Модель экспериментального воздействия на человека личинок клещей Ixodes scapularis

В данной статье представлена методология контакта человека с личинками Ixodes scapularis для проведения клинических исследований. Метод относительно прост, приемлем для добровольцев-исследователей и может быть модифицирован в соответствии с экспериментальными потребностями. Такие исследования с участием человека в качестве субъекта исследования должны проводиться в соответствии с протоколами клинических исследований, утвержденными соответствующими регулирующими органами.

Клещевые заболевания являются серьезной проблемой общественного здравоохранения в Соединенных Штатах и во всем мире. Клещи — это облигатные членистоногие, питающиеся кровью; Иксодовый клещ должен оставаться прикрепленным к коже хозяина и завершить свой многодневный процесс питания, чтобы получить его кровяную пищу. Контакт животных с клещами является обычной практикой для изучения реакции хозяев на укусы клещей и клещевые заболевания. Мы разработали процедуру, провели первое научное исследование на людях и опубликовали результаты по воздействию на добровольцев неинфицированных личиночных клещей Ixodes scapularis . В этой статье описывается методология, использованная для создания защитной повязки, способы наложения и закрепления клещей на хозяине, способы поддержания повязки и удаления клещей с хозяина. Контакт добровольцев с укусами клещей является экспериментальной процедурой и должен выполняться в соответствии с протоколом клинических исследований, утвержденным соответствующими регулирующими органами. Этот метод позволяет проводить трансляционные исследования, чтобы лучше понять реакцию человека на укусы клещей и способствовать разработке диагностики, профилактики и лечения клещевых заболеваний.

Твердые клещи (Ixodidae: Acari) являются облигатными кровопитающими эктопаразитами, которые встречаются во всем мире и способны передавать широкий спектр патогенов, включая бактерии, вирусы и паразитов, имеющих большое медицинское и ветеринарное значение. Иксодовые клещи должны оставаться прикрепленными к хозяину в течение нескольких дней, чтобы завершить прием пищи кровью, и они обладают способностью оставаться прикрепленными к коже, избегая распознавания, предотвращая местное свертывание крови и способствуя долгосрочному питанию ^1,2,3. Исследования на животных показали, что неразрешающие хозяева приобретают устойчивость к укусам клещей при повторном воздействии клещей, что может привести к снижению способности передавать патоген, в то время как клещи могут многократно паразитировать на разрешающих хозяевах. Приобретенная резистентность к клещам зависит от характера иммунного ответа хозяина 4,5,6,7.

Клещевые заболевания представляют собой растущую угрозу в Соединенных Штатах (США), при этом число зарегистрированных случаев увеличилось более чем в два раза в период с 2004 по 2016 год^{до 8,9}. Из-за изменения климата географические ареалы различных клещей продолжают расширяться ^10,11. К ведущим клещевым заболеваниям в США относятся болезнь Лайма, анаплазмоз, эрлихиоз, пятнистый лихорадочный риккетсиоз, бабезиоз, туляремия и болезнь, вызванная вирусом Повассан⁸. Болезнь Лайма, вызванная инфекцией Borrelia burgdorferi sensu lato, является наиболее распространенным клещевым заболеванием в США и Европе¹². С учетом того, что ежегодно в США у 476 000 человек диагностируется болезнь Лайма, существует как общественное здравоохранение, так и экономическое бремя для отдельных лиц^{и общества.}

Ixodes scapularis (черноногий или оленьий клещ) является основным переносчиком болезни Лайма, а также анаплазмоза, бабезиоза, болезни Borrelia miyamotoi и болезни, вызванной вирусом Повассан, в США. К другим важным с медицинской точки зрения видам клещей в США относятся Amblyomma americanum (клещ одинокой звезды), Dermacentor variabilis (американский собачий клещ), Ixodes pacificus (западный черноногий клещ), Dermacentor andersoni (древесный клещ Скалистых гор), Ixodes cookei (клещ сурка), Dermacentor occidentalis (клещ тихоокеанского побережья), Rhipicephalus sanguineus (коричневый собачий клещ) и Amblyomma maculatum (клещ побережья Мексиканского залива)¹⁶.

Разработка метода воздействия на добровольцев-исследователей укусов клещей поддерживает исследования с использованием естественного вектора для поиска доказательств инфекции, процедуры, известной как ксенодиагностика 17,18,19,20,21, и для получения дополнительной информации об иммунитете, вызванном контактом с клещами, что может способствовать открытию противоклещевой вакцины ^5,6,7. Описанная здесь процедура была разработана и использована в первом исследовании на людях с использованием выращенной в лаборатории личинки Ixodes scapularis для ксенодиагностики инфекции B. burgdorferi после антибиотикотерапии (NCT01143558), опубликованном в 2014 году^. Система была успешно использована в исследовании фазы 2, в котором изучалось, коррелирует ли положительный ксенодиагноз с сохранением симптомов после лечения антибиотиками болезни Лайма (NCT02446626), а также в исследовании, изучающем реакцию хозяина на укусы клещей (NCT05036707).

Этот протокол процедуры описывает процесс создания защитной повязки, процедуру размещения клеща и процедуру удаления клещей, а также уход за участком, необходимый для поддержания защитной повязки. Подробности, касающиеся колонии клещей I. scapularis без патогенов и процедур воздействия на клещей, использованных в вышеупомянутых исследованиях, были описаны ранее^19,22. Эта методология предлагает гибкий исследовательский инструмент, который может быть адаптирован для изучения различных аспектов реакции человека на укусы клещей, эффективности препаратов для профилактики клещей, а также болезни Лайма и других клещевых заболеваний.

Контакт добровольцев с укусами клещей является экспериментальным методом и должен проводиться в соответствии с протоколом клинических исследований, утвержденным соответствующими регулирующими органами. Клинические исследования (NCT01143558, NCT02446626 и NCT05036707) были одобрены соответствующими институциональными наблюдательными советами, проведены в соответствии с исключениями для исследуемых устройств, предоставленными Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, и проведены в соответствии с рекомендациями надлежащей клинической практики. Кроме того, эти исследования были зарегистрированы в ClinicalTrials.gov, и было получено письменное информированное согласие от всех участников.

1. Подготовка защитной повязки

1. Чтобы создать шаблон измерения, сделайте фотокопию гидроколлоидной повязки размером 3 x 3 дюйма вдоль боковой линии измерения (Рисунок 1A и Таблица материалов).
2. Вырежьте ксерокопию шаблона по линии 1". Затем разрежьте по линии 2", создав круг 2" с центром 1" (Рисунок 1B).
3. Используя этот шаблон, вырежьте неадгезивную пенопластовую повязку, чтобы создать круг 2 дюйма с центром 1 дюйм (Рисунок 2A, B и Таблица материалов).
4. Используя тот же шаблон, вырежьте круг размером 2 дюйма в центре сверхтонкой гидроколлоидной повязки размером 4 x 4 дюйма (Рисунок 2C, D).
5. Разрежьте гидроколлоидный слой защитной повязки размером 3 x 3 дюйма на линии 11/2 дюйма.
6. Оттяните бумажный вкладыш гидроколлоидного слоя защитной повязки, чтобы обнажить клей. Поместите повязку из разрезанной пены в круг клея диаметром 2 дюйма (Рисунок 3A). Это гарантирует, что пенная повязка выйдет за пределы отверстия защитной повязки. Замените бумажный вкладыш на гидроколлоидный слой повязки (рисунок 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти измерения использовались для исследований с участием до 10 личинок клещей I. scapularis . Для исследований с участием до 30 личинок клещей I. scapularis шаблон для центра пенопласта был разрезан между отметками 1" и 11/2", чтобы обеспечить большую площадь для размещения. Размеры защитной оболочки могут быть адаптированы в соответствии с планом исследования.

2. Расстановка клещей

1. Хранение клещей
   1. Хранить личинок клещей I. scapularis следует в медицинском холодильнике при температуре 9-10 °C.
   2. Храните клещей во флаконе, закрытом сетчатой крышкой, чтобы обеспечить достаточный приток воздуха. Упакуйте флакон с клещами в герметичный полиэтиленовый пакет со слегка смоченной губкой для поддержания влажности и предотвращения высыхания.
2. Расстановка галочек
   1. Достаньте клещей из холодильника, чтобы дать им нагреться до комнатной температуры. Клещи могут активизироваться уже за 15 минут вне холодильника.
   2. Расположите белый лист вокруг области размещения, чтобы легко визуализировать любого случайно выпавшего клеща.
   3. Смочите марлевую салфетку размером 4 x 4 дюйма чистой водой или физиологическим раствором и используйте ее для очистки кожи в месте размещения. Участок следует высушить или дать высохнуть на воздухе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе места для размещения клещей учитывайте зоны, которые не ограничивают повседневную деятельность добровольца и где участник может легко контролировать целостность повязки. Не размещайте клещей в местах, где они могут быть раздавлены из-за прямого давления (например, на спине). Оцените волосяное покров на теле участника, и при необходимости аккуратно подстригите лишние волосы на теле с помощью ножниц в месте нанесения клея, не допуская повреждения кожи. Избегайте использования бритвы для удаления волос, так как это может увеличить риск травмирования кожи и инфекции.
   4. Как только кожа высохнет, снимите клейкую подкладку с гидроколлоидной стороны приготовленной повязки и плотно прикрепите ее к коже в месте размещения, следя за тем, чтобы слой сетки оставался открытым.
   5. Разломите деревянный тампон (см. Таблицу материалов) пополам, чтобы обнажить зазубренные концы.
   6. Осторожно откройте флакон с клещами.
   7. С помощью зазубренного конца деревянного тампона перенесите активных клещей из флакона и поместите их на кожу внутри защитной повязки (рисунок 4A). Поручите дополнительному члену команды следить за местом размещения клещей, чтобы убедиться, что клещи остаются внутри защитной повязки. Используйте клейкую ленту для улавливания клещей, которые вырываются из флакона во время этого процесса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сломать деревянный тампон и использовать зазубренный конец эффективно для манипуляций с клещами и их переноса, не причиняя вреда клещам. Небольшая кисточка с мягкой щетиной светлого цвета также подходит для переноса клещей из контейнера на участок кожи.
   8. После того, как указанное количество клещей для исследования будет размещено, снимите клеевой вкладыш с сетчатого слоя защитной повязки и закройте его над отверстием.
   9. Убедившись, что клей надежно прикреплен, нанесите приготовленную сверхтонкую гидроколлоидную повязку размером 4 x 4 дюйма поверх защитной повязки для дополнительной безопасности (Рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительную информацию о колонии клещей I. scapularis без патогенов и продолжительности процедур воздействия на клещей, использованных в цитируемых исследованиях, можно найти в разделах «Методы» опубликованных исследований^19,22.

3. Уход за участком

1. Предоставить участнику исследования водный барьер и гипоаллергенную ленту диаметром 2 дюйма (см. Таблицу материалов).
2. Предоставьте инструкции по уходу за местом содержания клещей.
   1. Периодически проверяйте повязку и следите за краями на предмет надежного сцепления с кожей. При необходимости наклейте дополнительную ленту для укрепления краев повязки.
   2. Не царапайте место наложения повязки, а также воздержитесь от вскрытия или снятия повязки в период исследования.
   3. Избегайте купания или замачивания в воде. Также избегайте горячего душа и ограничьте продолжительность принятия душа. Перед принятием душа защитите защитную повязку прилагаемой водонепроницаемой крышкой и снимите ее после принятия душа. Аккуратно промокните повязку насухо и осмотрите ее, чтобы убедиться, что она остается надежной.
   4. Избегайте занятий, которые могут привести к сильному потоотделению и нарушить целостность повязки (например, аэробные упражнения, длительные походы).

4. Удаление клещей

1. Приготовление коллекционных флаконов
   1. Пометьте флаконы для сбора клещей нужными идентификаторами (например, кодом исследования, датой).
   2. Если необходимо сохранение живых клещей, проколите отверстия в крышке флаконов иглой 20 G. Используйте слой нейлоновой или полиэфирной сетки вместе с крышкой, чтобы запечатать флакон. Поместите небольшой кусочек влажной губки в герметичный пакет вместе с флаконом с клещами для поддержания влажности.
2. Удаление клещей
   1. Положите белые листы вокруг места наложения повязки и убедитесь, что бассейн для сбора находится в пределах досягаемости.
   2. С помощью спиртовых салфеток аккуратно снимите повязку с кожи.
   3. После полного снятия поместите повязку в таз для сбора и осмотрите ее на наличие отделившихся клещей.
   4. Оцените место размещения прикрепленных клещей. Клещи, которые накормились до полного отторжения, отсоединятся (рисунок 5A). Для удаления остальных прикрепленных клещей используйте щипцы с тонким наконечником (рисунок 5B).
   5. Очистите кожу спиртовыми салфетками или водой с мылом.

Исследование показало, что процедура безопасна и хорошо переносится, при этом основным побочным явлением является легкий зуд в месте укуса, который наблюдается в 58% процедур. Серьезных нежелательных явлений, связанных с процедурой, при использовании чистых выращенных в лаборатории личинок I. scapularis клещей¹⁹ не выявлено. В 43 проведенных процедурах средний процент восстановления прикрепленных клещей по сравнению с размещенными клещами составил 45% ± 27% (SD), при этом медианный процент составил 40% (Рисунок 6).

Точная продолжительность прикрепления личинок клещей I. scapularis к человеку остается неясной, так как время от размещения клеща до прикрепления клеща обычно не наблюдалось. В одном случае, когда за добровольцем-исследователем наблюдали в течение 2 часов, ни один из клещей не прикрепился к концу периода. Для личинки клещей I. scapularis до насыщения требуется от 4 до 5 дней с момента откладки¹⁹.

Рисунок 1: Размеры защитной оболочки. (A) Фотокопия защитной оболочки. (B) Шаблон измерения защитной оболочки, созданный путем резки фотокопии по желаемой маркировке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Создание неадгезивных и гидроколлоидных армирующих повязок. (A) Использование шаблона для измерения защитной оболочки для резки пенной повязки. (B) Круг 2 дюйма с повязкой из пенопласта 1 дюйм в центре. (C) Использование шаблона для измерения защитной оболочки для разрезания гидроколлоидной повязки. (D) Гидроколлоидная повязка размером 4 x 4 дюйма с центром 2 дюйма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Защитная повязка. (A) Пенная повязка на клеевой стороне гидроколлоидного слоя защитной повязки. (В) Защитная повязка, используемая для кормления клещей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Размещение клещей. (А) Перенос клещей на добровольца-исследователя. (В) Закрепление защитной повязки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Сбор клещей. (А) Отдельные изобилующие клещи. (Б) Удаление прикрепленных клещей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Восстановление личиночных клещей Ixodes scapularis . Каждая точка представляет процент набухших личиночных клещей I. scapularis , восстановленных с использованием описанного протокола. Средний процент восстановленных тиков составил 45 ± 27 (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В то время как исследования на животных, включающие воздействие клещей 4,5,6,7,21, были неоценимы для улучшения нашего понимания реакции хозяина на клещевые болезни и укусы клещей, эти модели имеют ограничения в том, насколько хорошо они предсказывают реакцию человека хозяина. Эта модель, которая описывает методологию контролируемого воздействия укусов клещей на людей, может быть легко адаптирована для ответа на различные исследовательские вопросы и расширяет возможности проведения необходимых исследований на людях.

Первоначальное исследование потребовало разработки новой системы, которая позволила бы клещам питаться в течение нескольких дней, а также была бы комфортной и переносимой для человека. После оценки различных методов описанная здесь защитная повязка в конечном итоге оказалась наиболее успешной. Во время первоначальных испытаний клещи блуждали к краю круглого выреза защитной повязки и умирали на открытом клее до того, как могло произойти прикрепление. Чтобы учесть такое поведение клещей, под гидроколлоидный клей защитной повязки было добавлено неадгезивное пенопластовое кольцо. Это обеспечивало неадгезивный темный край, по которому клещи мигрировали на кожу и прикреплялись к ней. Неприкрепленные клещи высыхали и погибали в повязке. Если клещи выходили за пределы слоя пенопласта, они попадали на клей и погибали. После того, как клещи прикреплялись к коже, они, как правило, оставались встроенными до тех пор, пока не насытились. Клещи, которые накормились до отпора, открепятся; Следовательно, важно осмотреть снятую повязку, чтобы собрать этих откормленных клещей. Если клинический протокол не требует, чтобы клещи питались до полного восполнения, используйте щипцы с тонким наконечником для удаления прикрепленных клещей.

Продолжительность кормления клещей будет зависеть от исследовательского вопроса, стадии жизни клеща и утвержденного клинического протокола. Для проведения исследований с использованием этой колонии личинок I. scapularis, клещам потребовалось от 4 до 5 дней, чтобы насытиться^{до 19} дней. Добровольцев-исследователей просят воздержаться от таких видов деятельности, как физические упражнения и плавание, которые могут нарушить защитную повязку. Для принятия душа волонтерам предоставляются водные барьерные покрытия, подобные тем, которые используются для покрытия центральных внутривенных катетеров и гипсовых повязок. Кроме того, их инструктируют избегать длительного горячего душа. Если позаботиться о том, чтобы защитная повязка оставалась сухой и при необходимости укрепить ее дополнительной лентой, она останется неповрежденной.

Для первоначального исследования на людях для процедуры была выбрана личинка I. scapularis . Причины выбора включали сходство с исследованием на мышах²³ , а также практические причины. Использование личиночных клещей вызывало меньше опасений по поводу безопасности, так как на этой стадии не получали кровяную пищу перед использованием в клинических протоколах. Кроме того, их относительная распространенность (по сравнению с другими этапами) облегчила тестирование и получение более крупных чисел. Тестирование этой колонии свободных от патогенов личинок I. scapularis описано в Marques et ^al.19. Проводятся новые клинические исследования с использованием нимфальных клещей, в том числе исследование по оценке эффективности лекарства для уничтожения клещей (NCT05387083) и исследование по борьбе с клещами (NCT05965635).

Воздействие клещей на людей-добровольцев было новой концепцией и имеет свои ограничения. Колония клещей должна быть безопасно выращена и проверена на наличие известных патогенов, которые могут передаваться человеку, прежде чем их можно будет использовать для клинических исследований. Этот процесс требует адекватных знаний и ресурсов.

Много усилий прилагается для информирования потенциальных добровольцев-исследователей о безопасности и переносимости процедуры, а также о процессе содержания клещей под защитной повязкой. Несмотря на то, что эта методология воздействия клещей позволяет добровольцам-исследователям продолжать большую часть своей повседневной деятельности, корректировка образа жизни, необходимая для поддержания защитной повязки, и временные затраты могут сдерживать участие.

Несмотря на ограничения, разработка модели воздействия на человека личиночных клещей I. scapularis является важным исследовательским инструментом. Эта процедура имеет исследовательскую полезность для содействия исследованиям клещей, укусов клещей, реакции человека на клещей и профилактики клещевых заболеваний. Преимуществом данной методики является ее простота и технологичность. Методология может быть использована для кормления иксодовых клещей на разных этапах жизни и подходит для различных типов экспериментов, где требуется подвергать человека воздействию иксодовых клещей. Исследовательские процедуры с участием человека в качестве субъекта исследования должны проводиться в рамках клинических исследований, одобренных соответствующими регулирующими органами.

Д-р Адриана Маркес имеет патент US 8,926,989 B2; и является неоплачиваемым научным советником Глобального альянса по борьбе с болезнью Лайма и Американского фонда по борьбе с болезнью Лайма. У Сиу Пин Турк и Алии Эшман нет связей, которые могли бы привести к конфликту интересов. Содержание данной публикации не обязательно отражает точку зрения или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, а также упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США.

Это исследование было поддержано Программой внутренних исследований NIH, Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний. Мы благодарим Линдена Т. Ху, Сэма Р. Телфорда III, Кеннета Дардика, Карлу Уильямс, Эрин Чанг и Кристину Брандебург за их участие в разработке процедур.