנים קטנים מאוד הממוקמים מאחורי איברי בטן קריטיים רבים וכלי דם גדולים. לכן, הליך זה דורש דיוק ודיוק משמעותיים. חלק גדול מהקושי טמון בזיהוי הגרעינים הסימפתטיים תוך ניתוחית. מוצע כי הלומד יוכל תחילה לזהות את הגרעינים בגופת עכבר לפני שינסה הליך זה בעכבר חי. לעתים קרובות יהיה צורך בפתרון בעיות בעת זיהוי הגרעינים הסימפתטיים לאחר הסטת המעיים. כדי להבטיח הדמיה נאותה, המעי הגס היורד חייב להיות גלוי. הסטת המעי מחוץ לחלל הבטן חייבת לכלול את הצקום. בנוסף, שלפוחית השתן עשויה להיות מלאה ומוגדלת, מה שעלול לחסום את שדה הראייה של המעי הגס היורד, וכתוצאה מכך, את אבי העורקים הבטני היורד ואת הווריד הנבוב התחתון. באופן אידיאלי, שלפוחית השתן מתבטאת ידנית ברגע שהעכבר נמצא תחת הרדמה לפני ביצוע החתך הראשוני בעור. עם זאת, במידה ושלפוחית השתן אינה באה לידי ביטוי והראייה התוך ניתוחית נחסמת, ניתן לבצע הבעה עדינה עם 2 אפליקטורים סטריליים עם קצוות כותנה. יש להקפיד שלא לפגוע בשופכנים, המחוברים לאספקט האחורי של שלפוחית השתן. ברגע שאבי העורקים הבטני והווריד הנבוב התחתון מזוהים אחוריים למעי הגס היורד, סטייה וייצוב נאותים של כלי הדם הם קריטיים להדמיה של הגרעינים הסימפתטיים. הפאשיה קשה יחסית, ואם התפר ממוקם אך ורק דרך שכבת הפאשיה והקשרים העצביים ולא דרך דפנות כלי הדם, יש למשוך את כלי הדם לפחות 1 מ"מ מקו האמצע. את הפאשיה שמעל הגרעינים הסימפתטיים ניתן לנתח בעדינות בעזרת פינצטה. אם כלי קטן כלשהו נשבר במהלך ההליך, יש להפעיל לחץ עם אפליקטור סטרילי עם קצוות כותנה למשך 10 שניות לפחות כדי להבטיח המוסטזיס נאות לפני הסגירה. אם כלי הבטן הגדולים מנוקבים במהלך הניתוח, יש להרדים את העכבר במהירות.

למרות ששיטה זו מאפשרת הדמיה ישירה והסרה של הגרעינים הסימפתטיים, ובכך מאפשרת מיקוד ספציפי יותר של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים אלה בהשוואה לכריתת סימפתטיות כימית²³, ישנן כמה מגבלות. ניתוח זה מביא להסרת הגרעינים הסימפתטיים המותניים L2-L5; עם זאת, בשל חסימת הראייה הנגרמת על ידי איברים אורוגניטליים חיוניים, הגרעינים הנמוכים ביותר, כגון הגרעינים ברמת L4-L5, קשה יותר לדמיין ולהסיר במהלך הליך זה. רוב תאי העצב המעצבבים את הגפיים התחתונות ממוקמים בגרעיני L2 הגדולים. גרעיני L5 קטנים מאוד ומכילים פחות נוירונים, כפי שנראה בניסויי מעקב פלואורסצנטיים קודמים³⁸; עם זאת, כישלון להסיר נוירונים אלה עלול לעוות את ניתוח התוצאות של מבנים דיסטליים ביותר, כגון הרגליים. כדי להבטיח תוצאות טובות יותר כאשר לומדים את המטרות הדיסטליות בכפות הרגליים, מומלץ לבדוק את הרקמה שחולצה כדי לספור את מספר הגרעינים שהוסרו. ניתן לעשות זאת באמצעות עכבר כתב פלואורסצנטי שבו ניתן לדמיין בקלות את הנוירונים הסימפתטיים הפוסט-גנגליונים או באמצעות נותב רטרוגרד פלואורסצנטי המוזרק למטרה הדיסטלית לפני הניתוח. כמה עכברי כתב פלואורסצנטי למטרה זו כוללים את ThCre:mTmG (ראו טבלת חומרים), שיש לו תיוג דליל ביותר של נוירונים חיוביים לטירוזין הידרוקסילאז³⁹, Phox2bCre:tdTomato (ראו טבלת חומרים), שיש לו תיוג מתון של נוירונים סימפתטיים פוסט-גנגליונים^40,41, ואת ThCre:tdTomato (ראו טבלת חומרים), שיש לו תיוג נרחב של הנוירונים הסימפתטיים הפוסט-גנגליונים⁴². זו אינה רשימה ממצה של שורות זמינות.

בנוסף, בשל החתך הגדול הנדרש להליך כירורגי זה, עכברים עשויים להזדקק לתקופת החלמה ארוכה יותר לפני שניתן יהיה לבצע ניסויים נוספים. עכברים צריכים להיות במעקב במשך 3 ימים לפחות עבור צרכים נאותים, השתנה, והאכלה. יתר על כן, המוסטזיס לא תקין יכול להוביל לדימום תוך בטני ללא טיפול, אשר יכול לגרום למוות עכבר בנקודות זמן בלתי צפויות. לכן, הבטחת השגת המוסטזיס לפני סגירת הניתוח היא קריטית להצלחת ניסויים עתידיים. הנוירונים הסימפתטיים יכולים להיות ממוקדים גם מבחינה כימית, כאמור²⁴.

השימוש בסימפטקטומיה כירורגית יאפשר מספר רב של מחקרים שמטרתם לחקור את תפקיד העצבוב הסימפתטי הפוסט-גנגליוני במטרות דיסטליות, כגון תפקיד העצבוב הסימפתטי בצומת העצבית-שרירית¹². בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקות מעקב מדרדר פלואורסצנטי כדי לכמת עצבוב מחדש סימפתטי של רקמות דיסטליות, שכן פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לחלץ את הגרעינים en bloc מעכברים קבועים paraformaldehyde³⁸. בהקשר של פגיעות עצביות היקפיות, מודל "נוק-אאוט" כירורגי זה יאפשר אפיון טוב יותר של ההתאוששות התפקודית הסימפתטית הצפויה ברקמות שהיו בעבר עצבניות.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי של NIH תחת פרס מספר K01NS124912 ובחלקה על ידי מענק התפתחותי ממרכז אמורי המתמחה למצוינות במחקר בהבדלים בין המינים U54AG062334 במימון NIH ותוכנית הכשרת המדענים הרפואיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי. תודה לדיוויד קים, לאחר הבגרות, על חיתוך עצבים סיאטיים ול- HaoMin SiMa, מומחה מחקר, על הדפסת תלת מימד תושבת טלפון למיקרוסקופ הסטריאו שלנו שאפשרה את צילום הסרטון.