Количественная оценка гистонов на глобальном уровне посттрансляционных модификаций в 3D-модели клеточной культуры печеночной ткани

Этот протокол описывает, как трехмерная система клеточных культур может быть использована для моделирования, обработки и анализа модификаций хроматина в почти физиологическом состоянии.

Плоские культуры клеток млекопитающих являются широко используемым подходом in vitro для понимания физиологии клеток, но эта система ограничена в моделировании твердых тканей из-за неестественно быстрой репликации клеток. Это особенно сложно при моделировании зрелого хроматина, поскольку быстро реплицирующиеся клетки часто участвуют в репликации ДНК и имеют гетерогенную полиплоидную популяцию. Ниже представлен рабочий процесс для моделирования, обработки и анализа модификаций покоящегося хроматина с использованием трехмерной (3D) системы клеточных культур. Используя этот протокол, клеточные линии гепатоцеллюлярной карциномы выращиваются в виде воспроизводимых 3D-сфероидов в инкубаторе, обеспечивающих активную диффузию питательных веществ и низкие силы сдвига. Лечение бутиратом натрия и сукцинатом натрия индуцировало увеличение ацетилирования гистонов и сукцинилирования соответственно. Повышение уровней ацетилирования гистонов и сукцинилирования связано с более открытым состоянием хроматина. Сфероиды затем собираются для выделения клеточных ядер, из которых извлекаются гистоновые белки для анализа их посттрансляционных модификаций. Анализ гистонов выполняется с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией, за которой следует собственный вычислительный конвейер. Наконец, приведены примеры представления данных для исследования частоты и возникновения комбинаторных гистоновых меток.

С конца 19^века системы клеточных культур использовались в качестве модели для изучения роста и развития клеток вне человеческого организма ^1,2. Их использование также было расширено для изучения того, как ткани и органы функционируют как в здоровом, так и в больном контексте ^1,3. Суспензионные клетки (например, клетки крови) растут в чашках или колбах Петри плавно и взаимозаменяемо, поскольку они не собираются в трехмерные (3D) структуры in vivo. Клетки, полученные из твердых органов, могут расти как в двумерных (2D), так и в 3D-системах культур. В 2D культуре клетки выращиваются в монослое, который прилипает к плоской поверхности ^2,4. Системы 2D-культур клеток характеризуются экспоненциальным ростом и быстрым временем удвоения, обычно от 24 ч до нескольких дней⁵. Клетки в 3D-системах растут, образуя сложные клеточные взаимодействия, моделирующие тканеподобные конгломераты более тесно, и они характеризуются своей способностью достигать динамического равновесия, где их время удвоения может достигать 1 месяца или дольше⁵.

В этой статье представлена инновационная методология выращивания 3D-сфероидов во вращающихся системах клеточных культур, которые имитируют пониженную гравитацию⁶. Это упрощенная производная системы клеточных культур, введенная НАСА в 1990-х^{годах 7}. Этот подход сводит к минимуму силы сдвига, которые возникают в существующих методах, таких как вращающиеся колбы, и увеличивает сфероидную воспроизводимость⁶. Кроме того, вращающийся биореактор увеличивает активную диффузию питательных веществ, сводя к минимуму некротическое образование, которое происходит в таких системах, как висячая культура капельных клеток, где обмен средой непрактичен⁶. Таким образом, клетки растут в основном без помех, что позволяет формировать структурные и физиологические характеристики, связанные с клетками, растущими в ткани. Гепатоциты C3A (HepG2/C3A), культивируемые таким образом, не только имели ультраструктурные органеллы, но и продуцировали количества АТФ, аденилаткиназы, мочевины и холестерина, сопоставимые с уровнями, наблюдаемыми in vivo ^1,2. Кроме того, клетки, выращенные в системах 2D и .3D клеточных культур, демонстрируют различные паттерны экспрессии генов⁸. Анализ экспрессии генов гепатоцитов C3A, выращенных в виде 3D-сфероидов, показал, что эти клетки экспрессируют широкий спектр специфических для печени белков, а также генов, участвующих в ключевых путях, которые регулируют функцию печени⁸. Предыдущие публикации продемонстрировали различия между протеомами экспоненциально растущих клеток в 2D-культуре и клетками в динамическом равновесии в 3D-сфероидных культурах⁵. Эти различия включают клеточный метаболизм, который, в свою очередь, влияет на структуру, функцию и физиологию клетки⁵. Протеом клеток, выращенных в 2D-культуре, был более обогащен белками, участвующими в репликации клеток, в то время как протеом 3D-сфероидов был более обогащен функциональностью печени⁵.

Более медленная скорость репликации клеток, выращенных в виде 3D-сфероидов, более точно моделирует конкретные явления, связанные с состоянием хроматина и модификациями (например, отсечение гистонов⁹). Гистоновое обрезание является необратимой посттрансляционной модификацией гистона (PTM), которая вызывает протеолитическое расщепление части N-концевого хвоста гистона. Хотя его биологическая функция все еще обсуждается 10,11,12,13, ясно, что его присутствие в первичных клетках и ткани печени моделируется клетками HepG2 / C3A, выращенными как сфероиды, но не как плоские клетки 9. Это имеет решающее значение, поскольку состояние хроматина и его модификации регулируют считывание ДНК в основном путем модуляции доступности генов и, следовательно, их экспрессии¹⁴. Гистоновые ПТМ либо влияют на состояние хроматина напрямую, воздействуя на чистый заряд нуклеосом, где собраны гистоны, либо косвенно, привлекая хроматиновых писателей, читателей и ластиков¹⁴. Сотни гистоновых ПТМ были идентифицированы на сегодняшний день¹⁵, что подтверждает гипотезу о том, что хроматин содержит «гистоновый код», используемый клеткой для интерпретации ДНК¹⁶. Однако идентификация множества комбинаций^{PTM 15} и открытие того, что комбинации гистоновых PTM часто имеют различные биологические функции от PTM, присутствующих изолированно (например, Fischle, et ^al.17), подчеркивает, что для расшифровки «гистонового кода» требуется больше работы.

В настоящее время анализ Гистонового ПТМ основан либо на методах, использующих антитела (например, западные блоты, иммунофлуоресценцию или иммунопреципитацию хроматина с последующим секвенированием [ChIP-seq]), либо масс-спектрометрию (МС). Методы, основанные на антителах, обладают высокой чувствительностью и могут предоставить подробную информацию о общегеномной локализации гистоновых меток, но часто ограничены в изучении редких ПТМ или ПТМ, присутствующих в комбинациях 18,19,20. MS больше подходит для высокопроизводительной и непредвзятой идентификации и количественной оценки одиночных и сосуществующих модификаций белков, в частности гистоновых белков 18,19,20. По этим причинам эта и несколько других лабораторий оптимизировали конвейер MS для анализа гистоновых пептидов (снизу вверх MS), интактных гистоновых хвостов (middle-down MS) и полноразмерных гистоновых белков (сверху вниз MS)21,22,23.

Ниже подробно описан рабочий процесс выращивания сфероидов HepG2 / C3A и подготовки их к анализу гистоновых пептидов (снизу вверх MS) с помощью наножидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (nLC-MS / MS). Выращивали 2D-культуру клеток, и клетки собирали и передавали в биореактор, где они начинали образовывать сфероиды (рисунок 1). После 18 дней в культуре сфероиды обрабатывали бутиратом натрия или сукцинатом натрия для увеличения относительного обилия ацетилирования и сукцинилирования гистонов. Примечательно, что 3D-культуры могут быть обработаны генотоксическими соединениями так же, как и их эквиваленты плоских культур; фактически, последние публикации подчеркивают, что токсикологический ответ клеток в 3D-культуре больше похож на первичные ткани, чем на те, которые находятся в 2D плоской культуре^24,25. Затем клетки собирали в определенные моменты времени и проводили ядерную изоляцию. Затем гистоны экстрагировали и дериватизировали пропионовым ангидридом до и после переваривания трипсина в соответствии с протоколом, впервые разработанным Garcia et ^al.26. Эта процедура генерирует пептиды соответствующего размера для онлайн-разделения с помощью обратнофазной хроматографии (C₁₈) и обнаружения при РС. Наконец, гистоновые пептиды были идентифицированы и количественно определены, а полученные данные были представлены несколькими способами для более полной биологической интерпретации.

1. Подготовка буферов и реагентов

1. Среда роста клеток (для клеток HepG2 / C3A): Добавьте фетальную бычью сыворотку (FBS) (10% v / v), заменимые аминокислоты (1% v / v), добавку L-глутамина (1% v / v) и пенициллин / стрептомицин (0,5% v / v) в модифицированную среду Dulbecco Eagle 's Medium (DMEM, содержащую 4,5 г / л глюкозы). Питательные среды хранят при 4 °C в течение максимум 2 недель.
2. 200 мМ раствор бутирата натрия (NaBut): Для приготовления 10 мл повторно суспендируют 220,18 мг NaBut в 10 мл ddH₂O. Хранить 1 мл аликвоты при -20 °C. Перед обработкой клеток фильтруют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,45 мм и добавляют 1 мл фильтрованного раствора в 9 мл клеточной среды для роста для рабочей концентрации 20 мМ.
3. 100 мМ раствор сукцината натрия (NaSuc): Для приготовления 10 мл повторно суспендировать 162,05 мг NaSuc в 10 мл ddH₂O. Хранить 1 мл аликвоты при -20 °C. Перед обработкой клеток фильтруют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,45 мм и добавляют 1 мл фильтрованного раствора в 9 мл клеточной среды для роста для рабочей концентрации 10 мМ.
4. Холодный 0,2 M H₂SO₄: Для приготовления 1 л добавьте 10 мл концентрированного H₂SO₄ до 990 мл воды класса ВЭЖХ. Хранить при температуре 4 °C.
5. Холодный ацетон + 0,1% соляной кислоты (HCl): Добавьте концентрированный HCl (0,1% v/v) к ацетону. Хранить при температуре 4 °C.
6. 100 мМ NH₄HCO₃ раствор, рН 8,0: Для приготовления 1 л повторно суспендировать 7,91 г NH₄HCO₃ в 1 л воды класса ВЭЖХ. Хранить 50 мл аликвот при -20 °C.
7. 0,1% раствор трифторуксусной кислоты (TFA): Добавьте концентрированный TFA (0,1% v/v) в воду класса HPLC. Хранить при температуре 4 °C.
8. 60% ацетонитрил/0,1% раствор TFA: Добавьте ацетонитрил класса ВЭЖХ (60% v/v) в воду класса HPLC. Затем добавьте к этому раствору концентрированный TFA (0,1% v/v). Хранить при температуре 4 °C.
9. 2% ацетонитрила класса ВЭЖХ + 0,1% муравьиной кислоты: Добавьте ацетонитрил класса ВЭЖХ (2% v/v) в воду класса HPLC. Затем к этому раствору добавляют концентрированную муравьиную кислоту (0,1% v/v).
10. 80% ацетонитрила класса ВЭЖХ + 0,1% муравьиной кислоты: Добавьте ацетонитрил класса ВЭЖХ (80% v/v) в воду класса HPLC. Затем к этому раствору добавляют концентрированную муравьиную кислоту (0,1% v/v).

2. Подготовка системы 3D культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Разные клетки, первичные или увековеченные, обладают разными культуральными свойствами, поэтому образование сфероидов может отличаться в зависимости от типов клеток. Этот протокол был создан для формирования сфероидов HepG2/C3A с использованием биореакторов и инновационной системы 3D-культур клеток.

1. Используя стандартные питательные среды, выращивайте клетки в виде монослоя до тех пор, пока они не станут на 80% сливающимися.
2. Промыть клетки HBSS (5 мл для колбы 75^см2 ) и инкубировать клетки с 5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА, разведенными в HBSS (разведение 1:2) в течение 5 мин при ^37oCс 5% CO₂.
3. Проверьте отслоение клеток под микроскопом и нейтрализуйте трипсин, добавив 3 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) или питательных сред (содержащих 5%-10% FBS).
4. Подсчитайте количество клеток и разбавьте клеточную суспензию до получения 1 х 10⁶ клеток в максимальном объеме 1,5 мл.
5. Уравновешивайте сверхнизкую насадочную 24-луночную круглодонную пластину (содержащую несколько микроскважин на скважину) путем промывки скважин 0,5 мл ростовой среды. Центрифугируйте пластину в течение 5 мин при 3000 х г , чтобы удалить пузырьки воздуха с поверхности скважины.
6. Переложите клеточную суспензию в пластину и центрифугу в течение 3 мин при 120 х г.
7. Инкубируют пластину в течение 24 ч при ^37oCс 5% CO₂ для образования сфероидов. Между тем, уравновешивайте биореактор, заполняя камеру влажности 25 мл стерильной воды, а клеточную камеру 9 мл питательной среды.
8. Инкубируют биореактор, вращающийся в клиностатном инкубаторе, в течение 24 ч при ^37oCс 5% CO₂.

3. Рост сфероидов в биореакторах

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сохранения структуры сфероидов для обработки 3D-структур используются широкие наконечники отверстий.

1. Отделите сфероиды от сверхнизкой крепежной пластины, аккуратно пипеткой вверх и вниз с помощью наконечников отверстия шириной 1 мл и перенесите в посуду, обработанную культурой ткани.
2. Вымойте тарелку 0,5 мл предварительно подогретой питательной среды и переложите в ту же посуду.
3. Оцените качество сфероидов с помощью микроскопии и выберите достаточно сформированные сфероиды. Сфероиды хорошего качества имеют равномерный размер, компактность и округлость.
4. Перенос сфероидов в уравновешенные биореакторы, заполненные 5 мл свежих питательных сред. После переноса сфероидов полностью заполните биореактор свежими питательными средами.
5. Поместите биореактор в инкубатор клиностата и отрегулируйте скорость вращения до 10-11 об/мин.
6. Обменивайтесь питательными средами каждые 2-3 дня, удаляя 10 мл старых носителей и заменяя их 10 мл свежих носителей.
7. Отрегулируйте скорость вращения в соответствии с ростом сфероидов, увеличиваясь по мере увеличения размера и количества сфероидов.
8. После 18 дней в культуре сфероиды готовы к обработке и/или сбору

4. Обработка и сбор сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе сфероиды HepG2/C3A обрабатывают бутиратом натрия (NaBut) и сукцинатом натрия (NaSuc) для оценки уровней гистоновых меток, содержащих ацетилирование и сукцинилирование, соответственно.

1. Готовят питательную среду с соответствующей рабочей концентрацией соединения (например, 20 мМ NaBut или 10 мМ NaSuc). Обмен среды в биореакторе с обработанными средами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы установить контрольное условие, либо соберите достаточно сфероидов для экспериментов перед добавлением обработки, либо назначьте биореактор для необработанных сфероидов.
2. Соберите сфероиды для протеомного анализа после достаточного времени лечения (например, от 48 ч до 1 недели для лечения NaSuc или 48-72 ч для лечения NaBut).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для извлечения гистонов с использованием этого протокола было собрано от шести до восьми сфероидов, содержащих приблизительно 1 х 10⁶ клеток.
   1. Удалите 3-5 мл среды из биореактора через верхний порт.
   2. Откройте передний порт и используйте наконечник отверстия шириной 1 мл, чтобы удалить сфероиды и поместить их в микроцентрифужные трубки.
   3. Центрифугируйте сфероиды при 100 х г в течение 5 мин и отбрасывайте среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда в биореакторе может быть изменена, и биореактор может быть возвращен в инкубатор для дополнительного времени лечения или восстановления.
   4. Промывайте сфероиды 200 мкл HBSS для удаления FBS. Центрифугу при 100 х г в течение 5 мин и удаляют супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды могут храниться при - ^80oCдо обработки.

5. Добыча гистонов

ПРИМЕЧАНИЕ: Многие основные аминокислотные остатки, присутствующие в гистонах, позволяют им тесно взаимодействовать с ДНК, которая имеет основу фосфорной кислоты. Поскольку гистоны являются одними из самых основных белков в ядре, при их извлечении ледяной серной кислотой (0,2 M H₂SO₄) загрязнение минимально. Негистоновые белки будут выпадать в осадок в сильной кислоте. Высококонцентрированная трихлоруксусная кислота (ТЦА), разбавленная до конечной концентрации 33%, используется впоследствии для осаждения гистонов из серной кислоты. Храните все образцы, трубки и реагенты на льду в течение всей добычи гистонов.

1. Добавьте пять объемов (~100 мкл) холодного 0,2 M H₂SO₄ в ячейку гранулы (~10-20 мкл) и пипетку вверх и вниз, чтобы разрушить гранулу и высвободить гистоны.
2. Инкубировать трубки до 4 ч при постоянном вращении или встряхивать при ^4oС.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для повторно суспендированных образцов, которые имеют объем более 500 мкл, инкубации 2 ч достаточно для извлечения гистонов (более длительная инкубация может привести к экстракции других основных ядерных белков). Для повторно суспендированных образцов с объемом менее 200 мкл требуется инкубация 4 ч для лучшего выхода.
3. Центрифуга при 3 400 х г в течение 5 мин при 4 °C. Соберите супернатант в новую трубку и выбросьте гранулу позже.
4. Добавьте холодный концентрированный TCA таким образом, чтобы он составлял конечные 25%-33% v/v (например, 40-60 мкл холодного TCA: 120 мкл супернатанта) и перемешайте, перевернув трубку несколько раз.
5. Инкубировать трубки в течение не менее 1 ч при постоянном вращении или встряхивании при ^4oС.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для небольших начальных размеров гранул рекомендуется ночная инкубация.
6. Центрифуга при 3,400 х г в течение 5 мин при ^4oС. Откажитесь от супернатанта путем пипетки. Тщательно аспирировать супернатант; не прикасайтесь к боковым сторонам трубки или гранулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гистоны осаждаются с обеих сторон и дна трубки. Белая нерастворимая гранула, образующаяся в самом низу трубки, содержит в основном негистоновые белки и другие биомолекулы.
7. Промыть трубку (стенки и гранулу) холодным ацетоном + 0,1% HCl с помощью стеклянной пипетки Пастера (~500 мкл/трубка).
8. Центрифуга при 3 400 х г в течение 5 мин при ^4oС. Откажитесь от супернатанта, перевернув трубку.
9. Промыть трубку (стенки и гранулы) 100% холодным ацетоном с помощью стеклянной пипетки Пастера (~500 мкл/трубка). Центрифуга при 3 400 х г в течение 5 мин при ^4oС.
10. Выбросьте супернатант, перевернув трубку и вытащив оставшийся ацетон. Откройте крышку и высушите образец на воздухе на скамейке в течение ~20 минут.
11. Приступают к пропионилированию или хранят образцы при - ^80oСдо начала использования.

6. Первый раунд дериватизации

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование трипсина для переваривания гистоновых белков приводит к чрезмерно малым пептидам, которые трудно идентифицировать с помощью традиционных установок протеомики. По этой причине пропионический ангидрид используется для химического дериватизации ɛ-аминогрупп немодифицированных и монометиллизиновых остатков. Это ограничивает протеолиз трипсина С-концевыми остатками аргинина. Для проб в 96-луночных плитах рекомендуется использовать многоканальные пипетки и резервуары для подбора реагентов (рисунок 2А). Дериватизация также проводится после переваривания для маркировки свободных N-терминов пептидов, увеличивающих гидрофобность пептидов и, таким образом, хроматографическое удержание обратной фазы.

1. Повторное суспендирование образцов в 20 мкл 15%-20% ацетонитрила в бикарбонате аммония 100 мМ (рН 8,0). Вихрь в течение 15 с, а затем вращение вниз при 1000 x g в течение 30 с.
2. Если имеется восемь или более образцов, перенесите каждый повторно суспендированный образец в 96-луночную пластину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы не были перенесены на 96-луночную пластину, на этапах 6.3-6.7, 7.1-7.5 и 8.1-8.5 можно использовать одноканальную пипетку.
3. Под капот добавьте 2 мкл пропионового ангидрида с помощью многоканальной пипетки. Перемешайте путем пипетки вверх и вниз в 5 раз.
4. Быстро добавьте 10 мкл гидроксида аммония с помощью многоканальной пипетки. Перемешайте путем пипетки вверх и вниз в 5 раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пропионовая кислота является продуктом реакции между пропионовым ангидридом и свободными аминами из пептидов и может снижать рН образца. pH 8 может быть восстановлен путем добавления гидроксида аммония в образец в соотношении 1:5 (v/v).
5. Убедитесь, что pH равен 8, используя тестовую бумагу pH. Если рН < 8, отрегулируйте, добавив 1 мкл гидроксида аммония. Если pH > 8, отрегулируйте, добавив 1 мкл муравьиной или уксусной кислоты. Когда pH > 10, возможна маркировка других аминокислотных остатков с более высоким pKa.
6. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
7. Повторите шаги 6.3–6.6. Двойной раунд пропионилирования гистонов обеспечивает практически полную эффективность реакции.
8. Сухая пластина в вакууме со скоростью до полного высыхания всех скважин (~9 ч).
9. Приступают к перевариванию трипсина или хранят образцы при - ^80oСдо начала употребления.

7. Сбраживание гистонов

ПРИМЕЧАНИЕ: Гистоны перевариваются в пептиды с использованием трипсина, который разрезает на карбоксильной стороне остатки аргинина и лизина. Однако, поскольку пропионилирование модифицирует остатки лизина, расщепляются только остатки аргинина (рисунок 2B).

1. Готовят раствор трипсина (25 нг/мкл в 50 мМ NH₄HCO₃, рН 8,0). Добавьте 20 мкл трипсина (500 нг) к каждому образцу.
   1. Для приготовления 50 мМ раствора NH₄HCO₃ разбавьте 100 мМ NH₄HCO₃ раствор 1:1 в/об водой класса ВЭЖХ.
2. Убедитесь, что pH равен 8, используя тестовую бумагу pH. Если рН < 8, отрегулируйте, добавив 1 мкл гидроксида аммония. Если рН > 8, отрегулируйте, добавив 1 мкл муравьиной или уксусной кислоты.
3. Переварить при комнатной температуре на ночь или инкубировать при ^37oСв течение 6-8 ч.
4. Если возможно, проверьте рН после ~ 3 ч пищеварения, так как он мог снизиться. Если рН < 8, отрегулируйте, добавив 1 мкл гидроксида аммония.
5. Добавьте дополнительно 5 мкл раствора трипсина 50 нг/мкл (250 нг) и продолжайте пищеварение.
6. Приступают ко второму раунду пропионилирования или хранят образцы при - ^80oСдо начала использования.

8. Дериватизация пептида N-терминов

ПРИМЕЧАНИЕ: Пропионилирование гистоновых пептидов на их N-конце улучшает удержание кратчайших пептидов с помощью жидкостной хроматографии с обратной фазой (например, аминокислот 3-8 гистона H3), поскольку пропионильная группа увеличивает гидрофобность пептидов.

1. Под капот добавьте 2 мкл пропионового ангидрида с помощью многоканальной пипетки. Перемешайте путем пипетки вверх и вниз в 5 раз.
2. Быстро добавляйте 10 мкл гидроксида аммония с помощью многоканальной пипетки. Перемешайте путем пипетки вверх и вниз в 5 раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пропионовая кислота является продуктом реакции между пропионовым ангидридом и свободными аминами из пептидов и может снижать рН образца. pH 8 может быть восстановлен путем добавления гидроксида аммония в образец в соотношении 1:5 (v/v).
3. Убедитесь, что pH равен 8, используя тестовую бумагу pH. Если рН < 8, отрегулируйте, добавив 1 мкл гидроксида аммония. Если pH > 8, отрегулируйте, добавив 1 мкл муравьиной или уксусной кислоты. Когда pH > 10, возможна маркировка других аминокислотных остатков с более высоким pKa.
4. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
5. Повторите шаги 8.1–8.4. Двойной раунд пропионилирования гистонов обеспечивает практически полную эффективность реакции.
6. Сухая пластина в вакууме со скоростью до полного высыхания всех скважин (~9 ч).
7. Перейдите к этапу обессоливания или сохраните образцы при - ^80oCдо использования.

9. Обессоливание и очистка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Соли, присутствующие в образце, препятствуют масс-спектрометрическому анализу. Соли также ионизируются во время электрораспыления и могут подавлять сигналы от пептидов. Соли могут образовывать ионные аддукты на пептидах, которые заставляют аддуктированный пептид иметь другую массу. Это снижает интенсивность сигнала пептида и препятствует правильной идентификации и количественной оценке. Настройка обессоливания показана на рисунке 2C.

1. Начните смешивание смолы HLB (50 мг/мл в 100% ацетонитриле) на магнитной пластине перемешивания.
2. Убедитесь, что под 96-луночной полипропиленовой фильтрующей пластиной помещена 96-луночная пластина для сбора потока.
3. Добавьте 70 мкл суспензии HLB на лунку к фильтрующей пластине. Осторожно включите вакуум, чтобы предотвратить брызги. Отбросьте сквозной поток.
4. Промыть смолу 100 мкл 0,1% TFA. Осторожно включите вакуум, чтобы предотвратить брызги. Отбросьте сквозной поток.
5. Повторно суспендировать каждый образец в 100 мкл 0,1% TFA. Проверьте pH; он должен быть ~2-3.
6. Загрузите каждый образец в каждую скважину. Осторожно включите пылесос, чтобы предотвратить брызги. Отбросьте сквозной поток.
7. Промыть со 100 мкл 0,1% TFA. Осторожно включите пылесос, чтобы предотвратить брызги. Отбросьте сквозной поток.
8. Замените коллекционную пластину новой коллекционной пластиной из 96 скважин.
9. Добавьте 60 мкл 60% ацетонитрила/0,1% TFA на лунку. Осторожно включите пылесос, чтобы предотвратить брызги. Соберите сквозной поток и высушите в вакууме со скоростью.
10. Перейдите к LC-MS/MS или храните образцы при -80 ^oCдо использования.

10. Анализ гистоновых пептидов с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией

1. Подготовьте подвижные фазы к работе на высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Подвижная фаза А (MPA): 2% ацетонитрила класса ВЭЖХ + 0,1% муравьиной кислоты. Мобильная фаза B (MPB): 80% ацетонитрила класса ВЭЖХ + 0,1% муравьиной кислоты.
2. Программируйте метод ВЭЖХ следующим образом: (1) 4%-34% MPB в течение 30 мин; (2) 34%-90% MPB в течение 5 мин; и (3) изократические 90% MPB в течение 5 мин. Используйте следующие рекомендуемые свойства колонки: C₁₈ упаковочный материал 3 мкм, внутренний диаметр 75 мкм, длина 20-25 см. Установите скорость потока 250-300 нл/мин для наноколонок с внутренним диаметром 75 мкм.
   1. В случае, если ВЭЖХ не запрограммирована на автоматизацию выравнивания колонн перед загрузкой образца, включите (4) 90%-4% MPB в течение 1 мин и (5) изократические 4% MPB в течение 10 мин.
3. Запрограммируйте метод получения MS.
   1. Убедитесь, что прибор выполняет одно полное сканирование MS в начале каждого рабочего цикла. Рекомендуется использовать приборы с высоким разрешением (например, орбитальные аппараты или анализаторы времени пролета) из-за точности массы, которая может быть использована во время извлечения сигнала. Однако приборы с низким разрешением также могут быть использованы, как описано ранее^27,28.
   2. Убедитесь, что за полным сканированием MS следует 16 событий сканирования MS/MS, каждое из которых имеет ширину изоляции 50 м/з, охватывающий диапазон m/z 300-1100. Например, первое сканирование должно изолировать сигналы при 300-350 м/з, второе при 350-400 м/з и т.д. Если возможно, также получите MS/ MS сканирование в высоком разрешении, но достаточно более низкого разрешения по сравнению с полным сканированием MS (из-за меньших масс фрагментов ионов по сравнению с интактными ионами).
   3. Метод ВЭЖХ будет генерировать хроматографические сигналы с пиковой шириной ~3-40 с; для обеспечения надлежащей количественной оценки сигнала убедитесь, что масс-спектрометр выполняет не менее 10 рабочих циклов на хроматографический пик (т.е. рабочий цикл 3 с или выше).
   4. При использовании анализатора массы в стиле треппинга (орбитрап, ионная ловушка) убедитесь, что ограничение по времени впрыска ионов установлено равным <200 мс; для других анализаторов (квадрупольный, время пролета) это не проблема из-за их более быстрого времени сканирования. Может потребоваться предварительное испытание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о методах MS для анализа гистоновых пептидов можно найти в следующих ссылках 27,28,29.
4. Повторное суспендирование образца в 10 мКЛ МПА, что соответствует ~1 мкг/мкл переваренного образца гистона. Точное количество загрузки не является критическим (также не тривиальным для оценки), если все образцы в партии загружены с использованием аналогичных разбавлений и объемов.
5. Загрузите 1 мкл образца в колонну ВЭЖХ.
6. Запустите метод LC-MS/MS, запрограммированный на шагах 10.1-10.3.

11. Анализ данных

1. Импортируйте файлы необработанных данных MS в программное обеспечение, предназначенное для интеграции пиковой области.
   ПРИМЕЧАНИЕ: EpiProfile ^30,31 используется в текущем исследовании и обычно рекомендуется, так как он оптимизирован для надежной экстракции известных гистоновых пептидов в районе пика. Тем не менее, другое свободно доступное программное обеспечение для извлеченной ионной хроматографии, такое как Skyline^32,33, подходит.
2. Рассчитайте относительное содержание данного (не)модифицированного пептида как площадь одного пептида, деленную на общую площадь пептида во всех его модифицированных формах. Программное обеспечение, такое как EpiProfile^30,31, уже содержит библиотеки пептидов для извлечения сигнала. В противном случае генерируйте библиотеку интересующих пептидов либо вручную, либо с помощью идентификации пептидов с использованием обычных конвейеров протеомики.

В этом протоколе сфероиды HepG2/C3A обрабатывали 20 мМ NaBut и 10 мМ NaSuc, оба из которых влияли на глобальные уровни гистоновых ПТМ (рисунок 3А). Затем гистоновые ПТМ были идентифицированы и количественно определены на уровне одного остатка с помощью сбора MS/MS (рисунок 3B).

Когда образцы запускаются в репликах, статистический анализ может быть выполнен для оценки обогащения изменения складки PTM между образцами, а также воспроизводимости наблюдения. Показанные данные демонстрируют, что пептиды, модифицированные ацетилированием, обогащаются сфероидами, обработанными NaBut по сравнению с контролем (рисунок 3C), в то время как образцы, обработанные NaSuc, имеют более высокое относительное содержание гистоновых пептидов, модифицированных сукцинированием лизина (рисунок 3D). Эти расчеты были выполнены в программе электронных таблиц, как подробно описано в отдельной публикации³⁴. Общее увеличение данной модификации гистонов может быть лучше представлено на радиолокационных графиках, где наблюдение за более высоким глобальным изобилием определенной модификации становится более интуитивным, даже при сохранении подробной информации об анализируемых местах модификации (рисунок 3E, F).

Этот протокол генерирует пептид из аминокислотных остатков гистона H3 9-17, которые включают часто модифицированные остатки K9, S10 и K14. Показанные данные показывают, что лечение NaBut повышает уровни H3K14ac, но только на гистонах, совместно модифицированных с H3K9me2, а не H3K9me3 (рисунок 4A). Частота сосуществования между двумя модификациями может быть представлена более интуитивно в виде кольцевого графа, где узлы представляют отдельные модификации, в то время как толщина соединительных линий представляет частоту сосуществования между двумя PTM (рисунок 4B). Иногда частота сосуществования не затрагивается, но данные, представленные в виде штриховых графиков, могут вводить в заблуждение. Например, данные, представленные на рисунке 4A , указывают на то, что комбинация H3K9me2K14ac более распространена при лечении NaBut, чем при контроле. Это правильно, но данная комбинация является наиболее частой независимо от лечения. На рисунке 4B ясно показано, что H3K9me2K14ac и H3K9me3K14ac являются наиболее частыми комбинаторными паттернами независимо от обработки (толщины линии), но что глобальные уровни H3K14ac (узел) - это то, что действительно меняется в эксперименте.

Этот протокол генерирует пептид из остатков гистона H4 4-17, который включает модифицируемые остатки в положениях K5, K8, K12 и K16 (в основном путем ацетилирования). При сравнении контроля и лечения NaBut можно наблюдать увеличение комбинаций ацетилирования, представляя данные в виде, например, облаков слов (рисунок 4C). Это представление ясно подчеркивает, что немодифицированная версия гистона H4 наиболее распространена в контрольном образце, в то время как сфероиды, обработанные NaBut, обогащаются двумя, тройными и четырехкратно ацетилированными протеоформами гистона H4. Однако облака слов ограничены в отображении точных значений; относительное обилие гистонового кода должно быть развито размером текста, который может быть неточно оценен. Поэтому диаграммы Венна или более современные эквиваленты, такие как представление^{UpSetR 35} , могут быть использованы для демонстрации точной количественной оценки сосуществующих гистоновых ПТМ (рисунок 4D, E). Показанные данные еще раз подчеркивают, что выбранные комбинации ацетилирования на гистоне H4 относительно более распространены при лечении NaBut по сравнению с контролем.

Рисунок 1: Рабочий процесс анализа гистоновых пептидов 3D-сфероидов. Клетки HepG2 /C3A сначала выращивают в 2D-культуре, пока они не достигнут 80% слияния. Затем клетки переносятся в уравновешенный биореактор и помещаются в инкубатор клиностата, где они будут вращаться со скоростью 10-11 оборотов в минуту с образованием сфероидов. Через 18 дней сфероиды обрабатывают либо 20 мМ NaBut, либо 10 мМ NaSuc и собирают после соответствующих им временных точек. Ядра выделяют из клеток и экстракцию гистонов проводят с 0,2 М H₂SO₄. Затем проводится дериватизация гистонов пропионовым ангидридом до и после переваривания трипсина для обеспечения удержания полученных коротких пептидов с помощью жидкостной хроматографии. Образцы обессоливаются, а затем запускаются с использованием метода LC-MS/MS, упомянутого на шаге 10, и полученные данные анализируются, как описано на шаге 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Настройка для этапов пропионилирования и обессоливания. (А) Пропионилирование выполняется в вытяжном шкафу, и все компоненты выложены таким образом, чтобы этапы могли быть выполнены в быстрой последовательности. (B) Схема первого раунда пропионилирования, переваривания трипсина и второго раунда пропионилирования на хвосте гистона H3.1. (C) Обессоливание осуществляется на стенде с использованием вакуумного коллектора из 96 скважин и 96-луночной полипропиленовой фильтрующей пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Представление отдельных модификаций гистонов. (A) Гистограмма, показывающая относительное обилие общих глобальных модификаций гистонов в контролируемых и обработанных (20 мМ NaBut или 10 мМ NaSuc) сфероидов HepG2/C3A. (B) Гистограмма, показывающая обилие одиночных гистоновых ПТМ, встречающихся на остатках 9-17 пептида гистона H3 (KSTGGKAPR) в контролируемых и обработанных (20 мМ NaBut или 10 мМ NaSuc) сфероидов HepG2/C3A. (С,Г) Вулканические графики, показывающие изменение складки и значимость дифференциальной экспрессии гистоновых пептидных ПТМ после обработки 20 мМ NaBut (C) или 10 мМ NaSuc (D). Выделенные синие и зеленые точки представляют собой ацетилированные и сукцинированные остатки соответственно. (Э,Ф) Радиолокационные графики, показывающие обилие ацетилирования одиночного гистонового пептида (E) или сукцинилирования (F) после обработки 20 мМ NaBut или 10 мМ NaSuc соответственно по сравнению с контролем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Представление сосуществующих модификаций гистонов. (A) Гистограмма, показывающая обилие комбинаторных гистоновых ПТМ, встречающихся на остатках 9-17 гистона H3 (KSTGGKAPR) в контроле и обработанных (20 мМ NaBut или 10 мМ NaSuc) сфероидов HepG2/C3A. (B) Кольцевые графики, показывающие взаимосвязь между комбинаторными гистоновыми ПТМ на остатках 9-17 гистона H3 (KSTGGKAPR) в контроле и обработанными (20 мМ NaBut) сфероидами HepG2/C3A. Интенсивность цвета узла соответствует обилию одного ПТМ в его группе обработки, в то время как толщина линии соответствует частоте совместного возникновения ПТМ. (C) Облака слов, показывающие частоту комбинаторных гистоновых ПТМ на остатках гистона H4 в контролируемом и обработанном (20 мМ NaBut) сфероидах HepG2/C3A. Размер текста соответствует обилию заданного комбинаторного ПТМ. (Д,Д) Диаграмма Венна, представляющая частоту сосуществующих модификаций на гистоновых пептидных остатках Н4 4-17 в контрольных и обработанных 20 мМ NaBut образцах. Данные отображаются с помощью ShinyApp UpSetR³⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Список пептидов, обнаруженных с помощью этого протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Анализ гистоновых ПТМ принципиально отличается от типичного конвейера анализа протеомики. Большинство гистоновых ПТМ по-прежнему имеют загадочные биологические функции; в результате аннотации, такие как Генная онтология или базы данных путей, недоступны. Существует несколько ресурсов, которые связывают модификации гистонов с ферментом, ответственным за их катализ, или белками, содержащими домены, которые связывают эти ПТМ (например, HISTome³⁶). Кроме того, можно спекулировать на общем состоянии хроматина, когда регулируются глобальные уровни гистоновых ПТМ. Например, общее увеличение ацетилирования гистонов или других ацилирования, таких как сукцинилирование, обычно связано с деконденсацией хроматина^37,38.

Анализ РС дает более подробную информацию об этих модификациях, например, их точную локализацию на аминокислотной последовательности. В этом протоколе сбор MS / MS используется для идентификации и количественной оценки гистоновых PTM, которые могут иметь решающее значение для биологической интерпретации. Например, триметилирование на лизине 4 гистона H3 (H3K4me3) обогащается промоторами активно транскрибируемых генов³⁹, в то время как такая же модификация на лизине 9 (H3K9me3) эталонах конститутивного гетерохроматина⁴⁰. Модификации гистонов в настоящее время используются в качестве биомаркеров при конкретных заболеваниях; таким образом, анализ гистонов может быть использован для изучения патологии заболевания в дополнение к ответу на лечение (например, эпигенетическими препаратами)^41,42.

Более сложно визуально представить взаимодействия между несколькими ПТМ, а не с одними ПТМ. Хотя существующие диаграммы, такие как кольцевые графики, могут показывать частоту сосуществования двух PTM, они не могут представлять частоту сосуществования между более чем двумя PTM одновременно, поскольку для этого потребуется трехмерное представление сети. По этой причине другие представления могут быть более подходящими для выделения изменений в гистоновых кодах при рассмотрении трех или более ПТМ. В целом, диверсификация представления данных дает больше шансов наблюдать значительные изменения между выборками. В этом протоколе представлены примеры различных иллюстраций для отображения правил гистоновых ПТМ и сосуществующих ПТМ.

Хотя этот протокол генерирует относительно небольшие гистоновые пептиды из-за переваривания трипсина (примерно 4-20 аминокислот), выбранные пептиды содержат несколько модифицируемых остатков. Анализ этих пептидов позволяет количественно оценить частоты сосуществования ПТМ, что может выявить важную информацию о том, какие комбинаторные гистоновые метки регулируются в данном наборе данных. Примечательно, что во время подготовки образца нет этапов, на которых выполняется количественная оценка гистонов. Для этого есть четыре причины: (1) трипсин обладает широким спектром активности и может использоваться в широком диапазоне соотношений ферментов к образцам (1: 10-1: 200). Даже когда экспериментальный выход экстрагированных гистонов отличается от ожидаемого, проблемы с пищеварением не возникали при использовании этого протокола. (2) Этот протокол предназначен для мельчайших количеств материала, где количественное определение гистонов может быть затруднено из-за отсутствия чувствительности. (3) Используя постоянную концентрацию трипсина независимо от количества гистонового материала, мы можем использовать триптические пептиды (в виде аутолизов трипсина) для сравнения производительности хроматографии. Незначительные изменения в выходе образца будут нормализованы программным обеспечением для анализа данных (этап 11), которое использует все (не)модифицированные сигналы для данного пептида в качестве знаменателя в процессе нормализации. (4) Наконец, резкая недооценка количества исходного материала может создать проблемы перегрузки хроматографической колонки nanoLC. Однако выполнение этапа обессоливания, указанного в этом протоколе, предотвращает возникновение этой проблемы. В случае чрезмерного количества исходного материала (например, >100 мкг) предел мощности обессоливающей смолы будет превышен, и любой избыточный образец будет смыт на этапе загрузки.

Важно отметить, что не все пептиды, обнаруженные в результате этого анализа, были выделены на рисунках 3 и 4. Кроме того, не все модификации гистонов можно обнаружить с помощью этих конкретных методов подготовки и сбора проб. В дополнительной таблице 1 приведен список всех пептидных сигналов, которые извлекаются с помощью описанного конвейера. Несколько известных модификаций в таблице не перечислены, так как описанная пробоподготовка не подходит для их обнаружения. Примечательными примерами являются убиквитинилированные пептиды из гистона H2A и H2B и фосфорилирование гистона H2A. X (общий маркер повреждения ДНК). Это связано с тем, что пропионилирование пептидов, связанных с этими ПТМ, приводит к чрезмерно длинным пептидам, которые не подходят для хроматографии C18 и описанного метода обнаружения РС. Другие модификации, которые присутствуют в литературе, но не присутствуют в Дополнительной таблице 1 , представляют собой модификации очень низкого содержания (в настоящее время они обнаруживаются только с использованием РС после стратегий обогащения, таких как иммунопреципитация или специфическая клеточная обработка), такие как лактилирование⁴³ или серотонилирование⁴⁴. Модификации гистонов с непредсказуемыми сдвигами массы, вызванными полимеризацией или гетерогенным ковалентным связыванием с гистоновой последовательностью, также не рассматриваются (например, поли-АДФ-рибозилирование⁴⁵ и гликирование⁴⁶). Кроме того, этот протокол использует NaSuc и NaBut для лечения сфероидов HepG2 / C3A, но он может быть модифицирован для использования с другими препаратами / эпигенетическими модификаторами и типами 2D / 3D клеточных культур.

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Лаборатория Сидоли с благодарностью отмечает Фонд исследований лейкемии (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (sagol Network GerOmics award), Deerfield (премия Xseed), Relay Therapeutics, Merck и Офис директора NIH (1S10OD030286-01).