Method Article
我々は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)における蛍光を利用して、凍結感染したヒト細胞内の複数のヘルペスウイルスRNAを懸濁または付着性のいずれかで可視化するプロトコルについて説明する。このプロトコルは、核細胞質比を産生する蛍光の定量を含み、免疫蛍光(IF)を有する宿主およびウイルスタンパク質の同時可視化のために拡張することができる。
機械的な洞察は、特定のRNAおよびタンパク質の慎重な研究と定量から到着します。特定の時間における細胞全体のこれらの生体分子の相対的な位置は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)および免疫蛍光(IF)における蛍光で捕捉することができる。溶解ヘルペスウイルス感染の間、ウイルスはウイルス遺伝子を優先的に発現するために宿主細胞をハイジャックし、細胞形態および生体分子の挙動に変化を引き起こす。溶解活性は、FISHとIFでのみ識別可能なウイルス複製コンパートメントと呼ぶ原子力工場を中心としています。ここでは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)感染細胞に対するRNA FISHおよびIF技術の適応可能なプロトコルについて説明する。この方法には、特異的な抗感オリゴヌクレオチドの開発のためのステップ、ダブルRNA FISH、IFを有するRNA FISH、および蛍光強度の定量計算が含まれる。このプロトコルは、複数の細胞タイプ、未感染細胞、潜伏細胞、溶解細胞、時間コース、および阻害剤で処理された細胞に正常に適用され、ヒト宿主およびタンパク質の両方から特定のRNAおよびタンパク質の時空間的活性を分析し、KSHV
その溶解性(活性)相において、ヘルペスウイルスは宿主細胞をハイジャックし、細胞形態の変化および生体分子の局在化を引き起こし、ビリオンを産生する。操作のベースは核で、二本鎖DNAウイルスゲノムが複製され、カプシド1と呼ばれるタンパク質シェルに包まれます。まず、ウイルスは独自のタンパク質を発現し、宿主機構を乗っ取り、非必須の宿主遺伝子の発現を防止し、宿主の遮断効果と呼んだプロセスである。この活性の大部分は、宿主およびウイルスタンパク質、RNA、およびウイルスDNA2の両方からなるウイルス複製コンパートメントと呼ばれる特定の4'、6-ジアミド-2-フェニリンドール(DAPI)フリー核領域に局在する。セルは、複製コンパートメントのスペースとリソースを提供し、ウイルスカプシドの組み立てに対して、オーバーホールされます。いったんカプシドが核から出ると、細胞質にカプセル化して膜結合型ウイルス粒子(ビリオンとも呼ばれる)を作り出す方法は不明である。溶解期における宿主とウイルス生体分子の両方の局在化と空間シフトの理解は、複製コンパートメントの配置、宿主の遮断効果、ビリオン出口経路、およびその他の機械的洞察を提供します。ヘルペスウイルス感染および複製に関連するプロセス。
現在、これらの変化を検出して研究する最良の方法は、免疫蛍光(IF)と蛍光を有する感染細胞におけるタンパク質およびRNAの可視化(FISH)である。これらの技術を用いたタイムコースの使用は、溶解相の重要な点または単に時空間的なデータにおける生体分子の局在を明らかにする。FISHおよびIFは、細胞プロセスの阻害(例えば、ウイルスDNA複製の阻害)、RT-qPCR(リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応)、RNAシーケンシング、ノーザンブロット、質量分析、ウェスタンブロッティングなどの他の生化学的技術を補完する。ウイルスDNA産生の分析は、細胞活動のよりグローバルな画像を提供する可能性があります。
特定の遺伝子からRNA産物を調べるRNA FISH戦略と、特定遺伝子産物の核細胞質比を定量的に計算する計算解析を開発した。Steitzたちは、Steitzたちは以前の出版物3,4から改変したサンプル調製物は比較的容易であり、付着細胞および懸濁細胞の両方に使用することができる。プロトコルはまたIFの戦略が付いている複数のRNA FISHの戦略(二重RNA FISH)またはRNA FISHの同時使用のために適応可能である。特定のFISH戦略の開発は困難ですが、成功を改善するための提案が概説されています。ここで説明するデータ分析は、蛍光ビーズとコンパートメント境界の強いマーカーを使用する場合に定量的であり、顕微鏡写真に関するさらなる洞察、観察バイアスを除去する洞察を提供します。詳細なプロトコルは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)に感染した潜伏細胞および溶解細胞の両方のために設計されており、他のヘルペスウイルス5に感染した未感染細胞または細胞で使用することができる。定量の方法は、ほとんどの細胞の細胞下のコンパートメント間の核細胞シフトまたは再局在化に関する研究に適用可能である。
1. 特定のヘルペスウイルス転写物を検出するためのその場所(FISH)抗感覚オリゴヌクレオチドにおける蛍光の設計
2. オリゴヌクレオチドおよび細胞製剤
3. ウイルスRNAの固定、免疫蛍光(オプション)、ハイブリダイゼーション、可視化
4. 細胞内局在を強調し、蛍光の核細胞質比を決定するFISH画像とIF画像の定量化
この原稿に詳述されているFISHおよびIF法は、蛍光強度の線トレースによる結果の定量化と共に図1に示す。ここで提示される結果は半定量的であり、実験はスライド調製に蛍光ビーズを含んでいなかったため、異なる蛍光染色の強度間の比較ではなく、局在化に関する洞察を提供する。図1はまた、細胞質および核領域とその比率が潜伏細胞および溶解性KSHV感染細胞に対して異なることを明らかにする。したがって、面積は、図2に示す核細胞質比で制御される。図2は、核制御、ウイルスポリアデニル化核(PAN)RNA、および細胞質制御、宿主GAPDH mRNAを用いた核細胞質比について、この原稿に詳述された計算を検証する。図3は、ホスホノ酢酸(ドキシ+PAA)またはシドフォビル(ドキシ+シド)のいずれかを使用してKSHV DNA複製が溶解期で阻害されると、初期のORF59-58転写物が主に細胞質局在化にシフトすることを明らかにする。図3の顕微鏡写真と2つの定量法は、この結果を支持し、PAN RNAがウイルスDNA複製の阻害および初期ORF59-58転写物に見られる変化にもかかわらず、特定の核位に局所化することを明らかにした。
図1:KSHV転写物のハイブリダイゼーション(FISH)における蛍光強度の線跡は、KSHV複製コンパートメントの免疫蛍光(IF)の微妙性を明らかにする。(A-B)TREx RTAの共焦点画像(テトラサイクリン誘導性ウイルス複製および転写活性化タンパク質)BCBL-1細胞12は、ドキシサイクリン(Doxy)を用いて24時間の溶解相に誘導された。スケールバーは、ウイルスRNA(緑色)およびウイルス単一鎖DNA結合タンパク質(ORF6/SSB)(赤色)の上のハイブリダイゼーションにおける10μm(A)蛍光(S)を示し、KSHV複製コンパートメントの構成要素であることを明らかにする。ウイルス転写物は、細胞質、核、およびORF6/SSB濃縮領域外の核病巣に局所化し、複製コンパートメントとも呼ばれる。抗SSB抗体10を0.4%BSA/1x PBSで1:200に希釈し、0.4%BSA/1x PBSで1:500抗ウサギAlexa Fluor 594二次抗体で検出した。本研究全体で使用されるすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1に提供される。ORF59-58 mRNAの検出には、二次性および単一分裂性転写物の両方が含まれる。しかしながら、KSHV感染JSC-1細胞において、単一対化物mRNAは、ビシトロニクス転写物よりも少なくとも18倍少なく、観察された全蛍光シグナルのわずかな部分しか寄与しない可能性が高い13。さらにPAN RNAオリゴヌクレオチド(SB88)の1つはまた、K7のウイルス転写物を検出することができる。K7の検出からの信号は、溶解性KSHV感染細胞14内のすべてのポリアデデン化RNAのほぼ80%に存在するKSHV PAN RNAを検出するシグナルと比較して有意ではない。さらに、K8.1 mRNAの検出における4つのアンチセンスオリゴヌクレオチド(tkv13)のうちの1つは、K8.1および近くの開いている読書フレーム(ORF)の他のアイソフォームの複数のアイソフォームに結合することができる。オリゴヌクレオチドtkv13のみからのFISH信号が不十分である(データは示さない)。4つのオリゴヌクレオチドの結合と同じ転写物上のそれらの結合は、観察された強いシグナルを提供する可能性が高い。(A)中の白線横糸は、FISHおよびIFシグナルに対する蛍光強度の線経路を表し、(C)にプロットした。(B) 白い線で横たわる(A)のセルの画像をデジタルズームした。わかりやすくするために、青い DAPI チャネルは省略されています。(C) プロットは、同じ線に沿った各染色に対する相対的な蛍光強度を示します:αSSB(赤)、ウイルス転写物(緑色、プロットに示された転写物)、およびDAPI(青)。シェーディングされた領域は、ウイルスレプリケーション コンパートメントまたは SSB/ORF6 エンリッチ領域に対応する DAPI 削減領域を示します。(D) 細胞領域に対する核領域の比率が変化し、従って使用される蛍光強度比は領域について正規化された。(E) TREx RTA BCBL-1細胞について、溶解性活性化を受けた有無にかかわらず測定された核および細胞領域。非誘導細胞と比較して統計的に有意な変化が見られる。ボックスとウィスカーのプロットは、10 パーセンティルと 90 パーセンティルを表します。フィギュアは、クリエイティブ・コモンズ・アトリビューション・ライセンスの下で、ヴァレリー、ウィズーズ、および同僚15からのわずかな変更で転載しました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:制御核および細胞質魚戦略は、核細胞質比の計算方法を検証する。(A) 宿主GAPDH mRNA(赤色)及びウイルスポリアデデン化核(PAN)用の魚(緑色)及びDAPI核染色(青色)は、核細胞質比を決定する計算方法に対する正のFISH対照である。宿主GAPDH mRNAは、KSHVの宿主シャットオフ効果の正規目標であり、ここに示すように溶解誘導時に分解される。(B)(A)の溶解細胞を横切る白線で示される線に沿った蛍光強度。DAPI(青)、パンRNA(緑)、GAPDH mRNA(赤)。シェード領域は、図 1で定義されているとおりです。(C) (A) (GAPDH サンプルごとに n = 150、 ORF59-58 または K8.1 サンプルの n = 75) で表される細胞の蛍光強度の定量を、図 2および図3 に示す 3 つの生物学的複製物について行った。.P 値: >0.05 (ns)、<0.05 (*)、<0.005 (**)、および <0.0005 (***)。(D)トレックスRTA BCBL-1細胞からのRNAの代表的なノーザンブロットは、ドキシー後24h。ボックスとウィスカーのプロットは、10 パーセンタイルと 90 パーセンタイルを表します。フィギュアは、クリエイティブ・コモンズ・アトリビューション・ライセンスの下で、ヴァレリー、ウィズーズ、および同僚15からのわずかな変更で転載しました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヌクレオ細胞質比の線の痕跡と計算は、ウイルスDNA複製の阻害時に早期溶解性ORF59-58転写物の細胞質への強いシフトを明らかにする。TREx RTA BCBL-1細胞を薬物なしで24時間治療した(Unind)、ドキシサイクリンのみ(ドキシ)、またはドキシサイクリンおよびヘルペスウイルスDNA複製の1阻害剤、ホスホノ酢酸(ドキシ+PAA)またはシドフォビル(ドキシ+シド)。パネル(A-C)は、3つの生物学的反復から収集されたサンプルからのデータを示す。(A)ウイルスDNA複製の阻害中のウイルス細胞内DNAのqPCR値を、宿主細胞GAPDH遺伝子のプロモーターDNAの量に正規化した。(B) ノーザンブロット(左)および定量(右)は、ウイルスDNA複製の阻害中の総RNAレベルを示す。すべてのRNAの誘導されていないレベルは検出できなかった。(C) ウイルスDNA複製の阻害時にウイルスORF59-58転写物(緑色)およびPAN RNA(赤色)の代表的なFISH画像。DAPI(青)は核染色でした。(D)(C)で表される細胞の蛍光強度の定量化(n=75各)を生物学的三量子で行った。(E) (C) で白線で示される細胞間で描かれた線に沿った蛍光強度が示されている:DAPI(青)、PAN RNA(赤)、およびORF59-58 mRNA(緑色)。P 値: >0.05 (ns)、<0.05 (*)、<0.005 (**)、および <0.0005 (***)。本研究におけるすべてのオリゴヌクレオチドの配列は表1に示されている。ボックスとウィスカーのプロットは、10 パーセンティルと 90 パーセンティルを表します。フィギュアは、クリエイティブ・コモンズ・アトリビューション・ライセンスの下で、ヴァレリー、ウィズーズ、および同僚15から転載したものです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
北オリゴス | |||||||
オリゴいいえ | 遺伝子 | シーケンス | 遺伝子内の位置 | リファレンスNC009333.1ゲノムを持つ位置(数値は方向または鎖を反映しない) | |||
コルフ50 | KSHV RTA/ORF50 | CGCATTGCGGTTTGTGTTTTTTGG | 1284 から 1309 | 73936 から 73961 | |||
JBW249 | KSHVソックス/ORF37 | タクトガッカッカアカカカカッカッカッカッカッカッカック | 262 から 291 | 57633 から 57662 | |||
tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCGGGGッタガトグアッガット | 941 から 967 (ORF59 ORF) | 95879 から 95905 | |||
tkv13 | KSHV K8.1 | アガガッタッタガグクカガッガッガットGTGCGAAT | 16~57 | 76029 から 76070 | |||
SB2 | KSHV パン RNA | アカアアトックカククトTGTGC | 664 から 687 | 29496 から 29519 | |||
ナース P | ヒューマン ルナス E | TGGGCGGAGGAggTAGTCTG | 319 から 339 | N/a | |||
フィッシュプローブ | |||||||
オリゴいいえ | 遺伝子 | シーケンス | |||||
SB2 | KSHV パン RNA | アカアアトックカククトTGTGC | 664 から 687 | 29496 から 29519 | |||
SB85 | KSHV パン RNA | CGCTCTTTTTTTカツットカツット | 373 から 392 | 29205 から 29224 | |||
SB88 | KSHV パン RNA | GTGAAGCGGCAGCCAAGGTGACTGG | 1~22 | 28830 から 28854 | |||
tkv13 | KSHV K8.1 | アガガッタッタガグクカガッガッガットGTGCGAAT | 16~57 | 76029 から 76070 | |||
tkv14 | KSHV K8.1 | タガタッタグッガグトグトグトグトッグ | 377 から 414 | 76390 から 76427 | |||
tkv15 | KSHV K8.1 | GTAAGGTTACGCTTTATCCカッカッカッカッカッカッカッガグタタック | 461~500 | 76474 から 76513 | |||
tkv16 | KSHV K8.1 | ガカカグッカッカッカッカッカッカッカッカッカッタグ | 688 から 725 | 76701 から 76738 | |||
tkv376 | KSHV ORF59-58 | TAATGTGTTCATTGCCCCCTTT | 54~79 | 96767 から 96792 | |||
tkv377 | KSHV ORF59-58 | GCCGATCCGTGCACTACTCCCCGGTTTT | 93 から 122 | 96724 から 96753 | |||
tkv378 | KSHV ORF59-58 | アグクタットGCGCGCGCTACTACTCGCA | 300~329 | 96517 から 96546 | |||
tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCGGGGッタガトグアッガット | 941 から 967 | 95879 から 95905 | |||
tkv380 | KSHV ORF59-58 | アアガグトガッタグタグクト | 1289 から 1315 | 95531 から 95557 | |||
tkv381 | KSHV ORF59-58 | AAACACTGCTGACGCGカガットック | 1423 から 1450 | 95396 から 95423 | |||
tkv382 | KSHV ORF59-58 | CTGTGTGTGTACTATGGCGGCGCGCGC | 1571 から 1602 | 95244 から 95275 | |||
tkv383 | KSHV ORF59-58 | ググッチャゲットカグスタッタグガアアクチャッグ | 2136 から 2173 | 94673 から 94710 | |||
ステラリス | ギャップド | ステラリスによるプレメイド | N/a | N/a | |||
qPCR プライマー | |||||||
tkv458 | GAPDHプロモーター | CTGCACCAACTGCTTタグ | N/a | N/a | |||
tkv459 | GAPDHプロモーター | GTCTCTGGGGGGGTGGガット | N/a | N/a | |||
tkv319 | KSHV ORF39 (グラム) | GTGAGGTGCTTCGCTGAGTT | N/a | 60075 から 60094 | |||
tkv320 | KSHV ORF39 (グラム) | CCTGGGTCAAGGTGTTTTTTTTTTT | N/a | 60218 から 60237 | |||
RT-qPCR プライマー | |||||||
tkv 455 | K8/K-bZIP フォワード RT qPCR プライマー | CGAAAgcaaggcagataCG | 655 から 673 | 75603 から 75621 | |||
tkv 456 | K8/K-bZIP リバース RT qPCR プライマー | GCCATTGTTCCTTTTTTT | 755 から 774 | 75703 から 75722 | |||
tkv 457 | K8/K-bZIP リバース RT qPCR プライマー用スプライス | カタグストグCGAAG | 871 から 888 | 75819 から 75836 | |||
JBW479 | ヒューマン RNase P フォワード | アグットガアカガクタクカッグ | 238 から 257 | N/a | |||
JBW480 | ヒューマン RNase P リバース | GCAGGAggGaGAGTAGTCTGAA | 317 から 336 | N/a |
表1:本書の分析で使用されるすべてのオリゴヌクレオチド。表1は、米国微生物学会の許可を受けて、Vallery et al. 15.のクリエイティブ・コモンズ・アトリビューション・ライセンスに基づいて複製された。
このレポートに記載されているプロトコルは、異なる細胞タイプに適応することができ、モノクローナルおよびポリクローナル一次抗体の両方を使用してIFを用いた二重RNA FISHおよびRNA FISHのステップが含まれる。調製されたスライドは、通常、共焦点顕微鏡で画像化されるが、画像化は、増加した抗体濃度および異なる取り付け媒体の修飾後にSTED(刺激放出枯渇)顕微鏡で行うことができる。個々の細胞の増強分析のために、このプロトコルで調製されたサンプルは、Borahおよび同僚16によって示されているように、適度な変化を伴う細胞選別器またはフローサイトメーターによってソート、画像化、および分析され得る。ただし、このプロトコルは生細胞イメージングには採用できません。
詳細な定量法は、観察バイアスを排除し、潜在的な核細胞質シフトを検証するのに役立ちます。核細胞質比はまた、生体分子が特定の細胞内の局所化に均等に分散することから局所化するように調整する場合にも特定する。ここで示す結果は半定量であり、プロトコルは定量を強化する方法を概説します。核細胞質比と線跡の強さ(ステップ4)は、蛍光ビーズを強度制御(ステップ3.13)として使用し、核ラミンA/C用のような明確な細胞マーカーの使用に依存する。現時点では、KSHV ウイルス複製コンパートメントには明確な境界マーカーは存在しません。いずれにせよ、この計算は、適切なマーカーを使用して他の細胞下コンパートメントに拡張することができます。
このレポートで詳述されているプロトコルの主なハードルは、特定のトランスクリプトに対する FISH 戦略の開発です (ステップ 1)。成功は、反感覚オリゴヌクレオチドの豊富さと結合強度に依存しています。特定の転写物に対する特異性は、ウイルスゲノム中にオーバーラップする開いた読み取りフレーム(ORF)の存在によってさらに困難になる。したがって、ウイルス転写物は、多くの場合、特にヘルペスウイルスの場合には、同じゲノム領域からの他のウイルス転写物と配列類似性17を有する。多くの場合、FISH戦略の開発は、より豊富なトランスクリプトを利用する必要があります。FISH信号の欠如をトラブルシューティングするには、ユーザーはU2 snRNA FISH戦略を使用してFISHプロトコルを実行し、ヒト細胞および試薬の調製技術が適切であることを確認する必要があります。同様に、KSHV PAN RNA FISH戦略は、KSHV感染細胞における溶解活性化を確認することができる。反感オリゴヌクレオチドによる結合をトラブルシューティングするために、著者らはいくつかの反感オリゴヌクレオチドを開発することを推奨する。すべてが失敗した場合、図 2の GAPDH FISH 戦略と、Vallery、Withers、および同僚15の使用によって示されているように、商用オプションが利用可能です。
細胞と細胞内の境界を定義するより強力なアルゴリズムは、さらに定量バイアスを排除します。一部の分析画像処理ソフトウェアでは、セル、核などの境界を設定できますが、決定的なマーカーが必要です。ウイルス複製コンパートメントなどの異常な細胞形態は、このようなソフトウェアでは困難であり、将来の開発に向けての課題です。さらに、ここで説明する定量方法は、セルの1つの光学スライス(2D画像解析)に限定される。3D画像取得は18可能であるが、定量的な3D画像解析の将来的な開発は、ウイルス複製コンパートメントの時空間調節に関するさらなる洞察を提供するかもしれない。
著者は、開示する利益相反を持っていません。
データ分析に関するアドバイスをいただいたジョナサン・ローデンフェルス、カジミエシュ・ティコウスキー、ジョアンナ・B・ウィーザーズに感謝します。また、G.ヘイワードの抗SSB抗体に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(TKV)およびNIH助成金(CA16038)(JAS)からの助成金T32GM007223およびT32AI055403によって支援されました。JASはハワード・ヒューズ医学研究所の研究者です。図1-3および表1は、次の出版物からクリエイティブ・コモンズ・アトリビューション・ライセンスの下で米国微生物学会の許可を受けて複製されました:ヴァレリー、T.K.、ブリザーズ、J.B.、アンドー、J.A.、スタイツ、J.A.カポジの肉腫関連核病巣におけるヘルペスウイルスmRNA蓄積は、ウイルスDNA複製およびウイルス非コードポリアデデン化核RNAの影響を受ける。ウイルス学のジャーナル。92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018)
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
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