Анализ хлорорганических пестицидов в образце почвы модифицированным подходом QuEChERS с использованием формиата аммония

Настоящий протокол описывает использование формиата аммония для фазового разделения в QuEChERS вместе с газовой хроматографией-масс-спектрометрией для успешного определения остатков хлорорганических пестицидов в образце почвы.

В настоящее время метод QuEChERS представляет собой наиболее широко используемый протокол пробоподготовки во всем мире для анализа остатков пестицидов в широком спектре матриц как в официальных, так и в неофициальных лабораториях. Метод QuEChERS с использованием формиата аммония ранее оказался выгодным по сравнению с оригинальной и двумя официальными версиями. С одной стороны, простого добавления 0,5 г формиата аммония на грамм образца достаточно для индуцирования разделения фаз и достижения хороших аналитических показателей. С другой стороны, формиат аммония снижает потребность в техническом обслуживании в рутинных анализах. Здесь был применен модифицированный метод QuEChERS с использованием формиата аммония для одновременного анализа остатков хлорорганических пестицидов (OCP) в сельскохозяйственных почвах. В частности, 10 г образца гидратировали 10 мл воды, а затем экстрагировали 10 мл ацетонитрила. Далее фазовое разделение проводили с использованием 5 г формиата аммония. После центрифугирования супернатант подвергали дисперсионной твердофазной стадии очистки экстракции безводным сульфатом магния, первичным вторичным амином и октадецилсилананом. В качестве аналитического метода использовалась газовая хроматография-масс-спектрометрия. Метод QuEChERS с использованием формиата аммония демонстрируется в качестве успешной альтернативы для извлечения остатков OCP из образца почвы.

Необходимость увеличения производства продуктов питания привела к интенсивному и широкому использованию пестицидов во всем мире в течение последних нескольких десятилетий. Пестициды применяются к сельскохозяйственным культурам для защиты их от вредителей и повышения урожайности, но их остатки обычно попадают в почвенную среду, особенно в сельскохозяйственных районах¹. Кроме того, некоторые пестициды, такие как хлорорганические пестициды (OCP), имеют очень стабильную структуру, поэтому их остатки не разлагаются легко и сохраняются в почве в течение длительного времени². Как правило, почва обладает высокой способностью накапливать остатки пестицидов, особенно когда она имеет высокое содержание органического вещества³. В результате почва является одним из экологических отсеков, наиболее загрязненных остатками пестицидов. Например, одно из полных исследований на сегодняшний день показало, что 83% из 317 сельскохозяйственных почв со всего Европейского Союза были загрязнены одним или несколькими остатками пестицидов⁴.

Загрязнение почвы остатками пестицидов может повлиять на нецелевые виды, функцию почвы и здоровье потребителей через пищевую цепь из-за высокой токсичности остатков ^5,6. Следовательно, оценка остатков пестицидов в почвах имеет важное значение для оценки их потенциального негативного воздействия на окружающую среду и здоровье человека, особенно в развивающихся странах из-за отсутствия строгих правил использования пестицидов⁷. Это делает анализ пестицидов с несколькими остатками все более важным. Однако быстрый и точный анализ остатков пестицидов в почвах является сложной задачей из-за большого количества мешающих веществ, а также низкого уровня концентрации и разнообразных физико-химических свойств этих аналитов⁴.

Из всех методов анализа остатков пестицидов метод QuEChERS стал самым быстрым, простым, дешевым, эффективным, надежным и безопасным вариантом⁸. Метод QuEChERS состоит из двух этапов. На первом этапе выполняется микромасштабная экстракция, основанная на разделении путем засолки между водным и ацетонитрильным слоем. На втором этапе осуществляется процесс очистки с использованием дисперсионной твердофазной экстракции (dSPE); этот метод использует небольшие количества нескольких комбинаций пористых сорбентов для удаления матричных мешающих компонентов и преодолевает недостатки обычного SPE⁹. Следовательно, QuEChERS является экологически чистым подходом с небольшим количеством растворителей / химических веществ, поступающих в отходы, который обеспечивает очень точные результаты и сводит к минимуму потенциальные источники случайных и систематических ошибок. Фактически, он был успешно применен для высокопроизводительного рутинного анализа сотен пестицидов, с сильным применением почти во всех типах экологических, агропищевых и биологических образцов ^8,10. Эта работа направлена на применение и проверку новой модификации метода QuEChERS, который был ранее разработан и связан с GC-MS для анализа OCP в сельскохозяйственных почвах.

1. Подготовка стоковых решений

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется носить нитриловые перчатки, лабораторный халат и защитные очки в течение всего протокола.

1. Приготовьте стандартный раствор в ацетоне по 400 мг/л из коммерческой смеси OCP (см. Таблицу материалов) по 2000 мг/л в гексане:толуоле (1:1) в объемной колбе объемом 25 мл. В таблице 1 показаны все выбранные OCP.
2. Последующие исходные растворы готовят в ацетоне в концентрациях 50 мг/л, 1 мг/л и 0,08 мг/л в объемных колбах по 10 мл и хранят их во флаконах из янтарного стекла при −18 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одни и те же решения могут использоваться на протяжении всей работы, но важно хранить их в этих условиях сразу после каждого использования.
3. Готовят исходные растворы в ацетоне в концентрациях 20 мг/л и 0,4 мг/л из коммерческого стандарта 4,4'-DDE-d8 при 100 мг/л в ацетоне в объемных колбах по 10 мл и хранят во флаконах из янтарного стекла при −18 °C. Используйте 4,4'-DDE-d8 в качестве внутреннего стандарта (IS).

2. Сбор образцов

1. Соберите примерно 0,5 кг верхнего 10-сантиметрового слоя сельскохозяйственной почвы в стеклянную емкость. Почвенный объект данного исследования был собран в традиционной сельскохозяйственной зоне посевов картофеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Был проведен отбор проб поверхности шпателем. Однако глубина почвы могла влиять на ее физико-химические характеристики. Поэтому, если содержание органического углерода меняется с глубиной, необходимо брать пробы на разных глубинах.
2. Возьмите образец почвы в лабораторию, просейте его ситом диаметром 1 мм и храните до анализа при 4 °C в янтарном стеклянном контейнере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один и тот же образец почвы может быть использован на протяжении всей работы, но важно хранить его в этих условиях сразу после каждого использования.

3. Пробоподготовка модифицированным методом QuEChERS с использованием формиата аммония

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показано схематическое представление модифицированного метода QuEChERS.

1. Взвесьте 10 г образца почвы в центрифужной пробирке объемом 50 мл и добавьте 50 мкл раствора ИС при 20 мг/л для получения 100 мкг/кг. Для целей рекуперации также добавляют растворы пестицидов, приготовленные на стадии 1.2, чтобы получить 10 мкг/кг, 50 мкг/кг и 200 мкг/кг (n = 3 каждый).
2. Встряхните трубку с помощью вихря в течение 30 с, чтобы лучше интегрировать шип в образец.
3. Добавьте 10 мл воды. Встряхните трубку с помощью автоматического шейкера при 10 х г в течение 5 мин.
4. Добавьте 10 мл ацетонитрила. Снова встряхните пробирку по 10 х г в течение 5 мин.
5. Добавьте 5 г формиата аммония (см. Таблицу материалов), энергично встряхните трубку в течение 1 мин вручную и центрифугу при 1 800 х г в течение 5 мин.
6. Переложить 1 мл экстракта ацетонитрила в центрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую 150 мг безводного MgSO₄, 50 мг первично-вторичного амина (ПСА) и 50 мг октадецилсилана (_С18) (см. Таблицу материалов) для целей очистки путем дисперсионно-твердофазной экстракции (d-SPE)⁸, вихря в течение 30 с и центрифуги при 1 800 х г в течение 5 мин.
7. Перенесите 200 мкл экстракта в надлежащим образом маркированный флакон автосамплера с расплавленной вставкой объемом 300 мкл и выполните инструментальный анализ с использованием системы GC-MS (этап 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Матричную калибровку проводят на тех же этапах, что и ранее с использованием пустых экстрактов, но 5 мл супернатанта очищают в пробирках по 15 мл на стадии d-SPE (стадия 3.6), и шип и растворы IS не добавляют до стадии 3.7. Добавьте калибровочные стандартные растворы во флаконы автопробоотборника для получения 5 мкг/кг, 10 мкг/кг, 50 мкг/кг, 100 мкг/кг, 200 мкг/кг и 400 мкг/кг, испаритесь до сухости и добавьте 200 мкл экстрактов матрицы.

4. Инструментальный анализ по ГК-МС

1. Выполнение анализа GC-MS с использованием системы GC-MS с одним квадрупольным масс-спектрометром и интерфейсом электронной ионизации (−70 эВ) (см. Таблицу материалов).
2. Установите линию передачи MS при 280 °C и источник ионов при 230 °C.
3. Используйте 5%-фенил-метилполисилоксан 30 м x 250 мкм x 0,25 мкм колонку (см. Таблицу материалов) и сверхвысокой чистоты He в качестве газа-носителя при постоянном расходе 1,2 мл/мин.
4. Сначала выдерживайте духовку GC при температуре 60 °C в течение 2 мин, затем увеличьте температуру до 160 °C при 25 °C/мин и подержите в течение 1 минуты. Затем увеличьте температуру до 175 °C при 15 °C/мин и подержите в течение 3 минут. Затем увеличьте до 220 °C при 40 °C/мин и подержите в течение 3 минут. Снова увеличьте до 250 °C при 30 °C/мин и подержите в течение 2 минут. Наконец, доведите температуру до 310 °C при 30 °C/мин и подержите в течение 2 минут. Общее время анализа составляет 22.125 мин.
5. Проведите полную автонастройку и проверку воздуха и воды MS перед каждой последовательностью.
   1. Откройте программу сбора MassHunter, которая контролирует все параметры системы GC-MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приборная система по умолчанию включает в себя программное обеспечение для сбора MassHunter.
   2. Откройте опцию «Просмотр» на панели инструментов и нажмите « Управление вакуумом», нажмите « Настроить» и нажмите « Автонастройка». Автонастройка завершится через несколько минут.
   3. Откройте опцию «Вид» и нажмите « Управление приборами».
   4. Нажмите кнопку Да и сохраните новый файл настроек для автонастройки.
   5. Откройте опцию «Вид» на панели инструментов и нажмите « Управление вакуумом», снова нажмите « Настроить » и нажмите « Проверка воздуха и воды». Проверка воздуха и воды закончится через несколько секунд.
   6. Откройте опцию «Вид» и нажмите « Управление приборами».
   7. Нажмите «Да» и сохраните новый файл настроек для проверки воздуха и воды.
6. Выполняйте впрыск с помощью автопробоотборника (см. Таблицу материалов) при 280 °C в сплит-режиме, сохраняя объем впрыска 1,5 мкл. После 0,75 мин впрыска откройте сплит со скоростью потока 40 мл/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Между инъекциями шприц объемом 10 мкл необходимо промыть три раза этилацетатом и три раза циклогексаном. Все инъекции делаются в двух экземплярах.
7. Анализ анализируемых веществ в выбранном режиме мониторинга ионов (SIM). Это стандартный режим, используемый в системах MS с одним квадруполем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 показано время удержания (мин) и параметры количественной оценки, основанные на использовании одного количественного определения и двух идентификационных ионов для OCP и IS. Количественный анализ основан на соотношении пиковой площади иона количественного определения к иону ИС.

5. Сбор данных

1. Откройте программу сбора MassHunter, которая контролирует все параметры системы GC-MS.
2. Откройте параметр «Последовательность» на панели инструментов и отредактируйте последовательность, включая имя образца, номер флакона, количество инъекций, инструментальный метод и имя создаваемого файла. Добавьте столько строк, сколько необходимо.
3. Нажмите кнопку ОК и сохраните новую последовательность.
4. Снова откройте опцию «Последовательность» на панели инструментов и нажмите «Запустить последовательность» в раскрывающемся меню. Откроется новое окно для подтверждения метода внедрения и папки, в которой будут сохранены образцы. Нажмите кнопку Запустить последовательность еще раз, и начнется инъекция.

Полная валидация аналитического метода была выполнена с точки зрения линейности, матричных эффектов, восстановления и повторяемости.

Для оценки линейности использовались матричные калибровочные кривые с шипованными пустыми образцами при шести уровнях концентрации (5 мкг/кг, 10 мкг/кг, 50 мкг/кг, 100 мкг/кг, 200 мкг/кг и 400 мкг/кг). Коэффициенты определения (^R2) были выше или равны 0,99 для всех OCP. Самый низкий калибровочный уровень (LCL) был установлен на уровне 5 мкг/кг, что соответствует максимально допустимому пределу, установленному на уровне 10 мкг/кг для целей мониторинга в пищевых применениях¹¹.

Оценка матричного эффекта проводилась путем сравнения наклонов калибровочных кривых OCP в чистом растворителе и матричных калибровочных кривых. Матричный эффект был рассчитан с использованием следующего уравнения¹²:

Матричный эффект (%) = (наклон калибровочной кривой с матричным соответствием − наклон калибровочной кривой на основе чистого растворителя)/(наклон калибровочной кривой на основе чистого растворителя) × 100.

На рисунке 2 показано распределение матричного эффекта для OCP, изученных путем применения модифицированного метода QuEChERS с использованием формиата аммония к образцам почвы. Процент положительного матричного эффекта соответствует усилению сигнала, в то время как отрицательный процент означает, что происходит подавление сигнала. В частности, (1) значения в диапазоне от −20% до 20% соответствуют эффекту мягкой матрицы; (2) значения в диапазоне от −20% до -50% или от 20% до 50% соответствуют среднему матричному эффекту; (3) и значения выше 50% или ниже −50% означают, что существует сильный матричный эффект. Как было отмечено, больше OCP страдали от мягких или средних матричных эффектов, в то время как меньше OCP страдали от сильных матричных эффектов.

Рекуперацию и повторяемость оценивали путем проб с пестицидами с тремя уровнями концентрации (10 мкг/кг, 50 мкг/кг и 200 мкг/кг). На рисунке 3 показаны общие значения извлечения и значения относительного стандартного отклонения (RSD) для всех пестицидов и уровней всплеска (n = 9). Как можно наблюдать, подавляющее большинство изученных OCP представили средние проценты извлечения в диапазоне 70-120%, при этом RSD ниже 20%, за исключением гептахлора, эндрина и β-эндосульфана, которые дали несколько более высокие средние извлечения.

Рисунок 1: Представление модифицированного метода QuEChERS с использованием формиата аммония для извлечения остатков пестицидов из образца почвы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Распределение матричных эффектов по времени удержания (мин) для 17 OCP. Эффект мягкой матрицы соответствует значениям от −20% до 20%; матричный эффект среды соответствует значениям в диапазоне от −20% до −50% или от 20% до 50%; сильный матричный эффект соответствует значениям, превышающим 50% или менее −50%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Среднее извлечение для 17 OCP после скачков 10 мкг/кг, 50 мкг/кг и 200 мкг/кг (n = 9) в образце почвы. Количество аналитов в пределах допустимого диапазона извлечения (70%-120%) и RSD (<20%) наряду с теми, которые помечены за пределами этого диапазона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Время удержания (мин) и количественные параметры для анализа GC-MS OCP. Альфа-бензолгексахлорид (α-BHC); бета-бензолгексахлорид (β-BHC); Линдан; дельта-бензолгексахлорид (δ-БХК); Гептахлор; альдрин; эпоксид гептахлора; α-эндосульфан; 4,4'-дихлордифенилдихлорэтилен-d8 (4,4'-DDE-d8) (IS); 4,4'-дихлордифенилдихлорэтилен (4,4'-ДДЭ); Дильдрин; Эндрин; β-эндосульфан; 4,4'-дихлордифенилдихлорэтан (4,4'-DDD); эндосульфана сульфат; 4,4'-дихлордифенилтрихлорэтан (4,4'-ДДТ); эндрин кетон; метоксихлор.

Оригинальная^{версия 9} и две официальные версии^13,14 метода QuEChERS используют сульфат магния вместе с солями хлорида натрия, ацетата или цитрата для содействия разделению смеси ацетонитрила и воды во время экстракции. Однако эти соли, как правило, осаждаются в виде твердых тел на поверхностях в источнике масс-спектрометрии (МС), что вызывает необходимость в усилении поддержки методов жидкостной хроматографии (LC)-MS. Что касается преодоления этих недостатков, González-Curbelo et ^al.15 сообщили, что более летучий формиат аммония хорошо индуцирует разделение фаз и извлечение остатков пестицидов как для LC-, так и для GC-тандемной масс-спектрометрии (MS/MS). В последующих исследованиях также использовалось 0,5 г формиата аммония на грамм образца для извлечения остатков пестицидов из различных комплексных матриц 16,17,18,19. Кроме того, было показано, что использование формиата аммония обеспечивает более низкие количества совместно экстрагированного материала²⁰, что оправдывает его использование для методов, основанных на GC-MS. В настоящем исследовании впервые сообщается об этой версии для анализа остатков пестицидов в почвах²¹.

Анализ GC остатков пестицидов в сложных матрицах, таких как почвы, имеет некоторые ограничения из-за действия совместно экстрагированных компонентов матрицы на инструментальную реакцию пестицидов, что вызывает неточное определение и более низкую чувствительность^22,23. Таким образом, был внесен ряд улучшений для минимизации эффекта матрицы, включая оптимизированные этапы очистки²¹. Тем не менее, матричный эффект все же имеет место и должен быть максимально скорректирован. В этом смысле матричная калибровка была основным используемым подходом, поскольку она очень практична для компенсации усиления хроматографического сигнала по сравнению с чистыми растворителями²⁴. Таким образом, в данном исследовании линейность оценивали путем построения калибровочных кривых в чистом ацетонитриле и с использованием почвенных экстрактов, а значения^R2 выше или равны 0,99 для всех OCP были получены с использованием обоих подходов. Однако при сравнении обеих калибровочных кривых были обнаружены заметные матричные эффекты в диапазоне от –49% до 191% (рисунок 2). Хотя количество пестицидов, которые пострадали от сильного матричного эффекта, составляло всего 3 из 17 (эндрин, эндрин кетон и метоксихлор), последующие исследования проводились с использованием матричных калибровочных кривых для компенсации матричных эффектов в большей степени.

Максимальные предельные значения остатков (МДОУ) не были установлены для остатков пестицидов в почвах, но для всех OCP был установлен LCL в размере 5 мкг/кг, что ниже очень требовательного стандарта MRL, установленного на уровне 10 мкг/кг международным законодательством для анализа остатков пестицидов в агропродовольственных продуктах (Постановление 396/2005)¹¹. Кроме того, LCL 5 мкг/кг обеспечивал отношение сигнал/шум (S/N) около 10 для всех OCP. Высокая чувствительность этого метода аналогична или даже лучше, чем у других исследований, которые также анализировали OCP в почвах с использованием метода QuEChERS, за которым следует GC-MS. Например, в одном исследовании 34 OCP были проанализированы с использованием официальной версии метода QuEChERS, использующего цитратный буфер, а пределы количественной оценки (LOQ) были равны или выше 7 мкг/кг²⁵. В частности, значения LOQ α-BHC, β-BHC, линдана и δ-BHC составляли от 206 мкг/кг до 384 мкг/кг. В другой работе линдан и дильдрин были проанализированы с использованием той же версии метода QuEChERS, и были получены значения LOQ 42 мкг/кг и 292 мкг/кг, соответственно²⁶. Аналогичным образом, другая исследовательская работа также определила альдрин и гептахлор с использованием QuEChERS и GC-MS со значениями LOQ 13 и 23 мкг / кг соответственно²⁷.

Оценка восстановления и воспроизводимости была разработана на трех уровнях концентрации (низкий, средний и высокий) в трех экземплярах (n = 9). С этой целью общие значения извлечения были определены путем сравнения пиковых площадей пестицидов/IS (4,4'-DDE-d8), полученных из образцов почвы, полученных в начале применения метода QuEChERS с использованием формиата аммония с матричной калибровкой. Во всех случаях каждая реплика вводилась дважды в одной и той же последовательности. Следует отметить, что использование ИС, изотопно меченого стандарта, позволяет компенсировать возможные потери пестицидов, которые имеют место в течение всей процедуры, а также матричный эффект и/или возможную изменчивость в приборе. Согласно результатам, большинство пестицидов соответствовали критериям приемлемости 70%-120% значений извлечения с RSD ≤20% на каждом пиковом уровне²⁸, что продемонстрировало эффективность и повторяемость метода. Тем не менее, общие значения извлечения (n = 9) были несколько выше 120% для гептахлора (122%), эндрина (121%) и β-эндосульфана (130%), хотя они были последовательными (RSDs <13%). В этом смысле, учитывая общие значения восстановления на трех пиковых уровнях, установлен критерий приемлемости 30-140% со значениями RSD ≤20%²⁸.

В заключение, метод QuEChERS с использованием формиата аммония в сочетании с GC-MS может успешно определять OCP в образцах сельскохозяйственной почвы. В этом исследовании было показано, что простое добавление 5 г формиата аммония для индуцирования разделения фаз между слоями воды и ацетонитрила обеспечивает подходящую экстракцию с высоким извлечением выбранных пестицидов. Тем не менее, матричный эффект продолжал иметь место, поэтому другие подходы, такие как добавление анализируемых протекторов, должны быть изучены в последующих работах. В любом случае, эта альтернатива официальным версиям QuEChERS может быть использована для предотвращения нежелательных твердых веществ, осажденных в аналитической системе из-за использования солей магния и натрия, особенно в рутинном анализе на основе LC-MS. В последнем случае это было бы еще более интересно, поскольку формиат аммония является вспомогательным средством для ионизации при положительной электрораспылительной ионизации и может усиливать образование аддуктов аммония вместо аддуктов натрия.

У меня нет конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Я хотел бы поблагодарить Хавьера Эрнандеса-Борхеса и Сесилию Ортегу-Самору за их неоценимую поддержку. Я также хочу поблагодарить Universidad EAN и Universidad de La Laguna.