Выделение, культивирование и характеристика первичных дермальных фибробластов из келоидной ткани человека

В этом исследовании описывается оптимизированный протокол создания первичных фибробластов из келоидных тканей, которые могут эффективно и стабильно обеспечивать чистые и жизнеспособные фибробласты.

Фибробласты, основной тип клеток в келоидной ткани, играют важную роль в образовании и развитии келоидов. Выделение и культивирование первичных фибробластов, полученных из келоидной ткани, являются основой для дальнейших исследований биологической функции и молекулярных механизмов келоидов, а также новых терапевтических стратегий их лечения. Традиционный метод получения первичных фибробластов имеет ограничения, такие как плохое клеточное состояние, смешивание с другими типами клеток и восприимчивость к контаминации. В этой статье описывается оптимизированный и легко воспроизводимый протокол, который может уменьшить возникновение возможных проблем при получении фибробластов. В этом протоколе фибробласты можно наблюдать через 5 дней после выделения и достигать почти 80% слияния после 10 дней культивирования. Затем фибробласты пассируют и верифицируют с помощью антител к PDGFRα и виментину для иммунофлуоресцентного анализа и антител к CD90 для проточной цитометрии. В заключение, фибробласты из келоидной ткани могут быть легко получены с помощью этого протокола, что может обеспечить обильный и стабильный источник клеток в лаборатории для исследования келоидов.

Келоид, фибропролиферативное заболевание, проявляется в виде непрерывного роста бляшек, которые часто вторгаются в окружающую нормальную кожу без самоограничения и вызывают зуд, боль, а также косметические и психологические нагрузки для пациентов¹. Фибробласты, первичные клетки, участвующие в келоидах, играют важную роль в формировании и развитии этого заболевания из-за чрезмерной пролиферации, избыточной продукции внеклеточного матрикса и дезорганизованных коллагенов ^2,3. Тем не менее, основной патогенез остается неясным, и эффективный метод лечения келоида до сих пор отсутствует; Поэтому существует острая необходимость в дальнейших исследованиях ^4,5.

Поскольку не существует идеальной животной модели для исследования келоидов in vivo ^6,7, построение модели in vitro путем получения первичных фибробластов из келоидных тканей может обеспечить осуществимость и надежность исследования келоидов ^2,6. Первичными клетками являются клетки, полученные непосредственно из живой ткани, и общепризнано, что эти клетки могут более близко напоминать физиологическое состояние и генетический фон нескольких индивидуумов по сравнению с клеточными линиями ^8,9. Культивирование первичных клеток является мощным средством для изучения роста и метаболизма клеток, а также других клеточных фенотипов.

В настоящее время существует два метода получения первичных фибробластов: ферментное расщепление и эксплант-культура. Тем не менее, было выявлено несколько препятствий для получения первичных фибробластов, таких как риск заражения различными бактериями или грибами, смешивание с другими типами клеток, которые не так легко удаляются, длительный период цикла культивирования, последующие изменения характеристик клеток по сравнению с исходными клетками^{и так далее}.. Поэтому разработка осуществимого и эффективного процесса получения первичных фибробластов является основой для дальнейших исследований и применений. В этом исследовании описан оптимизированный протокол извлечения первичных фибробластов из келоидных тканей, который может эффективно и стабильно обеспечивать чистые и жизнеспособные фибробласты.

Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом Дерматологической больницы Южного медицинского университета (2020081). Информированное согласие пациента было получено до того, как у пациентов были взяты ткани.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры должны выполняться в стерильной среде под шкафом биологической безопасности.

1. Готовят полную питательную среду, добавляя 10% фетальную бычью сыворотку (FBS) и 1% раствор пенициллина-стрептомицина-амфотерицина B (ПСА) в модифицированную среду Eagle (DMEM) с высоким содержанием глюкозы Dulbecco.
2. Приготовьте фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) с PSA, добавив 1% PSA в 1x PBS. Подготовьте PBS с помощью FBS, добавив 1% FBS к 1x PBS.
3. Подготовьте несколько стерилизованных ножниц, щипцов и скальпелей в автоклаве.

2. Получение удаленных тканей

1. Получение тканей у пациентов с келоидными рубцами хирургическим путем. Соберите свежие келоидные ткани в стерильный упаковочный пакет или стерильную центрифужную пробирку и как можно скорее перенесите их в шкаф биологической безопасности в лаборатории.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе размер приобретенной келоидной ткани составлял примерно ~20 x 20 x 10^мм3, и размер может варьироваться в зависимости от операции.

3. Изоляция

1. Удалите келоидную ткань стерильным пинцетом и поместите ее в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 10-25 мл PBS с 1% ПСА на 10 минут. Затем подготовьте планшет на 6 лунок и добавьте в каждую лунку 4 мл PBS с добавлением 1% PSA. Выньте салфетку стерилизованным пинцетом и дважды промойте ее PBS с добавлением 1% PSA. С помощью стерильных щипцов последовательно переносят ткань из одной лунки в другую.
2. Удалите слои жира и эпидермиса с помощью хирургических ножниц или хирургического скальпеля, а слой дермы оставьте нетронутым. Обрезают и рассекают ножницами слой дермы на^{3-5 мм 2} штуки, переносят эти кусочки стерильными щипцами в следующую лунку и снова промывают в ПБС с 1% раствором ПСА.

4. Культура

1. Поместите кусочки ткани дермы в чашки Петри с помощью стерилизованных щипцов; Убедитесь, что количество деталей составляет от 10 до 30, а расстояние между ними составляет >5 мм. Поставьте чашки Петри вверх дном в инкубатор с 5%_СО2 при температуре 37 °C на 30-60 мин, пока кусочки тканей немного не подсохнут и не прилипнут к чашке Петри. Затем добавьте DMEM с добавлением 10% FBS и 1% PSA и осторожно поместите чашки Петри в инкубатор с 5%_CO2 при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты представляют собой морфологически и функционально гетерогенную клеточную популяцию. Учитывая эту сложность, этапы изоляции и культивирования должны выполняться с осторожностью; Равномерно выберите кусочки келоидной дермальной ткани и хорошо перемешайте эти кусочки, прежде чем поместить их в чашку Петри.
2. Через 3 дня замените половину надосадочной жидкости полной питательной средой. Меняйте питательную среду каждые 2-3 дня. Наблюдайте за фибробластами под микроскопом при 40-кратном увеличении каждый день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны выполняться аккуратно. Не перемещайте чашку Петри в течение 2 дней после изоляции, так как кусочкам ткани требуется время, чтобы прилипнуть к чашкам Петри.
3. Когда фибробласты, растущие вокруг кусочков ткани, достигнут примерно 90% слияния, удалите кусочки ткани и питательную среду. Промойте фибробласты стерильным 1x PBS и добавьте 2 мл стерильного 1x раствора трипсина-ЭДТА на пластины. Инкубируют клетки примерно ~3-5 мин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%_СО2 . Осторожно постучите по чашке для закваски и понаблюдайте за ней под микроскопом. Когда большая часть клеток отделится от пластины, добавьте 2 мл полной среды, чтобы завершить процесс пищеварения.
4. Переложите клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте пробирку при 300 × г в течение 3 мин при комнатной температуре. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в полной среде. Высевают фибробласты в чашку для культивирования клеток диаметром 9 см и инкубируют при температуре 37 °C в инкубаторе с содержанием 5%_CO2 .

5. Обслуживание и консервация

1. Примерно через 3-4 дня, когда фибробласты вырастут до 80% слияния, повторите шаги 4.2-4.4 и проведите фибробласты в соотношении 1:3. Используйте пассированные фибробласты для дальнейших экспериментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование фибробластов следует прекратить после 10 пассажей, потому что клетки могут начать проявлять измененные характеристики по сравнению с исходными клетками.
2. Криоконсервировать пассажированные клетки Р1-Р3 в жидком азоте для дальнейшего использования.
   1. Повторите шаги 4.2-4.3. Переложите клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте пробирку в течение 3 мин при 300 × г. Тщательно выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды для замораживания клеток, содержащей 90% FBS и 10% DMSO, и перенесите суспензию в клеточные криопробирки.
   2. Переместите клетки в морозильную камеру, а затем поместите замороженную коробку в морозильную камеру с температурой −80 °C. Через 1 сутки переведите клетки в жидкий азот для длительного сохранения.

6. Идентификация фибробластов методом иммунофлуоресцентного окрашивания

1. Поместите круглые покровные стекла в 24-луночный планшет и культивируйте пассированные фибробласты в концентрации 1 × 10⁴ клеток/лунку. Когда фибробласты достигнут 60% слияния, питательную среду удаляют. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида, чтобы зафиксировать фибробласты в течение 20 минут при комнатной температуре, и промойте 3 раза PBS в течение 1 минуты каждый раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте количество клеток с помощью предметного стекла гемоцитометра под микроскопом или автоматического счетчика клеток.
2. Удалите PBS, инкубируйте с 0,5% Triton X-100 в течение 20 мин для пермеабилизации клеточных мембран, а затем промывают 3 раза PBS в течение 1 мин каждый раз. Добавьте PBS с 0,5% бычьим сывороточным альбумином и выдержите 30 минут. Затем удалите его и добавьте антитело PDGFR-α/vimentin, разведенное в разбавителе антител в соотношении 1:1000. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
3. На следующий день удалите первичное антитело, промойте клетки 3 раза PBS в течение 3 мин и добавьте вторичное антитело Alexa Fluor-555 козий антикроличий IgG, разбавленное разбавителем антител в соотношении 1:200, для замачивания в течение 1 ч.
4. Удалите вторичное антитело и промойте клетки 3 раза PBS. Вынимают круглые покровные стекла с помощью щипцов, надевают их на предметные стекла и добавляют 50 мкл раствора 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) 50 мкл 5 мкг/мл для окрашивания клеточных ядер. Храните образцы во влажной темной коробке и наблюдайте за ними под лазерным конфокальным флуоресцентным микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте отрицательную контрольную группу без первичного антитела, но с вторичным антителом, чтобы исключить неспецифическое окрашивание.

7. Идентификация фибробластов методом проточной цитометрии

1. Соберите клеточную гранулу в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и ресуспендируйте 50 мкл PBS, содержащего 1% FBS. Инкубируют с анти-CD90 в течение 30 мин в темноте и добавляют контроль изотипа анти-IgG в контрольную группу. Затем добавляют 200 мкл PBS, содержащего 1% FBS, и центрифугируют пробирку в течение 10 мин при 300 × g при 4 °C.
2. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 200 мкл PBS, содержащего 1% FBS. Ресуспендировать и отфильтровать суспензию через сетчатый фильтр (70 меш). Добавьте к фильтрату исходный раствор DAPI в концентрации 5 мкг/мл в соотношении 1:100, а затем получите результаты методом проточной цитометрии. Установите прямое рассеяние (FSC) в качестве абсциссы и боковое рассеяние (SSC) в качестве ординаты и обведите основную популяцию клеток. Выберите популяцию клеток и установите фикоэритрин в качестве абсциссы и количество в качестве ординаты для анализа.

Временная шкала протокола представлена на рисунке 1A. Некоторые репрезентативные изображения процесса изоляции показаны на рисунке 2; эпидермис и жировые слои осторожно удаляли, а слой дермы разделяли на мелкие фрагменты по 3-4^мм2, которые засевали в чашки Петри.

Как показано на рисунке 3А, через 5 суток после обработки под микроскопом наблюдалось несколько фибробластов кусочков ткани. Как показано на рисунке 3B, фибробласты показали высокую скорость пролиферации и достигли высокого уровня слияния через 10 дней. Эти фибробласты имели удлиненные, веретенообразные клеточные тела и выстраивались в пучки, когда достигали высокого уровня слияния. Следуя этому протоколу, фибробласты пассировали и расширили до желаемого количества в течение 2-3 недель.

Для верификации идентичности и чистоты фибробластов был использован иммунофлуоресцентный анализ окрашивания для выявления фибробласт-специфичных маркеров PDGFRα¹⁰ и виментина. Как и ожидалось, на рисунках 4A и 4C видно, что все фибробласты были положительно окрашены антителом PDGFRα/vimentin, с красной иммунофлуоресценцией и синей иммунофлуоресценцией в клеточном ядре. Как показано на рисунке 4C, анализ проточной цитометрии также показал положительный результат CD90 почти во всех фибробластах.

Рисунок 1: Обзор процедуры выделения и культивирования келоидных фибробластов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные изображения выделения и культивирования фибробластов из келоидных тканей . (А) Вымойте салфетку. (Б) Удалите эпидермис и жировые слои. (C) Рассеките дерму на 3-4 мм³ части и снова промойте PBS. (D) Поместите фрагменты ткани в чашку Петри. (E) Поместите чашки Петри вверх дном в инкубатор с 5%_СО2 при температуре 37 °C на 30-60 минут, чтобы кусочки ткани немного подсохли и прилипли к чашке Петри. (F) Добавьте полную питательную среду в чашку Петри и культуру в клеточный инкубатор, содержащий_СО2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные изображения выростов фибробластов из кусочков келоидной ткани. (A) Вырастание фибробластов из кусочков ткани через ~5 дней. (B) Фибробласты достигли высокого уровня слияния через ~10 дней. Масштабные линейки = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Идентификация высокоочищенных фибробластов методом иммунофлуоресцентного окрашивания и проточной цитометрии. (А) Иммунофлуоресцентное окрашивание фибробластов анти-PDGFRα. (B) Отрицательная контрольная группа без первичного антитела к PDGFRα. (C) Иммунофлуоресцентное окрашивание фибробластов антивиментином. (D) Отрицательная контрольная группа без первичного антитела к виментину. (E) Анализ фибробластов методом проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Получение первичных фибробластов из келоидных тканей является важнейшей основой для дальнейших исследований. До сих пор существовало два метода получения первичных фибробластов: ферментное расщепление и эксплант-культура^11,12,13,14. Однако оба традиционных метода имеют ограничения, такие как восприимчивость к контаминации, смешивание с другими типами клеток, длительный период культивирования и низкая вероятность успеха^15,16. В этом исследовании описан оптимизированный метод и даны четкие инструкции для решения этих существующих проблем и увеличения шансов на успех в выделении и культивировании келоидных фибробластов.

Возможность микробной контаминации является одной из основных проблем при получении первичных фибробластов. Все оборудование и растворы должны быть стерилизованы, а стандартные асептические методы должны быть внедрены на всех этапах протокола. Протокол содержит напоминания о необходимости оставаться асептическими, чтобы снизить риск заражения. Первым критическим шагом является процесс изоляции; Целью замачивания тканей в PBS с добавлением 1% PSA и нескольких промывок является удаление существующих микробов и остаточных пятен крови. Чтобы предотвратить возможную передачу загрязнения, следует подготовить дополнительную пару стерилизованных ножниц и щипцов; Эти инструменты могут быть заменены на неиспользуемые в следующей операции. Кроме того, в питательную среду добавляют ПСА для предотвращения размножения микробов. Периодическое тестирование на микоплазму во время выделения и последующего культивирования келоидных фибробластов должно быть включено в протокол. Благодаря этим процессам можно значительно снизить вероятность микробного загрязнения.

Другой проблемой является смешивание с другими типами клеток, такими как кератиноциты. Этот тип клеток также обладает интенсивной пролиферативной способностью, что затрудняет их удаление. Чистота фибробластов сильно зависит от процесса выделения; Эпидермис и жировые слои должны быть полностью удалены, чтобы избежать смешивания с другими клетками. PDGFR-α является фибробласт-специфическим маркером, который экспрессируется в мембране и цитоплазме фибробластов^10,17,18. CD90 и виментин также являются специфическими мезенхимальными маркерами, которые специфически экспрессируются в мембранах фибробластов 19,20,21. Иммунофлуоресцентный анализ в этой работе показал, что все клетки положительно экспрессируют PDGFR-α и виментин. Анализ проточной цитометрии также непосредственно продемонстрировал CD90-положительность почти во всех фибробластах и более высокую CD90-положительность по сравнению с изотипным контролем, тем самым подтвердив, что мы получили фибробласты относительно высокой чистоты с использованием этого протокола.

Основные рекомендуемые шаги по стимулированию роста и повышению пролиферативной эффективности фибробластов заключаются в следующем. Во-первых, кусочки ткани должны быть нарезаны на соответствующие размеры 3-5^мм2, так как более мелкие кусочки ткани с большей вероятностью всплывут во время движения чашки Петри, и клетки не будут легко перерастать более крупные куски. Во-вторых, первая смена среды должна быть после третьего дня, так как кусочкам ткани требуется время, чтобы прилипнуть к чашкам Петри. Слишком раннее перемещение чашек Петри, как правило, нарушает ткани и снижает вероятность роста фибробластов. В-третьих, все шаги в этом протоколе должны выполняться аккуратно; Неправильное обращение приведет к ненужному перемещению кусочков ткани и ухудшению роста клеток.

Фибробласты представляют собой морфологически и функционально гетерогенную клеточную популяцию, которую можно разделить на несколько субпопуляций. Одним из ограничений этого исследования является то, что мы можем получить общие фибробласты из всей келоидной ткани, но не из различных субпопуляций фибробластов. Мы пытаемся найти лучшие методы решения этой проблемы в будущем.

Как показали наши предыдущие исследования с помощью РНК-секвенирования, существует много различий между келоидными фибробластами и нормальными фибробластами. Келоидные фибробласты вырабатывают больше коллагена I и коллагена III. Кроме того, келоидные фибробласты экспрессируют специфические маркеры, такие как POSTN, среди прочих. После пассажа фибробласты все еще сохраняют эти характеристики, что доказывает, что первичные фибробласты также могут проявлять некоторые особенности, обнаруженные у келоидных пациентов.

В заключение, это исследование предлагает оптимизированный метод и дает четкие инструкции для решения существующих трудностей в экстракции келоидных фибробластов, таких как микробное загрязнение, смешивание с другими типами клеток и длительный период культивирования, а также для увеличения шансов на успех. В настоящее время в работе представлен простой и воспроизводимый метод выделения и культивирования первичных фибробластов келоидного типа, который обеспечит богатый ресурс для будущих исследований или может быть заморожен в жидком азоте для хранения.

Конфликт интересов, о котором можно было бы заявлять, отсутствует.

Работа выполнена при поддержке грантов Национального фонда естественных наук Китая (гранты No 81903189 и 82073418) и Научно-технического фонда Гуанчжоу (грант No 202102020025).