כימות ברמה הגלובלית של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון במודל תרבית תאים תלת-ממדית של רקמת כבד

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש במערכת תרביות תאים תלת-ממדית כדי למדל, לטפל ולנתח שינויי כרומטין במצב כמעט פיזיולוגי.

תרביות שטוחות של תאי יונקים הן גישה נפוצה במבחנה להבנת הפיזיולוגיה של התא, אך מערכת זו מוגבלת במידול רקמות מוצקות עקב שכפול תאים מהיר באופן לא טבעי. זה מאתגר במיוחד כאשר מידול כרומטין בוגר, מכיוון שתאים המשכפלים במהירות מעורבים לעתים קרובות בשכפול DNA ויש להם אוכלוסייה פוליפלואידית הטרוגנית. להלן זרימת עבודה למידול, טיפול וניתוח של שינויים בכרומטין באמצעות מערכת תרביות תאים תלת-ממדית (3D). באמצעות פרוטוקול זה, קווי תאי קרצינומה הפטוצלולריים גדלים כספרואידים תלת-ממדיים הניתנים לשחזור באינקובטור המספק דיפוזיה פעילה של חומרים מזינים וכוחות גזירה נמוכים. הטיפול בנתרן בוטיראט ונתרן סוקסינט גרם לעלייה באצטילציה של היסטון ובסוקצינילציה, בהתאמה. עליות ברמות של אצטילציה היסטון ותמציתינילציה קשורות למצב כרומטין פתוח יותר. לאחר מכן נאספים כדוריים לבידוד גרעיני התא, שמהם מופקים חלבוני היסטון לניתוח השינויים שלאחר התרגום שלהם. ניתוח היסטון מתבצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב מקוון עם ספקטרומטריית מסה טנדם, ואחריה צינור חישובי פנימי. לבסוף, מוצגות דוגמאות לייצוג נתונים כדי לחקור את התדירות וההתרחשות של סימני היסטון קומבינטוריים.

מאז סוף המאה^ה-19, מערכות תרביות תאים שימשו כמודל לחקר הצמיחה וההתפתחות של תאים מחוץ לגוף האדם ^1,2. השימוש בהם הורחב גם כדי לחקור כיצד רקמות ואיברים מתפקדים בהקשרים בריאים וחולים^{כאחד 1,3}. תאי ההשעיה (למשל, תאי הדם) גדלים בצלחות פטרי או בצלוחיות בצורה חלקה ומתחלפת מכיוון שהם אינם מורכבים במבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) in vivo. תאים שמקורם באיברים מוצקים יכולים לגדול במערכות תרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות) או תלת-ממדיות. בתרבית דו-ממדית, התאים גדלים בחד-שכבתית שנצמדת למשטח שטוח ^2,4. מערכות תרביות תאים דו-ממדיות מאופיינות בצמיחה אקספוננציאלית ובזמן הכפלה מהיר, בדרך כלל 24 שעות עד כמה ימים⁵. תאים במערכות תלת-ממדיות גדלים ויוצרים אינטראקציות מורכבות בין תאים לתאים המדגימים קונגלומרטים דמויי רקמות בצורה הדוקה יותר, והם מאופיינים ביכולתם להגיע לשיווי משקל דינמי שבו זמן ההכפלה שלהם יכול להגיע לחודש או יותר⁵.

מוצגת במאמר זה מתודולוגיה חדשנית לגידול ספרואידים תלת-ממדיים במערכות תרביות תאים מסתובבות המדימות כוח משיכה מופחת⁶. זוהי נגזרת פשוטה של מערכת תרביות תאים שהוצגה על ידי נאס"א בשנות ה-90^{של המאה ה-20.} גישה זו ממזערת את כוחות הגזירה, המתרחשים בשיטות קיימות כמו צלוחיות מסתובבות, ומגבירה את יכולת השכפול של הספרואידים⁶. בנוסף, הביוריאקטור המסתובב מגביר את הדיפוזיה הפעילה של חומרי המזון, וממזער היווצרות נמקית המתרחשת במערכות כמו תרבית תאים תלויה, שבהן חילופי המדיה אינם מעשיים⁶. בדרך זו, תאים גדלים בעיקר באין מפריע, ומאפשרים היווצרות של מאפיינים מבניים ופיזיולוגיים הקשורים לתאים הגדלים ברקמות. הפטוציטים מסוג C3A (HepG2/C3A) בתרבית באופן זה לא רק בעלי אברונים אולטרה-סטרוקטורליים, אלא גם הפיקו כמויות של ATP, אדנילט קינאז, אוריאה וכולסטרול בדומה לרמות שנצפו ב-vivo ^1,2. בנוסף, תאים שגדלו במערכות תרביות תאים דו-ממדיות לעומת .3D מפגינים דפוסי ביטוי גנים שונים⁸. ניתוח ביטוי גנים של הפטוציטים C3A שגדלו כספרואידים תלת-ממדיים הראה כי תאים אלה ביטאו מגוון רחב של חלבונים ספציפיים לכבד, כמו גם גנים המעורבים במסלולים מרכזיים המווסתים את תפקודי הכבד⁸. פרסומים קודמים הדגימו את ההבדלים בין פרוטאומים של תאים הגדלים באופן אקספוננציאלי בתרבית דו-ממדית לעומת תאים בשיווי משקל דינמי בתרביות ספרואידיות תלת-ממדיות⁵. הבדלים אלה כוללים את חילוף החומרים התאי, אשר בתורו משפיע על המבנה, התפקוד והפיזיולוגיה של התא⁵. הפרוטאום של תאים שגדלו בתרבית דו-ממדית היה מועשר יותר בחלבונים שהיו מעורבים בשכפול תאים, בעוד שהפרוטאום של הספרואידים התלת-ממדיים היה מועשר יותר בתפקוד הכבד⁵.

קצב השכפול האיטי יותר של תאים הגדלים כספרואידים תלת-ממדיים מדגים בצורה מדויקת יותר תופעות ספציפיות הקשורות למצב כרומטין ולשינויים (לדוגמה, חיתוך היסטון⁹). חיתוך היסטון הוא שינוי בלתי הפיך של היסטון לאחר התרגום (PTM) הגורם לביקוע פרוטאוליטי של חלק מזנב ההיסטון N-טרמינלי. בעוד שתפקודו הביולוגי עדיין נמצא בדיון 10,11,12,13, ברור שנוכחותו בתאים ראשוניים וברקמת הכבד מבוססת על מודלים של תאי HepG2/C3A שגדלו כספרואידים, אך לא כתאים שטוחים 9. זה קריטי, שכן מצב הכרומטין והשינויים מווסתים את קריאת הדנ"א בעיקר על ידי ויסות הנגישות לגנים ובכך לביטוי שלהם¹⁴. PTMs של היסטון משפיעים על מצב הכרומטין באופן ישיר על ידי השפעה על המטען נטו של הנוקלאוזומים שבהם מורכבים היסטונים, או בעקיפין על ידי גיוס כותבי כרומטין, קוראים ומחקים¹⁴. מאות PTMs של היסטון זוהו עד כה¹⁵, מה שמחזק את ההשערה כי כרומטין מארח "קוד היסטון" המשמש את התא לפענוח דנ"א¹⁶. עם זאת, הזיהוי של מספר עצום של צירופי PTM¹⁵, והגילוי שלשילובים של PTMs היסטון יש לעתים קרובות פונקציות ביולוגיות שונות מ- PTMs הנמצאים בבידוד (למשל Fischle, et ^al.17), מדגישים כי נדרשת עבודה נוספת כדי לפענח את "קוד היסטון".

נכון לעכשיו, ניתוח Histone PTM מבוסס על טכניקות המשתמשות בנוגדנים (למשל, כתמים מערביים, אימונופלואורסצנציה, או מיצוי חיסוני של כרומטין ולאחר מכן ריצוף [ChIP-seq]) או ספקטרומטריית מסה (MS). לטכניקות מבוססות נוגדנים יש רגישות גבוהה והן יכולות לספק מידע מפורט על לוקליזציה כלל-גנומית של סימני היסטון, אך לעתים קרובות הן מוגבלות בחקר PTMs או PTMs נדירים הנמצאים בשילובים 18,19,20. טרשת נפוצה מתאימה יותר לזיהוי וכימות בתפוקה גבוהה ובלתי משוחדת של שינויים בחלבונים בודדים וקיימים יחד, במיוחד חלבוני היסטון 18,19,20. מסיבות אלה, מעבדות אלה ומספר מעבדות אחרות ביצעו אופטימיזציה של צינור הטרשת הנפוצה לניתוח פפטידי היסטון (טרשת נפוצה מלמטה למעלה), זנבות היסטון שלמים (MS באמצע למטה) וחלבוני היסטון באורך מלא (MS מלמעלה למטה)21,22,23.

להלן תהליך עבודה לגידול כדוריות HepG2/C3A ולהכנתם לניתוח פפטידי היסטון (MS מלמטה למעלה) באמצעות כרומטוגרפיה ננו-נוזלית, בשילוב מקוון עם ספקטרומטריית מסות טנדם (nLC-MS/MS). גדלה תרבית תאים דו-ממדית והתאים נקטפו והועברו לביוריאקטור, שם הם יתחילו ליצור ספרואידים (איור 1). לאחר 18 יום בתרבית, הספרואידים טופלו בנתרן בוטיראט או נתרן סוקסינט כדי להגדיל את השפע היחסי של אצטילציה היסטון וסוקצינילציה. יש לציין כי ניתן לטפל בתרביות תלת-ממדיות באמצעות תרכובות גנוטוקסיות באותה מידה כמו מקבילותיהן לתרבית השטוחה; למעשה, פרסומים אחרונים מדגישים כי תגובת הטוקסיקולוגיה של תאים בתרבית תלת-ממדית דומה יותר לרקמות ראשוניות מאשר אלה בתרבית שטוחה דו-ממדית^24,25. לאחר מכן נאספו תאים בנקודות זמן מוגדרות ובוצע בידוד גרעיני. לאחר מכן, היסטונים הופקו ונגזרו עם אנהידריד פרופיוני לפני ואחרי עיכול טריפסין על פי פרוטוקול שפותח לראשונה על ידי Garcia et ^al.26. הליך זה מייצר פפטידים בגודל המתאים להפרדה מקוונת עם כרומטוגרפיה פאזה הפוכה (C₁₈) וזיהוי עם טרשת נפוצה. לבסוף, פפטידי היסטון זוהו וכומתו, והנתונים שנוצרו היו מיוצגים בדרכים רבות לפרשנות ביולוגית מלאה יותר.

1. הכנת מאגרים וריאגנטים

1. מדיית גדילת תאים (עבור תאי HepG2/C3A): הוסף סרום בקר עוברי (FBS) (10% v/v), חומצות אמינו לא חיוניות (1% v/v), תוסף L-גלוטמין (1% v/v) ופניצילין/סטרפטומיצין (0.5% v/v) למדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM, המכיל 4.5 גרם/ל' גלוקוז). מדיית הצמיחה מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לכל היותר.
2. תמיסת 200 mM נתרן בוטיראט (NaBut): כדי להכין 10 מ"ל, resuspend 220.18 מ"ג של NaBut ב 10 מ"ל של ddH₂O. אחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C (76 °F). לפני הטיפול בתא, סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים בקוטר 0.45 מ"מ והוסף 1 מ"ל של התמיסה המסוננת ל-9 מ"ל של מדיית גדילת תאים לריכוז עובד של 20 מ"מ.
3. תמיסת נתרן סוקסינט (NaSuc) של 100 mM: כדי להכין 10 מ"ל, יש לבצע החייאה של 162.05 מ"ג של NaSuc ב-10 מ"ל של ddH₂O. אחסן 1 מ"ל אליקוטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. לפני הטיפול בתא, סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים של 0.45 מ"מ והוסף 1 מ"ל של התמיסה המסוננת ל-9 מ"ל של מדיית גדילת תאים לריכוז עובד של 10 mM.
4. קר 0.2 M H₂SO₄: כדי להכין 1 L, הוסף 10 מ"ל של H מרוכז₂SO₄ עד 990 מ"ל של מים באיכות HPLC. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. אצטון קר + 0.1% חומצה הידרוכלורית (HCl): הוסף HCl מרוכז (0.1% v/v) לאצטון. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. תמיסת 100 mM NH₄HCO₃ , pH 8.0: כדי להכין 1 ליטר, החייאה 7.91 גרם של NH₄HCO₃ ב-1 ליטר של מים בדרגה HPLC. אחסן 50 מ"ל aliquots ב -20 °C (76 °F).
7. תמיסת 0.1% חומצה טריפלואורואצטית (TFA): הוסף TFA מרוכז (0.1% v/v) למים ברמת HPLC. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
8. 60% תמיסת אצטוניטריל/0.1% TFA: הוסף אצטוניטריל בדרגה HPLC (60% v/v) למים בדרגה HPLC. לאחר מכן, הוסף TFA מרוכז (0.1% v/v) לפתרון זה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
9. 2% אצטוניטריל ברמת HPLC + 0.1% חומצה פורמית: הוסף אצטוניטריל ברמת HPLC (2% v/v) למים ברמת HPLC. לאחר מכן, הוסף חומצה פורמית מרוכזת (0.1% v/v) לתמיסה זו.
10. 80% אצטוניטריל ברמת HPLC + 0.1% חומצה פורמית: הוסף אצטוניטריל ברמת HPLC (80% v/v) למים ברמת HPLC. לאחר מכן, הוסף חומצה פורמית מרוכזת (0.1% v/v) לתמיסה זו.

2. הכנת מערכת התרבות התלת-ממדית

הערה: לתאים שונים, ראשוניים או מונצחים, יש תכונות תרביות שונות, כך שהיווצרותם של ספרואידים עשויה להיות שונה בין סוגי התאים. פרוטוקול זה הוקם עבור היווצרות ספרואידים HepG2/C3A באמצעות ביוריאקטורים ומערכת תרביות תאים תלת-ממדית חדשנית.

1. באמצעות מדיית גדילה סטנדרטית, מגדלים תאים כחד-שכבתיים עד שהם נפגשים ב-80%.
2. לשטוף תאים עם HBSS (5 מ"ל עבור בקבוק 75 ס"מ² ) ולדגום תאים עם 5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA מדולל HBSS (דילול 1:2) במשך 5 דקות ב 37 ^oC עם 5% CO₂.
3. בדקו את ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ ונטרלו את הטריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) או מדיית גדילה (המכילה 5%-10% FBS).
4. ספור את מספר התאים ודלל את תרחיף התא כדי לקבל 1 x 10⁶ תאים בנפח מרבי של 1.5 מ"ל.
5. שיווי משקל צלחת תחתונה עגולה בעלת חיבור נמוך במיוחד של 24 בארות (המכילה מספר מיקרו-בארות לכל באר) על ידי שטיפת הבארות עם 0.5 מ"ל של מדיית גדילה. צנטריפוגה על הצלחת במשך 5 דקות ב 3,000 x g כדי להסיר בועות אוויר מפני השטח של הבאר.
6. מעבירים את מתלי התא לצלחת וצנטריפוגה למשך 3 דקות ב-120 x גרם.
7. דגירה של הצלחת למשך 24 שעות בשעה 37 ^oC עם 5% CO₂ להיווצרות ספרואידים. בינתיים, שיווי משקל הביוריאקטור על ידי מילוי תא הלחות ב-25 מ"ל של מים סטריליים ותא התא ב-9 מ"ל של מדיית גדילה.
8. דגירה של הביוריאקטור, המסתובב בחממת הקלינוסטאט, במשך 24 שעות ב-37 ^oC עם 5% CO₂.

3. גדילה של ספרואידים בביוריאקטורים

הערה: כדי לשמר את המבנה של ספרואידים, טיפים רחבים של נשא משמשים לטיפול במבנים התלת-ממדיים.

1. נתקו את הספרואידים מצלחת החיבור הנמוכה במיוחד על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה עם קצוות בור ברוחב 1 מ"ל והעבירו למנה שטופלה בתרבית רקמה.
2. שטפו את הצלחת ב-0.5 מ"ל של מדיית גדילה שחוממה מראש והעבירו לאותה מנה.
3. הערך את איכות הספרואידים על ידי מיקרוסקופיה ובחר ספרואידים שנוצרו מספיק. לספרואידים באיכות טובה יש גודל אחיד, קומפקטיות ועגולות.
4. מעבירים כדוריות לביוריאקטורים שיווי משקל מלאים ב-5 מ"ל של מדיית גדילה טרייה. לאחר העברת הספרואידים, מלאו לחלוטין את הביוריאקטור במדיית גדילה טרייה.
5. מניחים את הביוריאקטור בחממת הקלינוסטאט ומתאימים את מהירות הסיבוב ל-10-11 סל"ד.
6. החלף מדיה לצמיחה כל 2-3 ימים על ידי הסרת 10 מ"ל של מדיה ישנה והחלפתה ב-10 מ"ל של מדיה טרייה.
7. התאימו את מהירות הסיבוב בהתאם לצמיחת הספרואידים, וכך גדלים ככל שהספרואידים גדלים בגודלם ובמספרם.
8. לאחר 18 יום בתרבית, הספרואידים מוכנים לטיפול ו/או לאיסוף

4. טיפול ואיסוף ספרואידים

הערה: בפרוטוקול זה, ספרואידים HepG2/C3A מטופלים בנתרן בוטיראט (NaBut) ונתרן סוקסינט (NaSuc) כדי להעריך את רמות סימני ההיסטון המכילים אצטילציה ותמציתינילציה, בהתאמה.

1. הכינו מדיית גדילה עם ריכוז העבודה המתאים של תרכובת (למשל, 20 mM של NaBut או 10 mM NaSuc). החלף את המדיה בביוריאקטור עם המדיה המטופלת.
   הערה: כדי לקבוע מצב בקרה, או לאסוף מספיק ספרואידים לניסויים לפני הוספת הטיפול או לייעד ביוריאקטור לספרואידים שלא טופלו.
2. אספו ספרואידים לניתוח פרוטאומי לאחר זמן טיפול מספיק (למשל, 48 שעות עד שבוע לטיפול ב-NaSuc או 48-72 שעות לטיפול ב-NaBut).
   הערה: עבור מיצוי היסטון באמצעות פרוטוקול זה, נאספו שישה עד שמונה ספרואידים המכילים בערך 1 x 10⁶ תאים.
   1. הסר 3-5 מ"ל של מדיה מהביוריאקטור דרך היציאה העליונה.
   2. פתחו את היציאה הקדמית והשתמשו בקצה בור ברוחב 1 מ"ל כדי להסיר ספרואידים ולהניח אותם בצינורות מיקרוצנטריפוגה.
   3. צנטריפוגה את הספרואידים ב 100 x g במשך 5 דקות להשליך מדיה.
      הערה: ניתן לשנות את המדיה בביוריאקטור ולהחזיר את הביוריאקטור לחממה לזמן טיפול נוסף או להחלמה.
   4. לשטוף spheroids עם 200 μL של HBSS כדי להסיר את FBS. צנטריפוגה ב 100 x g במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
      הערה: ניתן לאחסן כדוריות ב- -80 ^oC עד לעיבוד.

5. מיצוי היסטון

הערה: שאריות חומצות האמינו הבסיסיות הרבות הקיימות בהיסטונים מאפשרות להם לקיים אינטראקציה הדוקה עם הדנ"א, בעל עמוד שדרה של חומצה זרחתית. מכיוון שהיסטונים הם חלק מהחלבונים הבסיסיים ביותר בגרעין, כאשר הם מופקים עם חומצה גופרתית קרה כקרח (0.2 M H₂SO₄) יש זיהום מינימלי. החלבונים שאינם היסטון יתפזרו בחומצה חזקה. חומצה טריכלורואצטית מרוכזת מאוד (TCA) המדוללת לריכוז סופי של 33% משמשת לאחר מכן כדי לזרז את ההיסטונים מהחומצה הגופרתית. שמור את כל הדגימות, הצינורות והריאגנטים על הקרח למשך כל מיצוי ההיסטון.

1. הוסף חמישה כרכים (~100 μL) של 0.2 M H_{קר 2}SO₄ לכדור התא (~10-20 μL), ופיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את הכדור ולשחרר היסטונים.
2. דגירה צינורות עד 4 שעות בסיבוב קבוע או רעד ב 4 ^oC.
   הערה: עבור דגימות שעברו בדיקה חוזרת בנפח העולה על 500 μL, דגירה של 2 שעות מספיקה כדי לחלץ היסטונים (דגירה ארוכה יותר עלולה לגרום למיצוי של חלבונים גרעיניים בסיסיים אחרים). עבור דגימות שעברו החייאה עם נפח של פחות מ-200 μL, נדרשת דגירה של 4 שעות לתפוקה טובה יותר.
3. צנטריפוגה ב 3,400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (74 °F). לאסוף supernatant בצינור חדש ולהשליך את הכדור מאוחר יותר.
4. מוסיפים TCA מרוכז קר כך שהוא מהווה 25%-33% v/v סופי (למשל, 40-60 μL של TCA קר: 120 μL של סופרנאטנט) ומערבבים על ידי היפוך הצינור כמה פעמים.
5. דגירה של צינורות במשך שעה אחת לפחות בסיבוב קבוע או רעד בשעה 4 ^oC.
   הערה: עבור גדלי כדוריות התחלתיים קטנים יותר, מומלץ לבצע דגירה למשך הלילה.
6. צנטריפוגה ב 3,400 x g במשך 5 דקות ב 4 ^oC. להשליך supernatant על ידי pipetting. לשאוף את הסופרנאטנט בזהירות; אין לגעת בצידי הצינור או בכדור.
   הערה: היסטונים מפקידים בשני הצדדים ובתחתית הצינור. הכדור הלבן והבלתי מסיס שנוצר בתחתית הצינור מכיל בעיקר חלבונים שאינם היסטון וביו-מולקולות אחרות.
7. שטפו את הצינור (קירות וכדורים) עם אצטון קר + 0.1% HCl באמצעות פיפטת פסטר זכוכית (~500 μL/tube).
8. צנטריפוגה ב 3,400 x g במשך 5 דקות ב 4 ^oC. להשליך supernatant על ידי היפוך הצינור.
9. לשטוף את הצינור (קירות וכדור) עם 100% אצטון קר באמצעות פיפטה פסטר זכוכית (~ 500 μL / צינור). צנטריפוגה ב 3,400 x g במשך 5 דקות ב 4 ^oC.
10. השליכו את ה-supernatant על-ידי היפוך הצינור ו-pipette החוצה את האצטון הנותר. פתחו את המכסה ויבשו את הדגימה באוויר על הספסל למשך כ-20 דקות.
11. המשך לפרופיונילציה או אחסן דוגמאות ב- -80 ^oC עד לשימוש.

6. סבב ראשון של נגזרת

הערה: השימוש בטריפסין לעיכול חלבוני היסטון מוביל לפפטידים קטנים מדי שקשה לזהותם באמצעות תצורות פרוטאומיקה מסורתיות. מסיבה זו, אנהידריד פרופיוני משמש לגזירה כימית של קבוצות ɛ-אמינו של שאריות ליזין ללא שינוי ומונומתיל ליזין. זה מגביל את הפרוטאוליזה של טריפסין לשאריות ארגינין C-terminal. עבור דגימות בלוחות של 96 בארות, מומלץ להשתמש בפיפטות רב-ערוציות ובמאגרים לאיסוף ריאגנטים (איור 2A). הנגזרת מתבצעת גם לאחר העיכול כדי לתייג את ה-N-termini החופשי של הפפטידים המגדילים את ההידרופוביות הפפטידית ובכך את השמירה הכרומטוגרפית בפאזה הפוכה.

1. דגימות החייאה ב-20 μL של 15%-20% אצטוניטריל ב-100 mM אמוניום ביקרבונט (pH 8.0). מערבולת במשך 15 שניות, ולאחר מכן סובב כלפי מטה ב-1,000 x g עבור 30 שניות.
2. אם יש שמונה דגימות או יותר, העבירו כל דגימה שעברה בדיקה חוזרת לצלחת של 96 בארות.
   הערה: אם הדגימות לא הועברו ללוחית של 96 בארות, ניתן להשתמש בפיפטה של ערוץ יחיד בשלבים 6.3-6.7, 7.1-7.5 ו- 8.1-8.5.
3. מתחת למכסה המנוע, הוסיפו 2 μL של אנהידריד פרופיוני באמצעות פיפטה רב-ערוצית. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 5.
4. הוסף במהירות 10 μL של אמוניום הידרוקסיד באמצעות פיפטה רב-ערוצית. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 5.
   הערה: חומצה פרופיונית היא תוצר של התגובה בין אנהידריד פרופיוני לבין אמינים חופשיים מפפטידים ויכולה להפחית את ה-pH של הדגימה. pH 8 ניתן להקים מחדש על ידי הוספת אמוניום הידרוקסיד לדגימה ביחס של 1:5 (v/v).
5. ודא שה- pH הוא 8 באמצעות נייר בדיקת pH. אם pH < 8, התאם על ידי הוספת 1 μL של אמוניום הידרוקסיד. אם pH > 8, התאם על ידי הוספת 1 μL חומצה פורמית או אצטית. כאשר pH > 10, תיוג של שאריות חומצות אמינו אחרות עם pKa גבוה יותר אפשרי.
6. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
7. חזור על שלבים 6.3-6.6. סיבוב כפול של פרופיונילציה היסטון מבטיח יעילות תגובה כמעט מלאה.
8. צלחת יבשה בריק מהירות עד שכל הבארות מיובשות לחלוטין (כ-9 שעות).
9. המשך לעיכול טריפסין או לאחסן דגימות ב-80 ^{מעלות צלזיוס}עד לשימוש.

7. עיכול היסטון

הערה: היסטונים מתעכלים לפפטידים באמצעות טריפסין, אשר חותך בצד הקרבוקסיל של שאריות ארגינין וליזין. עם זאת, מאחר שפרופיונילציה משנה את שאריות הליזין, רק שאריות ארגינין נבקעות (איור 2B).

1. הכן תמיסת טריפסין (25 ng/μL ב-50 mM NH₄HCO₃, pH 8.0). הוסף 20 μL של טריפסין (500 ng) לכל דגימה.
   1. כדי להכין פתרון 50 mM NH₄HCO₃ , לדלל 100 mM NH₄HCO₃ פתרון 1:1 v/v עם מים בדרגה HPLC.
2. ודא ש- pH הוא 8 באמצעות נייר בדיקת pH. אם pH < 8, התאם על ידי הוספת 1 μL של אמוניום הידרוקסיד. אם pH > 8, התאם על ידי הוספת 1 μL של חומצה פורמית או אצטית.
3. לעכל בטמפרטורת החדר לילה או לדגום ב 37 ^oC במשך 6-8 שעות.
4. אם הדבר אפשרי, בדוק את ה- pH לאחר ~ 3 שעות של עיכול, מכיוון שייתכן שהוא ירד. אם pH < 8, התאם על ידי הוספת 1 μL של אמוניום הידרוקסיד.
5. הוסיפו תמיסת טריפסין נוספת של 50 ננוגרם/μL (250 ננוגרם) והמשיכו בעיכול.
6. המשך לסבב השני של פרופיונילציה או אחסן דוגמאות ב- -80 ^oC עד לשימוש.

8. גזירת פפטיד N-termini

הערה: פרופיונילציה של פפטידי היסטון ב-N-terminus שלהם משפרת את שימור הפפטידים הקצרים ביותר על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בפאזה הפוכה (למשל, חומצות אמינו 3-8 של היסטון H3), מכיוון שקבוצת הפרוביונילים מגבירה את ההידרופוביות של הפפטידים.

1. מתחת למכסה המנוע, הוסיפו 2 μL של אנהידריד פרופיוני באמצעות הפיפטה הרב-ערוצית. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 5.
2. הוסף במהירות 10 μL של אמוניום הידרוקסיד באמצעות פיפטה רב ערוצית. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 5.
   הערה: חומצה פרופיונית היא תוצר של התגובה בין אנהידריד פרופיוני לבין אמינים חופשיים מפפטידים, ויכולה להפחית את רמת החומציות לדוגמה. pH 8 ניתן להקים מחדש על ידי הוספת אמוניום הידרוקסיד לדגימה ביחס של 1:5 (v/v).
3. ודא שה- pH הוא 8 באמצעות נייר בדיקת pH. אם pH < 8, התאם על ידי הוספת 1 μL של אמוניום הידרוקסיד. אם pH > 8, התאם על ידי הוספת 1 μL חומצה פורמית או אצטית. כאשר pH > 10, תיוג של שאריות חומצות אמינו אחרות עם pKa גבוה יותר אפשרי.
4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
5. חזור על שלבים 8.1-8.4. סיבוב כפול של פרופיונילציה היסטון מבטיח יעילות תגובה כמעט מלאה.
6. צלחת יבשה בריק מהירות עד שכל הבארות מיובשות לחלוטין (כ-9 שעות).
7. המשך לשלב ההתפלה או אחסן דוגמאות ב- -80 ^oC עד לשימוש.

9. התפלה וניקוי דגימות

הערה: מלחים הנמצאים בדגימה מפריעים לניתוח ספקטרומטריית מסות. מלחים מיוננים גם במהלך אלקטרוספריי ויכולים לדכא אותות מפפטידים. מלחים יכולים ליצור תוסף יוני על פפטידים, מה שגורם לפפטיד הנוסף להיות בעל מסה שונה. זה מפחית את עוצמת האות של הפפטיד ומונע זיהוי וכימות נאותים. ההגדרה להתפלה מתוארת באיור 2C.

1. התחילו לערבב את שרף ה-HLB (50 מ"ג/מ"ל ב-100% אצטוניטריל) על צלחת ערבוב מגנטית.
2. וודאו שיש צלחת איסוף של 96 בארות הממוקמת מתחת לפלטת מסנן הפוליפרופילן בעלת 96 הבארות כדי לאסוף את הזרימה.
3. הוסף 70 μL של מתלי HLB לכל באר לצלחת המסנן. הפעילו בעדינות את השואב כדי למנוע התזות. השליכו את הזרימה-דרך.
4. שטפו את השרף ב-100 מיקרול' של 0.1% TFA. הפעילו בעדינות את השואב כדי למנוע התזות. השליכו את הזרימה-דרך.
5. בצעו החייאה של כל דגימה ב-100 μL של 0.1% TFA. בדוק את ה- pH; זה צריך להיות ~ 2 - 3.
6. טען כל דגימה לכל באר. הפעילו את השואב בעדינות כדי למנוע התזה. השליכו את הזרימה-דרך.
7. יש לשטוף עם 100 μL 0.1% TFA. הפעילו את השואב בעדינות כדי למנוע התזה. השליכו את הזרימה-דרך.
8. החליפו את צלחת הקולקציה בצלחת איסוף חדשה בת 96 בארות.
9. הוסף 60 μL של 60% אצטוניטריל / 0.1% TFA לבאר. הפעילו את השואב בעדינות כדי למנוע התזה. אספו את הזרימה והתייבשו בריק מהיר.
10. המשך ל- LC-MS/MS או אחסן דוגמאות ב- -80 ^oC עד לשימוש.

10. ניתוח פפטיד היסטון באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה

1. הכן את השלבים הניידים כך שיפעלו על הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים (HPLC). שלב A נייד (MPA): 2% אצטוניטריל ברמת HPLC + 0.1% חומצה פורמית. שלב B נייד (MPB): 80% אצטוניטריל ברמת HPLC + 0.1% חומצה פורמית.
2. תכנת את שיטת HPLC באופן הבא: (1) 4%-34% MPB במשך 30 דקות; (2) 34%-90% MPB במשך 5 דקות; ו-(3) איזוקרטי של 90% MPB למשך 5 דקות. השתמש במאפייני העמודה המומלצים הבאים: C_{18 3} μm חומר אריזה, קוטר פנימי של 75 מיקרומטר, אורך 20-25 ס"מ. הגדר את קצב הזרימה ל- 250-300 nL/min עבור ננו-עמודים בקוטר פנימי של 75 מיקרומטר.
   1. במקרה שה- HPLC אינו מתוכנת להפוך את שיווי המשקל של העמודות לאוטומטי לפני טעינת הדגימה, כולל (4) 90%-4% MPB במשך דקה אחת ו- (5) MPB איזוקרטי של 4% מעל 10 דקות.
3. תכנת את שיטת רכישת הטרשת הנפוצה.
   1. ודא שהמכשיר מבצע סריקת MS מלאה אחת בתחילת כל מחזור עבודה. מכשור ברזולוציה גבוהה (למשל, אורביטראפ או אנלייזרים של זמן טיסה) מומלץ, בשל דיוק המסה שניתן להשתמש בו במהלך חילוץ האותות. עם זאת, ניתן להשתמש במכשור ברזולוציה נמוכה גם כפי שתואר קודם לכן^27,28.
   2. ודא שסריקת הטרשת הנפוצה המלאה מלווה ב-16 אירועי סריקת MS/MS, שלכל אחד מהם רוחב בידוד של 50 m/z, המשתרע על פני טווח m/z של 300-1100. לדוגמה, הסריקה הראשונה צריכה לבודד אותות ב 300-350 m/z, השני ב 350-400 m/z, וכו '. במידת האפשר, רכשו סריקות MS/MS גם ברזולוציה גבוהה, אך רזולוציה נמוכה יותר בהשוואה לסריקת הטרשת הנפוצה המלאה מספיקה (בשל המסות הקטנות יותר של יוני שבר בהשוואה ליונים שלמים).
   3. שיטת HPLC תיצור אותות כרומטוגרפיים עם רוחב שיא של ~ 3-40 שניות; כדי להבטיח כימות אותות תקין, ודא שספקטרומטר המסה מבצע לפחות 10 מחזורי עבודה לכל שיא כרומטוגרפי (כלומר, מחזור עבודה של 3 שניות או יותר).
   4. אם אתה משתמש במנתח מסה בסגנון השמנה (orbitrap, מלכודת יונים), ודא שמגבלת זמן הזרקת היונים מוגדרת <200 אלפיות השנייה; עבור מנתחים אחרים (quadrupole, זמן הטיסה), זה לא בעיה בשל זמן הסריקה המהיר יותר שלהם. ייתכן שתידרש בדיקה ראשונית.
      הערה: פרטים נוספים על שיטות טרשת נפוצה לניתוח פפטיד היסטון ניתן למצוא בהפניות הבאות 27,28,29.
4. דגימת Resuspend ב-10 μL של MPA, המתאימה ל-~1 מיקרוגרם/μL של דגימת היסטון מעוכלת. כמות הטעינה המדויקת אינה קריטית (גם לא טריוויאלית להערכה) אם כל הדגימות באצווה נטענות באמצעות דילולים ונפחים דומים.
5. טען 1 μL של דגימה לעמודת HPLC.
6. הפעל את שיטת LC-MS/MS המתוכנתת בשלבים 10.1-10.3.

11. ניתוח נתונים

1. יבא את קבצי הנתונים הגולמיים של MS לתוכנה המיועדת לבצע שילוב אזור שיא.
   הערה: EpiProfile ^30,31 משמש במחקר הנוכחי ומומלץ בדרך כלל, מכיוון שהוא מותאם למיצוי אמין באזור השיא של פפטידי היסטון ידועים. עם זאת, תוכנות אחרות הזמינות באופן חופשי לכרומטוגרפיית יונים שחולצו כגון Skyline^32,33 מתאימות.
2. חישבו את השפע היחסי של פפטיד נתון (לא שונה) כשטח של פפטיד יחיד חלקי השטח הכולל של הפפטיד בכל צורותיו שהשתנו. תוכנות כגון EpiProfile^30,31 כבר מכילות ספריות של פפטידים להפקת אותות. אחרת, צרו ספרייה של פפטידים בעלי עניין באופן ידני או באמצעות זיהוי פפטידים באמצעות צינורות פרוטאומיים שגרתיים.

בפרוטוקול זה, הספרואידים HepG2/C3A טופלו ב-20 mM NaBut וב-10 mM NaSuc, שניהם השפיעו על הרמות הגלובליות של PTMs היסטון (איור 3A). לאחר מכן זוהו וכומתו PTMs של Histone ברמת השאריות הבודדות באמצעות רכישת MS/MS (איור 3B).

כאשר דגימות מופעלות בשכפולים, ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי כדי להעריך את העשרת שינוי הקיפול של PTM בין דגימות, כמו גם את יכולת השחזור של התצפית. הנתונים המוצגים מראים כי פפטידים שעברו שינוי עם אצטילציות מועשרים בספרואידים שטופלו ב-NaBut לעומת בקרה (איור 3C), בעוד שבדגימות שטופלו ב-NaSuc יש שפע יחסי גבוה יותר של פפטידי היסטון שעברו שינוי עם תמצית ליזין (איור 3D). חישובים אלה נעשו בתוכנית גיליון אלקטרוני כמפורט בפרסום נפרד³⁴. עלייה כוללת של שינוי היסטון נתון יכולה להיות מיוצגת טוב יותר בחלקות מכ"ם, שבהן תצפית על שפע עולמי גבוה יותר של שינוי מסוים הופכת לאינטואיטיבית יותר, אפילו תוך שמירה על מידע מפורט על אתרי השינוי שנותחו (איור 3E,F).

פרוטוקול זה מייצר פפטיד משאריות חומצות האמינו היסטון H3 9-17, הכוללות את השאריות המשתנות לעתים קרובות K9, S10 ו-K14. הנתונים המוצגים מצביעים על כך שהטיפול ב-NaBut מעלה את הרמות של H3K14ac, אך רק על היסטונים ששונו במשותף עם H3K9me2 ולא עם H3K9me3 (איור 4A). ניתן לייצג את תדירות הדו-קיום בין שני שינויים באופן אינטואיטיבי יותר כגרף טבעתי, שבו הצמתים מייצגים שינויים בודדים בעוד שעובי קווי המחבר מייצג את תדירות הדו-קיום בין שני ה-PTMs (איור 4B). לעתים, תדירות הדו-קיום אינה מושפעת, אך נתונים המיוצגים כמגרשי בר עלולים להטעות. לדוגמה, הנתונים המיוצגים באיור 4A מצביעים על כך שהשילוב H3K9me2K14ac נפוץ יותר בטיפול NaBut מאשר בשליטה. זה נכון, אבל שילוב נתון זה הוא השכיח ביותר ללא קשר לטיפול. איור 4B מראה בבירור ש-H3K9me2K14ac ו-H3K9me3K14ac הם הדפוסים הקומבינטוריים השכיחים ביותר ללא קשר לטיפול (עובי הקו), אך הרמות הגלובליות של H3K14ac (צומת) הן מה שבאמת משתנה בניסוי.

פרוטוקול זה מייצר פפטיד משאריות היסטון H4 4-17, הכוללות שאריות ניתנות לשינוי במיקומים K5, K8, K12 ו-K16 (בעיקר על ידי אצטילציות). כאשר משווים בין שליטה לטיפול ב-NaBut, ניתן להבחין בעלייה בצירופים של אצטילציות על-ידי ייצוג נתונים כ,, למשל, ענני מילים (איור 4C). ייצוג זה מדגיש בבירור כי הגרסה ללא שינוי של היסטון H4 נפוצה ביותר בדגימת הבקרה, בעוד שספרואידים המטופלים ב- NaBut מועשרים בפרוטיאופורמים אציטיים H4 כפולים, משולשים ומרובעים. עם זאת, ענני מילים מוגבלים בהצגת ערכים מדויקים; יש לבטל את השפע היחסי של קוד היסטון על ידי גודל הטקסט, אשר עשוי להיות מוערך באופן לא מדויק. לכן, ניתן להשתמש בדיאגרמות Venn או מקבילות מודרניות יותר כגון ייצוג UpSetR³⁵ כדי להציג את הכימות המדויק של PTMs histone הקיימים יחד (איור 4D,E). הנתונים המוצגים מדגישים שוב כי שילובים נבחרים של אצטילציות על היסטון H4 נפוצים יחסית יותר בטיפול NaBut בהשוואה לשליטה.

איור 1: זרימת עבודה לניתוח פפטיד היסטון של ספרואידים תלת-ממדיים. תאי HepG2/C3A גדלים לראשונה בתרבית דו-ממדית עד שהם מגיעים ל-80% מפגש. לאחר מכן התאים מועברים לביוריאקטור שיווי משקל ומונחים בתוך אינקובטור הקלינוסטאט, שם הם יסתובבו ב-10-11 סל"ד כדי ליצור ספרואידים. לאחר 18 יום, הספרואידים מטופלים עם 20 mM NaBut או 10 mM NaSuc והם נקטפים לאחר נקודות הזמן המתאימות שלהם. גרעינים מבודדים מהתאים ומיצוי היסטון מבוצע עם 0.2 M H₂SO₄. לאחר מכן מתבצעת גזירת היסטון עם אנהידריד פרופיוני לפני ואחרי עיכול טריפסין כדי להבטיח שמירה על הפפטידים הקצרים המתקבלים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית. דגימות מותפלות ולאחר מכן מופעלות בשיטת LC-MS/MS המוזכרת בשלב 10, והנתונים המתקבלים מנותחים כמתואר בשלב 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: התקנה של שלבי פרופיונילציה והתפלה. (A) פרופיונילציה מתבצעת במכסה אדים וכל הרכיבים ערוכים כך שניתן לבצע את השלבים ברצף מהיר. (B) סכמות של הסיבוב הראשון של פרופיונילציה, עיכול טריפסין, וסבב שני של פרופיונילציה על זנב היסטון H3.1. (C) ההתפלה מתבצעת על הספסל באמצעות סעפת ואקום בעלת 96 בארות ולוחית מסנן פוליפרופילן בעלת 96 בארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: ייצוג של שינויי היסטון בודדים. (A) גרף עמודות המציג את השפע היחסי של שינויי היסטון גלובליים נפוצים בבקרה ובטיפול (20 mM NaBut או 10 mM NaSuc) HepG2/C3A spheroids. (B) גרף עמודות המציג את השפע של PTMs היסטון יחיד המתרחשים על שאריות 9-17 של פפטיד היסטון H3 (KSTGGKAPR) בבקרה ובטיפול (20 mM NaBut או 10 mM NaSuc) כדוריות HepG2/C3A. (ג,ד) חלקות הר געש מראות את השינוי המתקפל והמשמעות של ביטוי דיפרנציאלי של PTMs פפטיד היסטון לאחר טיפול ב-20 mM NaBut (C) או 10 mM NaSuc (D). נקודות כחולות וירוקות מודגשות מייצגות שאריות אצטילטיות ותמציתיות, בהתאמה. (ה,ו) חלקות מכ"ם מראות את השפע של אצטילציה של פפטיד היסטון יחיד (E) או תמציתיות (F) לאחר טיפול ב-20 mM NaBut או 10 mM NaSuc בהתאמה בהשוואה לבקרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: ייצוג של שינויי היסטון קיימים יחד. (A) גרף עמודות המציג את השפע של PTMs היסטון קומבינטוריים המתרחשים על שאריות 9-17 של histone H3 (KSTGGKAPR) בבקרה ובטיפול (20 mM NaBut או 10 mM NaSuc) כדוריות HepG2/C3A. (B) גרפים טבעתיים המראים את הקשר בין PTMs היסטון קומבינטוריים על שאריות 9-17 של היסטון H3 (KSTGGKAPR) בבקרה וטופלו (20 mM NaBut) כדוריות HepG2/C3A. עוצמת צבע הצומת תואמת את השפע של PTM יחיד בתוך קבוצת הטיפול שלו, בעוד שעובי הקו מתאים לתדירות המופע המשותף של PTM. (C) ענני מילים המציגים את התדירות של PTMs היסטון קומבינטוריים על שאריות histone H4 בשליטה וטופלו (20 mM NaBut) כדוריות HepG2/C3A. גודל הטקסט תואם את השפע של ה- PTM הקומבינטורי שצוין. (ד,ה) דיאגרמת Venn המייצגת את התדירות של שינויים קיימים משותפים בשאריות פפטידיות Histone H4 4-17 בשליטה ודגימות מטופלות של 20 mM NaBut. הנתונים מוצגים באמצעות ShinyApp UpSetR³⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה משלימה 1: רשימת פפטידים שזוהו באמצעות פרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

הניתוח של PTMs היסטון שונה במהותו מצינור ניתוח הפרוטאומיקה הטיפוסי. לרוב ה-PTMs של היסטון עדיין יש פונקציות ביולוגיות אניגמטיות; כתוצאה מכך, ביאורים כגון Gene Ontology או מסדי נתונים של מסלולים אינם זמינים. קיימים מספר משאבים המקשרים שינויי היסטון עם האנזים האחראי על הקטליזה שלהם או חלבונים המכילים תחומים הקושרים את ה-PTMs האלה (למשל, HISTome³⁶). כמו כן, ניתן לשער את המצב הכולל של הכרומטין כאשר רמות גלובליות של PTMs היסטון מוסדרות. לדוגמה, עלייה כוללת של אצטילציה היסטון או אצילציות אחרות כמו תמציתינילציה קשורה בדרך כלל לדה-עיבוי כרומטין^37,38.

ניתוח טרשת נפוצה מספק מידע מפורט יותר על שינויים אלה, כגון הלוקליזציה המדויקת שלהם על רצף חומצות האמינו. בפרוטוקול זה, רכישת MS/MS משמשת לזיהוי וכימות של PTMs היסטון, אשר יכולים להיות קריטיים לפרשנות ביולוגית. לדוגמה, טרימתילציה על ליזין 4 של היסטון H3 (H3K4me3) מועשרת על מקדמי גנים מתומללים באופן פעיל³⁹, בעוד שאותו שינוי על ליזין 9 (H3K9me3) מסמן את ההטרוכרומטין המרכיב את הטרוכרומטין⁴⁰. שינויי היסטון משמשים כיום כסמנים ביולוגיים במחלות ספציפיות; ככזה, ניתוח היסטון יכול לשמש לחקר פתולוגיה של מחלות בנוסף לתגובה לטיפול (למשל, עם תרופות אפיגנטיות)^41,42.

מאתגר יותר לייצג באופן חזותי אינטראקציות בין PTMs מרובים לעומת PTMs בודדים. בעוד שתרשימים קיימים כגון גרפים טבעתיים יכולים להראות את תדירות הדו-קיום של שני PTMs, הם אינם יכולים לייצג את תדירות הדו-קיום בין יותר משני PTMs בכל פעם, מכיוון שהדבר ידרוש ייצוג תלת-ממדי של הרשת. מסיבה זו, ייצוגים אחרים עשויים להיות מתאימים יותר כדי להדגיש שינויים בקודי היסטון כאשר שלושה PTMs או יותר נחשבים. באופן כללי, גיוון ייצוג הנתונים מציע סיכויים גבוהים יותר לצפות בשינויים משמעותיים בין דגימות. פרוטוקול זה מציג דוגמאות של איורים שונים להצגת תקנות של PTMs היסטון ו- PTMs קיימים משותפים.

אף על פי שפרוטוקול זה מייצר פפטידי היסטון קטנים יחסית עקב עיכול טריפסין (כ-4-20 חומצות אמינו), פפטידים נבחרים מכילים מספר שאריות הניתנות לשינוי. הניתוח של פפטידים אלה מאפשר כימות של תדרי דו-קיום של PTMs, אשר יכול לחשוף מידע חשוב על אילו סימני היסטון קומבינטוריים מווסתים במערך נתונים נתון. יש לציין כי אין שלבים במהלך הכנת הדגימה שבהם מתבצע כימות של היסטונים. ישנן ארבע סיבות לכך: (1) לטריפסין יש מגוון רחב של פעילויות וניתן להשתמש בו במגוון רחב של יחסי אנזים לדגימה (1:10-1:200). גם כאשר התשואה הניסיונית של היסטונים שחולצו שונה מזו הצפויה, בעיות בעיכול לא נתקלו באמצעות פרוטוקול זה. (2) פרוטוקול זה מיועד לכמויות זעירות של חומר, כאשר כימות היסטון עשוי להיות קשה לביצוע בשל חוסר רגישות. (3) על-ידי שימוש בריכוז טריפסין קבוע ללא קשר לכמות חומר ההיסטון, אנו יכולים להשתמש בפפטידים טריפטיים (כמו פפטידים של טריפסין) כדי למדוד את ביצועי הכרומטוגרפיה. שינויים קלים בתפוקת הדגימה ינומלו על ידי תוכנת ניתוח נתונים (שלב 11), המשתמשת בכל האותות (שלא שונו) עבור פפטיד נתון כמכנה במהלך תהליך הנורמליזציה. (4) לבסוף, הערכת חסר דרמטית של כמות חומר ההתחלה עלולה ליצור בעיות של עומס יתר על העמודה הכרומטוגרפית nanoLC. עם זאת, ביצוע שלב ההתפלה כפי שצוין בפרוטוקול זה מונע בעיה זו להתרחש. במקרה של כמויות מופרזות של חומר התחלתי (למשל >100 מיקרוגרם), תוחרג מגבלת הקיבולת של שרף ההתפלה, וכל דגימה עודפת תישטף במהלך שלב ההעמסה.

חשוב לציין שלא כל הפפטידים שזוהו בניתוח זה הודגשו באיור 3 ובאיור 4. כמו כן, לא כל שינויי היסטון ניתנים לזיהוי באמצעות שיטות הכנה ורכישה ספציפיות אלה של דגימות. טבלה משלימה 1 מסופקת כדי לפרט את כל האותות הפפטידיים המופקים באמצעות הצינור המתואר. כמה שינויים ידועים אינם מפורטים בטבלה, שכן הכנת הדגימה המתוארת אינה מתאימה לזיהוים. דוגמאות בולטות הן פפטידים יוביקוויטיניליים מהיסטון H2A ו-H2B, וזרחון של היסטון H2A. X (סמן כללי של נזק לדנ"א). הסיבה לכך היא שהפרופיונילציה של הפפטידים הקשורים ל-PTMs אלה מובילה לפפטידים ארוכים מדי, שאינם מתאימים לכרומטוגרפיית C18 ולשיטת גילוי הטרשת הנפוצה המתוארת. שינויים אחרים הנמצאים בספרות אך אינם קיימים בטבלה משלימה 1 הם שינויים בשפע נמוך מאוד (כיום ניתן לזהותם רק באמצעות טרשת נפוצה לאחר אסטרטגיות העשרה כגון מיצוי חיסוני או טיפול ספציפי בתאים), כגון לקטילציה⁴³ או סרוטונילציה⁴⁴. גם שינויים בהיסטון עם תזוזות מסה בלתי צפויות הנגרמות על ידי פילמור או קשירת קוולנטית הטרוגנית לרצף ההיסטון אינם נלקחים בחשבון (למשל, פולי-ADP-ריבוזילציה⁴⁵ וסקיצה⁴⁶). בנוסף, פרוטוקול זה משתמש ב-NaSuc וב-NaBut כדי לטפל בספרואידים HepG2/C3A, אך ניתן לשנות אותו לשימוש עם תרופות/משנים אפיגנטיים אחרים וסוגי תרביות תאים דו-ממדיות/תלת-ממדיות.

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

מעבדת סידולי מכירה בהכרת תודה לקרן לחקר הלוקמיה (מענק מחקר לחוקר חדש של הוליס בראונשטיין), AFAR (פרס Sagol Network GerOmics), לדירפילד (פרס Xseed), ל-Relay Therapeutics, ל-Merck ולמשרד המנהל של NIH (1S10OD030286-01).