JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы опишем простой метод для быстрого количественного определения неорганических полифосфат в различных бактерий, в том числе грамотрицательных и грамположительных микобактериальной видов.

Аннотация

Неорганические полифосфаты (полипы) является биологических полимеров, обнаруженные в клетках из всех сферах жизни и требуется для вирулентности и реакции на стресс у многих бактерий. Есть различные методы для количественного определения полип в биологических материалов, многие из которых являются трудоемкими или нечувствительны, ограничивает их полезность. Мы представляем здесь рациональный метод для квантификации полип в бактерии, используя кремнезема мембраны столбца извлечения оптимизирован для быстрой обработки нескольких образцов, пищеварение полипа с exopolyphosphatase полипа конкретных ScPPX и обнаружение в результате бесплатные фосфат с конфиденциальной основе аскорбиновой кислоты колориметрические assay. Эта процедура является простой, недорогой и позволяет надежный полипа количественной оценки различных видов бактерий. Мы представляем представитель полипа количественной грамотрицательных бактерий (Escherichia coli), грамположительных молочнокислые бактерии (Lactobacillus reuteri) и микобактериальной видов (Mycobacterium smegmatis). Мы также включать простой протокол для очищение сродства никеля мг количества ScPPX, который в настоящее время не имеющиеся.

Введение

Неорганические полифосфаты (полипы) является линейным биополимера единиц связано phosphoanhydride фосфат, встречается во всех сферах жизни1,2,3. В разнообразных бактерий полип имеет важное значение для реакции на стресс, моторику, биопленки, клеточного цикла управления, антибиотикам и вирулентности4,5,6,7,8 ,9,10,11. Исследования метаболизма полип в бактериях таким образом имеют потенциал для урожайности основных понимание способности бактерий вызывают болезни и процветать в различных средах. Во многих случаях однако, методы, доступные для количественного определения полип в бактериальных клетках являются сдерживающим фактором в этих исследованиях.

Существует несколько методов, в настоящее время используется для измерения уровней полип в биологических материалах. Эти методы обычно включают два отдельных этапов: извлечение полипов и количественное определение полипа присутствующие в эти выдержки. Текущий метод золотой стандарт, разработанный для дрожжей Saccharomyces cerevisiae Бру и коллеги12, экстракты полипа наряду с ДНК и РНК с помощью фенола и хлороформа, а затем высыпанием этанола, лечение с дезоксирибонуклеаза (DNase) и рибонуклеазы (РНКазы) и пищеварение результате очищенный полипа с S. cerevisiae унижающего достоинство полипа фермента exopolyphosphatase (ScPPX)13 давать бесплатные фосфат, который затем количественно с помощью Малахит на основе зеленого колориметрические assay. Эта процедура является весьма количественные, но трудоемкий, ограничивая количество выборок, которые могут быть обработаны в одном эксперименте и не оптимизирован для бактериальных образцов. Другие сообщали, извлечение полипов из различных клеток и тканей, с использованием кремния бусины («glassmilk») или кремнезема мембрана колонок6,14,15,16,17, 18. Эти методы не извлечь эффективно короткие цепи полип (менее 60 единиц фосфат)12,14,15, хотя это меньше озабоченности для бактерий, которые обычно считается главным образом синтезировать 3длинноцепочечных полипа. Старые методы добычи полипа, используя сильных кислот19,20 больше не широко используются, так как полип нестабильно при кислых условиях12.

Есть также целый ряд зарегистрированных методы для количественного определения полипа. Среди наиболее распространенных — 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), флуоресцентные краски более обычно используется для пятно ДНК. DAPI-полип комплексы имеют различные флуоресценции возбуждения и выбросов Максима чем DAPI-ДНК комплексы21,22, но есть значительные помехи от других клеточных компонентов, включая РНК, нуклеотиды и инозитол фосфаты12,15,16,23, уменьшение специфичность и чувствительность измерений полипа, сделанные с помощью этого метода. Кроме того, полип и аденозиндифосфат (ADP) могут быть преобразованы в аденозинтрифосфат (АТФ) с использованием очищенного Escherichia coli полипа киназы (ППК) и результирующая АТФ, количественно с помощью Люцифераза14,17 ,18. Это позволяет обнаружить очень небольшое количество полипов, но требует двух шагов ферментативной реакции и люциферин и очень чистый ADP, которые являются дорогостоящих реагентов. ScPPX, специально дайджесты полип в свободной фосфат6,12,13,24, которые могут быть обнаружены с помощью более простые методы, но ScPPX тормозится12ДНК и РНК требующих DNase и РНКазы лечение полипа содержащих экстракты. ППК ни ScPPX коммерчески доступны, и очистки ППК является относительно сложным25,26.

Полип в lysates клетки или выписки также могут быть визуализированы на гелях полиакриламида, DAPI негативные пятнать27,28,29,30, метод, который позволяет оценить длину цепочки, но низкая пропускная способность и плохо количественные.

Мы теперь сообщают assay быстрый, недорогой, средне пропускной полип, который позволяет быстро квантификации полипа уровней в различных видов бактерий. Этот метод начинает с лизировать клетки бактерий при 95 ° C в 4 М гуанидина Изотиоцианаты (GITC)14 для инактивации сотовой фосфатаз, следуют кремнезема мембраны столбца извлечения оптимизирован для быстрой обработки нескольких образцов. Затем полученный полип содержащих экстракт переваривается с большим избытком ScPPX, устраняя необходимость DNase и РНКазы лечения. Мы включать протокол для простой очищение сродства никеля мг количества ScPPX. Наконец полип производные бесплатно фосфат количественно с простой, чувствительных, аскорбиновая кислота основе колориметрические пробирного24 и нормализуется до общего клеточного белка. Этот метод упрощает измерения полип в бактериальных клетках, и мы продемонстрировать его использование с представителем видов грамотрицательных бактерий, грам-положительных бактерий и микобактерий.

протокол

1. Очищение дрожжи Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Преобразование штамм гиперэкспрессия белка E. coli BL21(DE3)31 с плазмида pScPPX26 электропорации32 или33химических превращений.
  2. Прививок 1 Л lysogeny бульона (LB) содержит 100 мкг мл-1 ампициллин в 2 Л unbaffled колбу с одного Колония BL21(DE3), содержащих pScPPX2 и инкубировать на ночь при 37 ° C без встряхивания, для поглощения в 600 Нм (600) приблизительно 0,3, как измеряется в спектрофотометре.
  3. Запустите культуры, пожимая (180 об/мин) и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C, во время которого клетки будут расти к A600 0,4 - 0,5.
  4. Добавьте изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мм и дополнительные 100 мкг мл-1 ампициллин, затем Проинкубируйте 4 ч при 37 ° C с встряхивания на 180 об/мин.
    Примечание: Этот протокол гиперэкспрессия генерирует большое количество растворимых ScPPX. Однако ScPPX гиперэкспрессия очень прощать, и целый ряд других общих протоколов гиперэкспрессия белка были использованы для того чтобы успешно очистить ScPPX.
  5. Передача клетки центрифуги бутылка 1 Л и собирать их центрифугированием на 20 мин в 5000 x g при 4 ° C. Удалить супернатант и передачи Пелле ячейки 50 мл Конические трубки.
    Примечание: Гранулы клетки могут храниться бессрочно-80 ° c.
  6. Оттепель гранул на льду, а затем Ресуспензируйте 9 мл 50 мм HEPES, 0.5 М NaCl и имидазола (рН 8) 5 мм для общего объема около 10 мл.
  7. Лизоцим-1 мл 1 мг (окончательный концентрации), 2 мм MgCl2и 50 единиц мл-1 о эндонуклеазы РНК - и ДНК-унижающих достоинство видов обращения (см. Таблицу материалы) и Инкубируйте 30 мин на льду.
    Примечание: ScPPX связывает нуклеиновые кислоты (данные не показаны), поэтому нуклеиназы лечения необходима во время очистки.
  8. С помощью sonicator с microtip (см. Таблицу материалы), Лизируйте клетки 2 циклов sonication на льду на 50% мощности, пульсирующий 5 s на и 5 s, с 2 мин отдыха между циклами.
    Примечание: Используйте соответствующий слуха во время sonication. Аналогичным образом в случае с гиперэкспрессия, разнообразные методы лизис клеток являются приемлемыми для ScPPX очистки.
  9. Удаление нерастворимых мусора центрифугированием lysate 20 мин на 20000 x g при 4 ° C. Фильтровать результирующий супернатант (приблизительно 10 мл) через фильтр шприц ацетат целлюлозы размер поры 0,8 мкм.
  10. Загрузить lysate на заряженные никель 5 мл Хелатирующие столбец (см. Таблицу материалы) с использованием перистальтического насоса или большой шприц.
  11. Промойте столбец с 50 мл 50 мм HEPES, 0.5 М NaCl, 5 мм имидазола (рН 8).
  12. Промойте столбец с 50 мл 50 мм HEPES, 0.5 М NaCl, 20 мм имидазола (рН 8).
  13. Элюировать ScPPX с 50-мм HEPES, 0.5 М NaCl и 0,5 М имидазола (рН 8), сбор 15 фракций в 1-мл. Проверить эти элюции фракций белка контента с assay протеина Брэдфорд34 (см. Таблицу материалы) и запустить геля SDS-PAGE35 подтвердить, какие фракции содержат очищенного ScPPX (молекулярный вес = 45 кДа).
  14. Бассейн фракций, содержащих чистые ScPPX и регулировка концентрации пуле белка приблизительно 2 мг мл-1 50 мм HEPES и 0,5 М NaCl. Более высокие концентрации белка может осадить на следующем шаге.
  15. Обмен очищенный ScPPX в буфер хранения (20 мм трис-HCl [pH 7.5], 50 мм KCl, глицерина 10% [v/v]) методом диализа. Обобщённые ScPPX фракции в запечатанном длина 12000-14000 да молекулярный вес отсечки диализа мембраны трубки (см. Таблицу материалы) и приостановить в 1 Л буфер хранения с непрерывного перемешивания на 4 ° C для по крайней мере 4 h. повторить этот шаг с свежий буфер для хранения для в общей сложности 3 буфера изменений.
  16. Передача очищенный, dialyzed белка для пластиковых пробирок или трубки и центрифуги для 20 мин на 20000 x g при 4 ° C для удаления любых нерастворимых агрегатов. Тщательно передать чистые 15 мл конические супернатант.
  17. Регулировать концентрацию очищенный ScPPX-мг 1 мл-1 с буфером хранения, добавить 0,1% (w/v) протеаз бесплатно бычьим сывороточным альбумином (БСА; конечная концентрация), а также хранить на срок до 6 месяцев при 4 ° C.
    Примечание: ScPPX теряет более чем на 90% своей деятельности, когда это замороженные13.

2. сбор образцов для извлечения полифосфат

  1. Рост бактерий в условиях, представляющих интерес для определения содержания полипа. Для этого протокола растут Lactobacillus reuteri36 на ночь при 37 ° C без встряхивания в яблочную фермента индукции (МЭИ) средних37 без хвоща (MEI-C).
  2. Урожай достаточно клетки центрифугированием в 1,5 мл microcentrifuge трубки для всего 50-100 мкг клеточных белков (см. шаг 3 ниже). Для е. coli, это 1 мл этапа культуры журнала на A600 0,2 - 0,4. Для л reuteriэто 1 мл ночь культуры. Внести необходимые коррективы для других видов, представляющих интерес.
  3. Полностью удалите супернатант из клеток окатышей.
  4. Ресуспензируйте клетки окатышей в 250 мкл буфера lysis GITC (4 M гуанидина Изотиоцианаты, 50 мм трис-HCl, pH 7) и лизируют инкубации при 95 ° C на 10 мин лизатов Store-80 ° c.
    Примечание: Соответствовать лизис время, так как расширенные инкубации при высокой температуре может привести к деградации полипа путем гидролиза38. Лизатов могут храниться бессрочно-80 ° c.
    Предупреждение: Гуанидина Изотиоцианаты chaotropic соли и следует обрабатываются с перчатками и утилизации опасных отходов.

3. измерение содержания белка Lysates клетки

  1. Подготовка стандартов BSA, содержащий 0, 0,1, 0,2 и 0,4 мг мл-1 о BSA GITC литического буфера.
    Примечание: Важно, чтобы стандарты BSA в GITC, поскольку GITC влияет на цвет развитие assay Брадфорд. BSA стандарты могут храниться бессрочно при-20 ° C.
  2. Аликвота 5 мкл талой, перемешанных lysates клетки и BSA стандартов для отдельных скважин в четкой 96-луночных пластине.
  3. 195 мкл Реагента Брэдфорд34 для каждой скважины и измерения оптической плотности на 595 Нм (595) на пластину читателя (см. Таблицу материалы).
  4. Рассчитать количество белка в каждой скважине по сравнению с BSA калибровочной кривой, используя формулой y = mx + b, где y595, x — мкг BSA, m — это наклон кривой стандартного, и b y пересечение калибровочной кривой. Умножьте полученное значение на 0,05 для определения общего мг белка в каждом образце.

4. Извлечение полифосфат

  1. 250 мкл 95% этиловом спирте, каждому GITC-лизированы образца и вихревой смешивать.
  2. Применить эту смесь силики мембраны спин столбцов и центрифуги для 30 s на 16,100 x g.
  3. Отказаться от потока путем, а затем добавьте 750 мкл 5 мм трис-HCl (рН 7,5), 50 мм NaCl, 5 ЭДТА, 50% этанола и центрифуги для 30 s на 16,100 x g.
  4. Отбросить проточных и центрифуги для 2 мин на 16,100 x g.
  5. Столбец в чистой 1,5 мл отцентрифугировать и 150 мкл 50 мм трис-HCl (рН 8).
  6. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин, затем элюировать полипа центрифугированием на 2 мин на 8000 x g.
    Примечание: При желании, элюаты может храниться при температуре-20 ° C для по крайней мере за 1 неделю.

5. переваривание полифосфат

  1. Подготовка стандартов, содержащих 0, 5, 50 или 200 мкм фосфат калия в 50 мм трис-HCl (рН 8).
    Примечание: Калия фосфат стандартов могут бессрочно храниться при комнатной температуре.
  2. Аликвота 100 мкл каждого стандарта фосфата и из извлечены образцы полип в отдельной скважины ясно 96-луночных плиты.
  3. Подготовка мастер смесь содержит (на сэмпл): 30 мкл буфера (100 мм трис-HCl, 25 мм MgCl2, Ацетат аммония 250 мм, pH 7.5) реакции 5 x ScPPX13, 19 мкл H2O и 1 мкл очищенный ScPPX (мг в 1 мл-1).
  4. 50 мкл мастер смеси для каждой скважины 96-луночных пластины. Инкубируйте 15 мин при температуре 37 ° C.
    Примечание: При желании, переваривается полипа образцы могут храниться при температуре-20 ° C на неопределенный срок.

6. Определение свободного фосфат24

  1. Приготовляют раствор обнаружения базы путем растворения 0.185 g Калий сурьмяновиннокислый в 200 мл воды, добавить 150 мл 4 N H2так4, затем добавляя 1,49 g Парамолибдат аммония. Движение, чтобы растворить и затем довести до окончательного объема 456 мл. Фильтр решение для удаления твердых частиц и хранения, защищенном от света на 4 ° C до 1 месяца.
  2. Подготовьте раствор аскорбиновой кислоты 1 М. Магазин, защищенном от света на 4 ° C до 1 месяца.
  3. Подготовьте свежий рабочий запас обнаружения решения каждый день, смешивая 9,12 мл раствора обнаружения базы с 0,88 мл 1 М аскорбиновой кислоты. Разрешить обнаружение решение прийти к комнатной температуре перед использованием.
  4. 50 мкл раствора обнаружения для каждого образца и стандарт в 96-луночных пластины и инкубации при комнатной температуре около 2 мин разрешить цвет развития.
  5. Измерение оптической плотности в 882 Нм с читателем пластины и рассчитать концентрацию фосфата каждого образца сравнения для стандартной кривой фосфат калия.
    Предупреждение: Обнаружение решение содержит токсичных солей и сильных кислот. Надевайте перчатки и лечения избыточного решения как токсичных отходов.

7. Расчет сотовой полифосфат содержание

  1. Конвертировать концентрации фосфатов, определяется в шаге от 6,5 до наномоль полип производные фосфатов в каждом всю ячейку lysate по следующей формуле:
    Полип нмоль = 1,5 x (фосфат мкм / 10)
    Примечание: Стандартный метод на основе кривой в шаге 6 определяет концентрацию фосфата (в мкм) в каждый 100 мкл полипа образец aliquoted в шаге 5.2. Чтобы преобразовать этот концентрации ряда нмоль, 100 мкл делится на 106 дать объем в Л, умноженное на концентрации (мкмоль L-1), а затем умножить на 1000 (количество нмоль в мкмоль). Это уменьшает деления концентрации на 10. Объем общий экстракт, подготовлен на шаге 4-150 мкл, поэтому необходимо умножить полученное значение 1,5 для вычисления нмоль фосфата в весь экстракт.
  2. Нормализации клеточного полипа содержание общего белка клеточной путем деления общего белка мг в каждой пробе, определенный на шаге 3.4 нмоль полипа. Полип уровни выражаются концентрации отдельных полип производные бесплатно фосфата.
    Примечание: В некоторых случаях, количество полип производные фосфатов в образец может выходить за пределы диапазона линейной калибровочной кривой фосфат (шаг 6.5). Если уровни полипа очень высоки, избыток полип содержащих элюата из шага 4.6 может быть разбавленным 1:10 или 1: 100, при необходимости и затем измеряется снова, как описано в шаги с 5 по 7.

Результаты

Ключевые этапы протокола схематически в упрощенной форме на рисунке 1.

Чтобы продемонстрировать использование этого протокола с грамотрицательных бактерий, одичал типа E. coli MG165539 был выросла до середины журнала фазы в богатой среде фунтов при 37 ° C при встряхивании (200 об/мин), затем промыть и инкубированы для дополнительных 2 ч в morpholinopropanesulfonate амортизированное (МОПЫ) минимальный средний40 содержащие 4 g L-1 глюкозы и 0,1 мм K2HPO4, состояние, известное для стимулирования производства полипа14,29. Как показано на рисунке 2А, мы обнаружили не полип в одичал типа E. coli выращивается в LB и 192 ± 14 (среднее ± стандартное отклонение [SD]) нмоль полипа мг-1 общего белка в MOPS, в соответствии с предыдущих докладах14,29 . Как и ожидалось, ∆ППК мутант6, который недостатками полипа киназы41, произведенных не полип в любой среде, ∆ppx мутант6, что не хватает exopolyphosphatase42, производится примерно такое же количество Полип как одичал тип и ∆phoB мутант29, которые дефектных фосфат транспорта, производства значительно меньше полипа чем одичал тип14,29,43.

Чтобы продемонстрировать использование этого протокола с грам-положительных бактерий, одичал тип л reuteri ATCC ЗПТ 647536 и isogenic ppk1 null мутант, хватает полипа киназы, построенный с помощью oligo направленных recombineering44, были вырос на ночь в МЭИ-C при 37 ° C без встряхивания. Как показано в рисунке 2B, одичал тип накопленные 51 ± 6 нмоль полипа мг-1 общего белка в этих условиях, в то время как ppk1 мутант содержится меньше половины этой суммы. L. reuteri содержит второй полип киназы, закодированный ppk2 Джин45, который предположительно приходится полипа присутствует в ppk1 null мутант.

Чтобы продемонстрировать использование этого протокола с микобактерий, Mycobacterium smegmatis штамм SMR546 был вырос к середине журнала фазе в Бронта де Hartmans (HdB) средний47, затем промыть и пять раз разбавляют в HdB или HdB с 2% этанола. Эти культуры, на ночь, затем инкубировали при 37 ° C при встряхивании (180 об/мин). Как показано на рис. 2 c, в отсутствие этанола, м. smegmatis накопленных 141 ± 52 нмоль полипа мг-1 общего белка, в то время как этанол лечения привело к трехкратное увеличение 437 ± 102 нмоль полипа мг-1 общего белка. Ожидалось, что этот результат, поскольку этанол ранее сообщалось поднять уровни полип в . м. smegmatis48.

figure-results-3496
Рис 1: диаграмма процедуры извлечения и измерения полифосфат. Приводятся основные шаги полипа количественного определения протокола. Гранулы бактериальной клетки лизированы на 95 ° C в GITC (гуанидина Изотиоцианаты). Небольшие аликвоты лизатов assayed для содержания белка, используя assay Брадфорд. Полип добывается с использованием кремния мембраны столбцы и затем переваривается с ScPPX. Результате бесплатно фосфат количественно с помощью assay аскорбиновой кислоты. Общая полип производные фосфатов нормируется для общего белка для каждого образца. 595 = поглощения в 595 Нм; 882 = поглощения в 882 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4453
Рисунок 2: представитель результатов с различными бактериями. (A) E. coli MG1655 одичал тип и isogenic ∆ППК, ∆ppxи ∆phoB мутанты были выращены при 37 ° C при встряхивании (200 об/мин) до600 = 0,2 - 0,4 в богатой среде фунтов (черные круги) и затем переданы минимальный средний (швабры содержит 4 g L-1 глюкозы и 0,1 мм K2HPO4) 2 h (белые кружки; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC ЗПТ 6475 (круги) и null мутант isogenic ppk1 (треугольники) выросли на ночь при 37 ° C в среде MEI-C без встряхивания (n = 3, ± SD). (C) м. smegmatis SMR5 был выросли при 37 ° C при встряхивании (180 об/мин) до600 = 1 в HdB среде с (закрытые квадраты) или без (открытых площадок) 2% этанола (n = 3, ± SD). Полип уровни выражаются концентрации отдельных полип производные бесплатно фосфата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Протокол, описанные здесь упрощает и ускоряет количественного определения уровней полип в разнообразных бактерий, с типичным набором 24 пробы, принимая около 1,5 ч для полной обработки. Это позволяет быстрого отбора проб и анализа мутант библиотек и упрощает кинетическая эксперименты, измерения накопление полипа с течением времени. Мы продемонстрировали, что протокол работает эффективно на представителей трех разных типов: бактерии по алфавиту, Фирмикуты и актиномицеты, которые славятся своей упругой, трудно лизируют клеточной стенки49.

Обнаружение полипа, пищеварение с ScPPX более конкретных и более чувствительны, чем флуоресценции обнаружения с DAPI и дешевле и технически более простой, чем преобразование полип в СПС с использованием ППК. Хотя ScPPX тормозится ДНК и РНК12, мы преодолели это с помощью очень большой избыток фермента (1 мкг на сэмпл) для достижения полного переваривания даже в бактерии, содержащие более чем 6000 нмоль полипа мг-1 белок29. Другие опубликованные методы использования 10-15 нг ScPPX на реакцию12,24. Наш протокол для ScPPX очистки обычно дает более чем 5 мг чистого ScPPX за литр гиперэкспрессия культуры, которая является достаточно для более чем 5000 анализов. Мы обнаружили, что несколько различных протоколов для очищения сродства никеля его меткой белков хорошо работать, чтобы очистить ScPPX оверэкспрессировали от pScPPX2 (данные не показаны), и существует широкий спектр таких протоколов, доступных для лабораторий с различной технические возможности.

Предыдущих протоколов, с помощью ScPPX пищеварение для обнаружения полипов часто полагались на Малахит на основе зеленого колориметрические анализов для количественного определения свободного фосфат6,12. Эти анализы являются чувствительными, но обычно требуют тщательно просчитано последовательного добавления два или три отдельные реагенты для точных измерений24,,5051. Системы на основе аскорбиновой кислоты обнаружения используется здесь24 имеет широкий Линейная дальность обнаружения чем Малахитовый зеленый без потери чувствительности, только предполагает добавление одного реагента и не требуют точного времени.

Есть несколько шагов, которые имеют решающее значение для успеха этого протокола. Во-первых, бактериальные образцы должны анализироваться в GITC сразу же после сбора урожая, обеспечить, что полип уровни не изменяются после времени выборки и быстро инактивирует сотовой фосфатаз. Во-вторых, не инкубировать GITC лизатов на 95 ° C для более чем 10 мин и хранить их сразу же после на-80 ° C для сведения к минимуму возможных полипа гидролиза. В-третьих Будьте внимательны при закупорить образцов в 96-луночных пластины для белка или фосфата измерений не всплеск или капельно ничего от одного образца на другой. Колориметрические анализов, особенно для фосфат, очень чувствительны, и небольшое количество загрязнения может сильно исказить результаты. Наконец некоторые реактивы, используемые в настоящем Протоколе (т.е. ScPPX, решения по обнаружению) имеют ограниченный шельфа жизни. Подготовьте свежие ScPPX каждые 6 месяцев и свежие решения обнаружения каждый месяц.

Одно ограничение нашего метода является, что кремний столбцы не связывайте полипа менее 60 фосфатных единиц долго очень хорошо12,14,15. Хотя обычно бактерий синтезировать главным образом длинноцепочечных полипа3, мы рекомендуем предварительные эксперименты, оценить длину цепочки в данной бактериальных видов перед использованием с помощью электрофореза геля полиакриламида27,30 Наша процедура. Для видов, где короткоцепные полипа составляет существенную часть бассейна полипа наш протокол не подходит, и мы рекомендуем извлечения полипа, другой метод (например, извлечение фенола хлороформ12) и хотел бы также рекомендовать дополняющего ScPPX пищеварение с коммерчески доступных S. cereviseae пирофосфатаза (PPA1)24, так как ScPPX не переварить пирофосфат13 и это имеет пропорционально большее влияние на измерениях, короче-цепи Полип. Как альтернатива ScPPX кислотного гидролиза38 могут быть использованы для гидролизуют полипа освободить фосфат, но это потребовало бы дополнительных DNase, RNase, очистки и меры для обеспечения что был измеряется только полип производные фосфатов. В некоторых случаях это может быть полезно использовать метод альтернативного извлечения для проверки, является ли эффективность добычи полипа с GITC колеблется от штаммов или условий, особенно с бактериями, знаны, что имеют толстые стенки клеток, таких как микобактерий. Если уровни полипа ниже предела обнаружения этот assay имеют важное значение для изучения отдельных видов, это может быть необходимо использовать разные обнаружения схему, например с использованием ППК для преобразования полип в СПС, которые могут быть обнаружены крайне чувствительно с помощью коммерчески доступных анализов на основе Люцифераза14,17,18.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Этот проект был поддержан Университет штата Алабама в Бирмингеме Кафедра микробиологии запуска средства и NIH Грант R35GM124590 (MJG) и низ Грант R01AI121364 (FW).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plasmid pScPPX2Addgene112877available to academic and other non-profit institutions
LB brothFisher ScientificBP1427-2E. coli growth medium
ampicillinFisher ScientificBP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Gold BiotechnologyI2481C
HEPES bufferGold BiotechnologyH-400-1
potassium hydroxide (KOH)Fisher ScientificP250500for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazoleFisher ScientificO3196500
lysozymeFisher ScientificAAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP columnGE Life Sciences17040901any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrateFisher ScientificAC415611000for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filtersFisher Scientific09-302-168
Bradford reagentBio-Rad5000205
Tris bufferFisher ScientificBP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667Bother dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA144-212for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl)Fisher ScientificP217500
glycerolFisher ScientificBP2294
10x MOPS medium mixtureTeknovaM2101E. coli growth medium
glucoseFisher ScientificD161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
dehydrated yeast extractFisher ScientificDF0886-17-0
tryptoneFisher ScientificBP1421-500
magnesium sulfate heptahydrateFisher ScientificM63-50
manganese sulfate monohydrateFisher ScientificM113-500
guanidine isothiocyanateFisher ScientificBP221-250
bovine serum albumin (protease-free)Fisher ScientificBP9703100
clear flat bottom 96-well platesSigma-AldrichM0812-100EAany clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate readerTecan, Inc.not applicableany plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanolFisher Scientific04-355-451
silica membrane spin columnsEpoch Life Science1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher ScientificBP120500
1.5 mL microfuge tubesFisher ScientificNC9580154
ammonium acetateFisher ScientificA637-500
antimony potassium tartrateFisher ScientificAAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
ammonium heptamolybdateFisher ScientificAAA1376630
ascorbic acidFisher ScientificAC401471000

Ссылки

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63(2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27(2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267(2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  33. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757(2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76(2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143exopolyphosphatase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены