Method Article
Мы описываем протокол с использованием флуоресценции на месте гибридизации (FISH) для визуализации нескольких герпесвиральных РНК в литически инфицированных человеческих клеток, либо в подвеске или приверженцев. Этот протокол включает в себя количественную оценку флуоресценции, производящей нуклеоцитоплазмическое соотношение и может быть расширен для одновременной визуализации принимающих и вирусных белков с иммунофлуоресценцией (ИФ).
Механистический анализ приходит из тщательного изучения и количественной оценки конкретных РНК и белков. Относительное расположение этих биомолекул по всей клетке в определенное время может быть захвачено с флуоресценцией на месте гибридизации (FISH) и иммунофлуоресценции (IF). Во время литической герпесвирусной инфекции вирус захватывает клетку-хозяина, чтобы преимущественно выражать вирусные гены, вызывая изменения в морфологии клеток и поведении биомолекул. Литические деятельности сосредоточены на ядерных заводах, называется вирусных репликации отсеков, которые заметны только с FISH и IF. Здесь мы описываем адаптируемый протокол РНК FISH и IF методы для Саркомы Апоши связанных герпесвирус (KSHV) инфицированных клеток, как приверженцев и в подвеске. Метод включает в себя шаги по разработке специфических антисмысловых олигонуклеотидов, двойной РНК FISH, РНК FISH с IF, а также количественные расчеты интенсивности флуоресценции. Этот протокол был успешно применен к нескольким типам клеток, неинфицированных клеток, скрытых клеток, литических клеток, временных курсов и клеток, обработанных ингибиторами для анализа пространственно-временной деятельности конкретных РНК и белков как от хозяина человека, так и КШВ.
В их литической (активной) фазе, герпесвирусы захватывают клетку-хозяина, вызывая изменения в морфологии клеток и локализации биологических молекул, для производства вирионов. Основой операций является ядро, где двухцепочечный геном ДНК вирусного реплицируется и упакован в белковую оболочку, называемую капсидом1. Для начала вирус выражает свои собственные белки, угон принимающей машины и предотвращения экспрессии несущественных генов хозяина, процесс, называемый эффект выключения хозяина. Большая часть этой деятельности локализована на конкретные 4 ",6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) свободных ядерных регионов, называемых вирусных репликации отсеков, состоящий из как принимающих и вирусных белков, РНК, и вирусной ДНК2. Ячейка капитально отремонтирована, чтобы обеспечить пространство и ресурсы для репликации отсеков и, таким образом, сборки вирусных капсидов. После того, как капсид выходит из ядра, как капсид окутан цитоплазмой для производства мембраны связанных вирусной частицы, также известный как вирион, неясно. Понимание локализации и пространственных сдвигов как хоста, так и вирусных биомолекул во время литической фазы обеспечивает более глубокое механистическое понимание расположения отсека репликации, эффекта выключения хозяина, пути выхода из virиона и других процессов, связанных с герпесвирусной инфекцией и репликацией.
В настоящее время лучшим методом обнаружения и изучения этих изменений является визуализация белков и РНК в инфицированных клетках с иммунофлуоресценцией (ИФ) и флуоресцентной гибридизации на месте (FISH), соответственно. Использование временного курса с помощью этих методов показывает локализацию биомолекул в ключевых точках литической фазы или просто пространственно-временных данных. FISH и IF дополняют другие биохимические методы, такие как ингибирование клеточного процесса (например, ингибирование репликации вирусной ДНК), RT-qPCR (цепная реакция полимеразы в реальном времени), секвенирование РНК, северные помарки, масс-спектрометрия, западная блоттинг и анализ производства вирусной ДНК, который может обеспечить более глобальную картину клеточной деятельности.
Мы разработали стратегии RNA FISH для изучения продуктов РНК из конкретных генов и вычислительного анализа, который количественно вычисляет нуклеоцитоплазмическое соотношение конкретного генного продукта. Подготовка образца, измененная из предыдущих публикаций Steitz и коллегами3,4,относительно проста и может быть использована как для приверженцев, так и для подвесных клеток. Протокол также адаптируется для одновременного использования нескольких стратегий РНК FISH (двойная РНК FISH) или RNA FISH со стратегиями IF. Разработка конкретной стратегии FISH является сложной задачей, но предложения по улучшению успеха изложены. Анализ данных, описанный здесь, является количественным, если используются флуоресцентные бусы и сильные маркеры границ отсека, и дает дополнительное представление о микрографах, понимание, которое устраняет предвзятость наблюдения. Подробный протокол предназначен как для скрытых, так и для литических клеток, инфицированных саркома-ассоциированным герпесвирусом Капоши (KSHV) и может быть использован с неинфицированными клетками или клетками, инфицированными другими герпесвирусами5. Методы количественной оценки применимы к исследованиям по нуклеоцитоплазматическим сдвигам или перелокализации между субклеточными отсеками в большинстве клеток.
1. Дизайн флуоресценции на месте (FISH) анти-чувство олигонуклеотидов для обнаружения конкретных герпесвиральных стенограммы
2. Олигонуклеотид и клеточная подготовка
3. Фиксация, иммунофлуоресценция (необязательно), гибридизация и визуализация вирусных РНК
4. Количественная оценка изображений FISH и IF для выделения субклеточной локализации и определения нуклеоцитоплазмического соотношения флуоресценции
Методы FISH и IF, описанные в данной рукописи, показаны на рисунке 1 наряду с количественной оценкой результатов по линейным следам флуоресцентной интенсивности. Представленные здесь результаты являются полуколичественными и дают представление о локализации, а не в сравнении интенсивности различных флуоресцентных пятен, поскольку эксперименты не включали флуоресцентную биса в подготовку слайда. На рисунке 1 также указывается, что цитоплазматические и ядерные области и их соотношения различны для скрытых и литических кШВ-инфицированных клеток. Таким образом, область контролируется в нуклеоцитоплазматических соотношении продемонстрированы на рисунке 2. Рисунок 2 подтверждает расчет, описанный в данной рукописи, на нуклеоцитоплазмическое соотношение с использованием ядерного контроля, вирусной полиаденилатной ядерной (PAN) РНК и цитоплазмического контроля, принимающей GAPDH mRNA. Рисунок 3 показывает, что, когда репликация ДНК KSHV ингибируется в литической фазе с помощью либо фосфоноацетической кислоты (Doxy и PAA) или цидофовира (Doxy и Cido), ранняя транскрипт ORF59-58 смещается в преимущественно цитоплазматическую локализацию. Микрографы и два метода количественной оценки на рисунке 3 поддерживают этот результат и показывают, что PAN РНК локализуется на конкретных ядерных объектах, несмотря на ингибирование репликации вирусной ДНК и изменения, наблюдаемые для ранней стенограммы ORF59-58.
Рисунок 1: Линии следы флуоресцентной интенсивности выявить тонкости флуоресценции в situ гибридизации (FISH) KSHV стенограммы и иммунофлуоресценции (IF) КШВ репликации отсеков. (A-B) Конфокальные изображения TREx RTA (тетрациклина индуцируемых вирусной репликации и транскрипции активатор белка) BCBL-1 клетки12, которые были индуцированы в литическую фазу в течение 24 ч с доксициклина (Докси). Шкала бар указывает 10 мкм. (A) Флуоресценция на месте гибридизации (FISH) для вирусных РНК (зеленый) и иммунофлуоресценции (IF) для вирусного одноцепочечного днк связывающего белка (ORF6/SSB) (красный), компонент KSHV реплики отсеков, показывают, что вирусные транскрипты локализуются в цитоплазме, ядре, и в ядерных очагах за пределами обогащенных ORF6/SSB областей, также известных как отсеки репликации. Анти-SSB антитела10 был разбавлен до 1:200 в 0,4% BSA/1x PBS и обнаружены с 1:500 анти-кролик Alexa Fluor 594 вторичного антитела в 0,4% BSA/1x PBS. Все анти-чувство олигонуклеотиды, используемые в течение этого исследования, приведены в таблице 1. Обнаружение ORF59-58 mRNA включает в себя как бицистроник, так и моноцистронные транскрипты. Однако, в KSHV-инфицированных АО-1 клеток, моноцистроника мРНК, по крайней мере в 18 раз менее обильные, чем бистроник стенограммы и, вероятно, способствует лишь незначительную часть общего флуоресцентного сигнала наблюдается13. Кроме того, один из PAN РНК олигонуклеотиды (SB88) может также обнаружить вирусный транскрипт для K7. Сигнал от обнаружения K7 не будет столь значительным по сравнению с сигналом обнаружения KSHV PAN РНК, который присутствует на почти 80% всех полиаденилатных РНК в литическом KSHV-инфицированной ячейке14. Кроме того, один из четырех антисмысловых олигонуклеотидов (tkv13) при обнаружении K8.1 mRNA способен связываться с несколькими изоформами K8.1 и другими изоформами близлежащих открытых кадров чтения (ORF). Сигнал FISH только от олигонуклеотида tkv13 недостаточен (данные не показаны). Комбинированная гибридизация четырех олигонуклеотидов и их связывание на одной и той же транскрипте, вероятно, обеспечивает наблюдаемый сильный сигнал. Белые линии фланговых ячеек в (A) изображают линейный путь интенсивности флуоресценции для FISH и IF сигналов, построенных в (C). (B) Цифровое увеличенное изображение клеток в (A) в окружении белых линий. Для простоты синий канал DAPI опущен. (C) Сюжеты показывают относительную флуоресцентную интенсивность для каждого пятна вдоль той же линии: SSB (красный), вирусные стенограммы (зеленый; стенограмма, указанная на участке), и DAPI (синий). Затененные области указывают на области, уменьшенные DAPI, которые соответствуют отсекам репликации вируса или обогащенным SSB/ORF6 участкам. (D) Отношение ядерной области к клеточной области изменения и, таким образом, соотношение интенсивности флуоресценции используется во всем была нормализована для области. (E) Ядерные и клеточные области, измеренные для TREx RTA BCBL-1 клеток с и без прохождения литической активации. Статистически значимые изменения наблюдаются по сравнению с неиндуцированными клетками. Участки коробки и усы представляют 10 и 90 процентилей. Рисунок перепечатан с небольшими изменениями из Vallery, Уизерс, и коллеги15 под лицензией Creative Commons Атрибуция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Управление ядерными и цитоплазматическими стратегиями FISH подтверждают метод расчета нуклеоцитоплазмического соотношения. (A) FISH для хозяина GAPDH мРНК (красный) и для вирусных полиаденилаядерных (PAN) lncRNA (зеленый) и DAPI ядерного окрашивания (синий) являются положительными FISH контроля для расчета метода определения нуклеоцитоплазматического соотношения. Host GAPDH mRNA является канонической целью эффекта выключения хоста KSHV и деградирует при литической индукции, как показано здесь. (B) Интенсивность флуоресценции вдоль линии, указанной белыми линиями, фланговых литические клетки в (A). DAPI (синий), PAN РНК (зеленый), и GAPDH мРНК (красный). Затененные области определены на рисунке 1. (C) Количественная оценка интенсивности флуоресценции клеток, представленных (A) (n No 150 для каждого образца GAPDH, n No 75 для образцов ORF59-58 или K8.1) была выполнена для трех биологических репликаций клеток, показанных на рисунке 2 и рисунке 3 . P-значения: :gt;0.05 (нс), lt;0.05 (яп.), «lt;0.005» (яп.) и «lt;0.0005»). (D) Представитель Северной подьеРН от TREx RTA BCBL-1 клетки 24 ч после Докси. Участки коробки и усов представляют 10 и 90 процентиль. Рисунок перепечатан с небольшими изменениями из Vallery, Уизерс, и коллеги15 под лицензией Creative Commons Атрибуция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Следы линии и вычисление нуклеоцитоплазмических соотношений показывают сильный сдвиг к цитоплазме для раннего литического транскрипта ORF59-58 при ингибировании репликации вирусной ДНК. Клетки TREx RTA BCBL-1 лечились от 24 ч без лекарств (Unind), доксициклина только (Doxy), или с доксициклином и одним ингибитором репликации герпесвирусной ДНК, фосфоноацетической кислоты (Doxy) или сидофовир (Doxy и Cido). Панели(A-C) показывают данные из образцов, собранных из трех биологических репликаций. (A) значения qPCR для вирусной внутриклеточной ДНК во время ингибирования репликации вирусной ДНК были нормализованы к количеству промоторной ДНК гена ГАПДГ. (B) Северная поместье (слева) и количественная (справа) показывают общий уровень РНК во время ингибирования репликации вирусной ДНК. Неиндуцированные уровни всех РНК были необнаружимы. (C) Представитель FISH изображения для вирусных ORF59-58 стенограммы (зеленый) и PAN РНК (красный) при ингибировании вирусной репликации ДНК. DAPI (синий) был ядерного пятна. (D) Количественная оценка интенсивности флуоресценции клеток, представленных (C) (n и 75 каждый) была сделана на биологических триплицикатах. (E) Интенсивность флуоресценции вдоль линий, нарисованных между клетками, указанными белыми линиями в (C) показаны: DAPI (синий), PAN RNA (красный) и ORF59-58 mRNA (зеленый). P-значения: :gt;0.05 (нс), lt;0.05 (яп.), «lt;0.005» (яп.) и «lt;0.0005»). Последовательности всех олигонуклеотидов в данном исследовании приведены в таблице 1. Участки коробки и усы представляют 10 и 90 процентилей. Рисунок перепечатан из Vallery, Уизерс, и коллеги15 под Creative Commons Атрибуция лицензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Северный Олигос | |||||||
Олиго Но. | Ген | Последовательности | Позиция внутри гена | Позиция с эталонным геномом NC009333.1 (числа не отражают направление или нить) | |||
KORF50 | KSHV RTA/ORF50 | CGCATTGCGGTGGTGAAATTGCTGG | от 1284 до 1309 | от 73936 до 73961 | |||
JBW249 | KSHV SOX/ORF37 | ТААККТАКТАККАКАКАКАКАКЕТЦКАК | от 262 до 291 | от 57633 до 57662 | |||
tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCTATAGAATCGGGAACCT | от 941 до 967 (ORF59 ORF) | от 95879 до 95905 | |||
tkv13 | KSHV K8.1 | ААГГКАСТАСТАСТАСТАСТАСТАГАГКККАКАГГАТТКГГГГААТГГААТ | от 16 до 57 | от 76029 до 76070 | |||
SB2 | КШВ ПАН РНК | АКАААТККККККАКТТГТГГКККК | от 664 до 687 | от 29496 до 29519 | |||
Рразе P | Человек RNase P | TGGGCGGAGGAGAGTCTG | от 319 до 339 | N/A | |||
Зонды FISH | |||||||
Олиго Но. | Ген | Последовательности | |||||
SB2 | КШВ ПАН РНК | АКАААТККККККАКТТГТГГКККК | от 664 до 687 | от 29496 до 29519 | |||
SB85 | КШВ ПАН РНК | CGCTGCTTTTTTTCACATT | от 373 до 392 | от 29205 до 29224 | |||
SB88 | КШВ ПАН РНК | GTGAAGCGGCAGCCAAGGTGTACTGG | От 1 до 22 | от 28830 до 28854 | |||
tkv13 | KSHV K8.1 | ААГГКАСТАСТАСТАСТАСТАСТАГАГКККАКАГГАТТКГГГГААТГГААТ | от 16 до 57 | от 76029 до 76070 | |||
tkv14 | KSHV K8.1 | TGATATTAGGCGGTCAGTCTGTGTGTGTGTGTGGGGGGGGGGA | от 377 до 414 | от 76390 до 76427 | |||
tkv15 | KSHV K8.1 | GTAAGGTTACGCTTTCCCACACCGACGGTTTACCC | от 461 до 500 | от 76474 до 76513 | |||
tkv16 | KSHV K8.1 | GGACAAGTCCCАГАГААТААААККАККАПКАПКАТТАТАТГГ | от 688 до 725 | от 76701 до 76738 | |||
tkv376 | KSHV ORF59-58 | ТААТГГТКАТКАТТГАТКТКТГАТТГАТТГАТТ | от 54 до 79 | от 96767 до 96792 | |||
tkv377 | KSHV ORF59-58 | ГККГГГГККККАКТАКТККГТГТТТТТ | от 93 до 122 | от 96724 до 96753 | |||
tkv378 | KSHV ORF59-58 | AAGGCTATGCGCGCGTCGAGTACATTCGCA | от 300 до 329 | от 96517 до 96546 | |||
tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCTATAGAATCGGGAACCT | от 941 до 967 | от 95879 до 95905 | |||
tkv380 | KSHV ORF59-58 | АААГАГТГТГААКТАКАГГКЦКТТ | от 1289 до 1315 | от 95531 до 95557 | |||
tkv381 | KSHV ORF59-58 | АААКАКТГЦКГКГКАГКАТКАТЦК | от 1423 до 1450 | от 95396 до 95423 | |||
tkv382 | KSHV ORF59-58 | TACCTGTGTACTTGGGGGCGCCTGATACAC | от 1571 до 1602 | от 95244 до 95275 | |||
tkv383 | KSHV ORF59-58 | ГГГГТЦАГЦАГЦЦААТАСТАГГАААААКТКАКАКАГЯГГ | от 2136 до 2173 | от 94673 до 94710 | |||
Стелларис | GAPDH | Сделано Stellaris | N/A | N/A | |||
qPCR праймеры | |||||||
tkv458 | Промоутер GAPDH | КГАККАККАККККТЦТТАГТАГТАГТАГТ | N/A | N/A | |||
tkv459 | Промоутер GAPDH | ГТКТТГГГГГКГАГГГГГАТГГАТ | N/A | N/A | |||
tkv319 | KSHV ORF39 (gM) | GTGAGGTGTTCGCTGAGTT | N/A | от 60075 до 60094 | |||
tkv320 | KSHV ORF39 (gM) | CCTGGGTCAAGCTGTGTGTGTTTTT | N/A | от 60218 до 60237 | |||
Праймеры RT-qPCR | |||||||
tkv 455 | К8/К-БЗИП Вперед РТ qPCR Праймер | КГААААГКАААГГАГАГАГАГАКГ | от 655 до 673 | от 75603 до 75621 | |||
tkv 456 | K8/K-bZIP Обратный RT qPCR праймер для unspliced | GCCATGTTCCCATTGAGTGAGT | от 755 до 774 | от 75703 до 75722 | |||
tkv 457 | K8/K-bZIP Обратный RT qPCR праймер для сращивания | CATCAGCATGTCGCGAAG | от 871 до 888 | от 75819 до 75836 | |||
JBW479 | Человек RNase P Вперед | АГКТТГГАААГАРАКККЕГ | от 238 до 257 | N/A | |||
JBW480 | Человек RNase P Обратный | GCGGAGGAGAGAGTAGTCTGAAA | от 317 до 336 | N/A |
Таблица 1: Все олигонуклеотиды, используемые в анализе данной публикации. Таблица 1 была воспроизведена с разрешения Американского общества микробиологии под лицензией Creative Commons Attribution от Vallery et al.15.
Протокол, описанный в настоящем докладе, может быть адаптирован к различным типам клеток и включает в себя шаги для двойной РНК FISH и RNA FISH с IF с использованием как моноклональных, так и поликлональных первичных антител. Хотя подготовленные слайды, как правило, изображены с конфокальный микроскоп, изображение может быть выполнено с STED (стимулируемое истощение выбросов) микроскоп после изменения повышенной концентрации антител и другой монтаж среды. Для расширенного анализа отдельных клеток, образцы, подготовленные с этим протоколом, также могут быть отсортированы, изображены и проанализированы сортатором клеток или цитометром потока со скромными изменениями, как показали Бора и его коллеги16. Этот протокол, однако, не может быть принят для визуализации живых клеток.
Методы количественной оценки, детализированные, устраняют предвзятость наблюдений и служат для проверки потенциального моклеоцитоплазмического сдвига. Соотношение нуклеоцитоплазматов также указывает, когда биомолекула приспосабливается от равномерного рассеиваемости к локализации в определенном субклеточном отсеке. Представленные здесь результаты являются полуколичественными, в то время как в протоколе излагаются пути укрепления количественной оценки. Сила нуклеоцитоплазмического соотношения и следов линии (шаг 4) зависит от использования флуоресцентных бусин в качестве контроля интенсивности (шаг 3.13) и использования четких субклеточных маркеров, таких как один для ядерного Lamin A/C. В настоящее время для отсеков репликации вируса KSHV не существует четкого пограничного маркера. Несмотря на это, этот расчет может быть распространен на другие субклеточные отсеки с использованием соответствующих маркеров.
Основным препятствием для протокола, подробно изложенного в настоящем докладе, является разработка стратегий FISH для конкретных стенограмм (шаг 1). Успех зависит от изобилия и связывания силы антисмысловых олигонуклеотидов. Специфика конкретных стенограмм еще более осложняется наличием перекрывающихся открытых кадров для чтения (ORF) в вирусных геномах. Таким образом, вирусные транскрипты часто имеют сходство последовательности17 с другими вирусными транскриптами из той же геномной области, особенно в случае герпесвирусов. Часто разработка стратегии FISH должна использовать более обильные стенограммы. Чтобы устранить неполадки в отсутствии сигнала FISH, пользователи должны выполнить протокол FISH со стратегией U2 snRNA FISH, чтобы подтвердить, что методы в клетках человека и подготовка реагентов являются адекватными. Аналогичным образом, стратегия KSHV PAN RNA FISH может подтвердить литические активации в кШВ-инфицированных клетках. Для устранения неполадок, связывающих антисмысловые олигонуклеотиды, авторы рекомендуют разработать несколько антисмысловых олигонуклеотидов. Если все не удается, коммерческий вариант доступен, как показано на использовании стратегии GAPDH FISH на рисунке 2 и Vallery, Уизерс, и коллеги15.
Более сильные алгоритмы определения клеточных и субклеточных границ еще больше устранили бы предвзятость количественной оценки. Некоторые аналитические программы обработки изображений могут установить границы для ячейки, ядра и многое другое, но требуют окончательных маркеров. Необычные морфологии клеток, такие как вирусные отсеки репликации трудно для такого программного обеспечения - задача для будущего развития. Кроме того, описанные здесь методы количественной оценки ограничиваются одним оптическим фрагментом ячейки (2D-анализ изображений). В то время как приобретение 3D-изображений возможно18,будущая разработка количественного анализа 3D изображений может обеспечить дальнейшее понимание пространственно-временной регуляции отсеков репликации вирусов.
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Мы благодарим Джонатана Роденфельса, Казимира Тычовски и Джоанну Б. Уизерс за советы по анализу данных. Мы также благодарим Г. Хейворд за анти-SSB антитела. Эта работа была поддержана грантами T32GM007223 и T32AI055403 от Национальных институтов здравоохранения (для ТКВ) и грантом NIH (CA16038) (для JAS). JAS является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза. Цифры 1-3 и таблица 1 были воспроизведены с разрешения Американского общества микробиологии под лицензией Creative Commons Attribution из следующей публикации: Валлери, Т. К., Уизерс, Дж.Б., Андо, Дж.А., Штейтц, Саркома-Ассоциированные Дж.А. Капоши Накопление герпесвируса мРНК в ядерной foci зависит от вирусной репликации ДНК и вирусного некодирования полиаденинатной ядерной РНК. В журнале вирусологии. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены