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Wir beschreiben eine einfache Methode für schnelle Quantifizierung von anorganischen Polyphosphat in verschiedenen Bakterien, einschließlich gramnegative und grampositive mykobakteriellen Arten.
Anorganisches Polyphosphat (Polypen) ist eine biologische Polymer in den Zellen aus allen Bereichen des Lebens gefunden und ist erforderlich für die Virulenz und die Stress-Reaktion in vielen Bakterien. Es gibt eine Vielzahl von Methoden zur Quantifizierung PolyP in biologischen Materialien, von die viele arbeitsintensive oder unsensibel, ihre Nützlichkeit zu begrenzen sind. Wir stellen Ihnen hier eine optimierte Methode zur Quantifizierung der PolyP in Bakterien, über eine Kieselsäure Membran Spalte Extraktion optimiert für schnelle Verarbeitung von mehreren Proben, Verdauung der PolyP mit dem PolyP-spezifische Exopolyphosphatase ScPPX und Erkennung von der daraus resultierende freie Phosphat mit einem sensiblen Ascorbinsäure-basierte farbmetrischen Assay. Dieses Verfahren ist einfach, kostengünstig und ermöglicht zuverlässige PolyP Quantifizierung in unterschiedlichen Bakterienarten. Wir präsentieren Ihnen repräsentative PolyP Quantifizierung von Gram-negativen Bakteriums (Escherichia coli), grampositive Milchsäure-Bakterien (Lactobacillus Reuteri) und der mykobakteriellen Spezies (Mycobacterium Smegmatis). Wir sind auch ein einfaches Protokoll für Nickel Affinitätsreinigung mg-Mengen von ScPPX, die derzeit nicht im Handel erhältlich.
Anorganisches Polyphosphat (Polypen) ist eine lineare Biopolymer Phosphoanhydride verknüpft Phosphat-Einheiten, die in allen Bereichen des Lebens1,2,3gefunden wird. In verschiedenen Bakterien ist PolyP essentiell für Stress-Reaktion, Beweglichkeit, Biofilmbildung, Zellzyklus-Kontrolle, Antibiotika-Resistenz und Virulenz4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studien der PolyP Stoffwechsel in Bakterien haben daher das Potenzial, grundlegende Einblicke in die Fähigkeit der Bakterien verursachen Krankheiten und gedeihen in unterschiedlichen Umgebungen. In vielen Fällen sind jedoch die verfügbaren Methoden zur Quantifizierung PolyP in Bakterienzellen ein limitierender Faktor in diesen Studien.
Es gibt mehrere Methoden, die derzeit zur Messung der PolyP Ebenen in biologischem Material. Diese Methoden beinhalten in der Regel zwei verschiedene Schritte: Extrahieren von Polypen und Quantifizierung der PolyP präsentieren in diesen Extrakten. Die aktuelle Gold-Standard-Methode, entwickelt für die Hefe Saccharomyces Cerevisiae von Bru und Kollegen12, Extrakte Polypen zusammen mit DNA und RNA mit Phenol und Chloroform, gefolgt von Ethanol Niederschlag, Behandlung mit Deoxyribonuclease (DNase) und Ribonuklease (RNase) und Verdauung der daraus resultierenden gereinigten Polypen mit S. Cerevisiae PolyP-abbauenden Enzyms Exopolyphosphatase (ScPPX)13 bis freie Phosphat, nachgeben, die dann quantifiziert wird mit einem Malachit Grün-basierte kolorimetrischen Probe. Dieses Verfahren ist sehr quantitative aber arbeitsintensiv, Begrenzung der Anzahl der Proben, die in einem einzigen Experiment verarbeitet werden können, und ist nicht optimiert für bakterielle Proben. Andere haben berichtet, Extrahieren von PolyP aus einer Vielzahl von Zellen und Geweben mit Kieselsäure Perlen ("Glassmilk") oder Kieselsäure Membran Spalten6,14,15,16,17, 18. Diese Methoden extrahieren nicht effizient kurzkettigen PolyP (weniger als 60 Phosphat Einheiten)12,14,15, zwar von weniger Belang für Bakterien, die in der Regel gedacht werden, um in erster Linie zu synthetisieren ist langkettige PolyP3. Ältere Methoden der PolyP Extraktion mit starken Säuren19,20 sind nicht mehr weit verbreitet, da Polypen unter sauren Bedingungen12instabil ist.
Es gibt auch eine Vielzahl von gemeldeten Methoden zur Quantifizierung PolyP. Zu den häufigsten ist 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), ein Fluoreszenzfarbstoff mehr normalerweise verwendet, um DNA zu beflecken. DAPI-PolyP komplexe haben unterschiedliche Fluoreszenz Emission und Erregung Maxima als DAPI-DNA-komplexen21,22, aber es gibt erheblichen Störungen von anderen zellulären Komponenten, einschließlich RNA, Nukleotide und Inosit Phosphate12,15,16,23, Verringerung der Spezifität und Sensitivität der PolyP Messungen mit dieser Methode. Alternativ können Polypen und Adenosin-diphosphat (ADP) in Adenosintriphosphat (ATP) mit gereinigtem Escherichia coli umgewandelt werden Polypen Kinase (PPK) und die daraus resultierende ATP quantifiziert mit Luciferase14,17 ,18. Dies erlaubt den Nachweis sehr kleiner Mengen von Polypen, aber erfordert zwei enzymatische Reaktionsschritte und sowohl Luciferin und sehr reine ADP, die teure Reagenzien sind. ScPPX, die speziell Übersichten PolyP in freie Phosphat6,12,13,24, die mit einfacheren Methoden, aber ScPPX erkannt werden kann durch DNA und RNA12gehemmt wird, Meißel-DNase und RNase-Behandlung von Polypen-haltigen Extrakten. Weder die PPK als auch die ScPPX sind im Handel erhältlich, und PPK Reinigung ist relativ komplex25,26.
PolyP in Zelle Lysates oder Extrakte kann auch visualisiert werden auf Polyacrylamid-Gele von DAPI negative Färbung27,28,29,30, eine Methode, die erlaubt die Beurteilung der Kettenlänge, sondern ist niedrig-Durchsatz und schlecht quantitative.
Wir berichten nun einen schnell, preiswert, Medium-Durchsatz PolyP-Assay, der schnelle Quantifizierung der PolyP Ebenen in unterschiedlichen Bakterienarten ermöglicht. Diese Methode beginnt mit der Lyse der Bakterienzellen bei 95 ° C in 4 M Guanidin erfolgt (GITC)14 um zelluläre Phosphatasen, gefolgt von einer Kieselsäure Membran Spalte Extraktion optimiert für schnelle Bearbeitung mehrerer Proben zu inaktivieren. Der daraus resultierende PolyP-haltiger Extrakt wird dann mit einem großen Überschuss von ScPPX, wodurch die Notwendigkeit für DNase und RNase-Behandlung verdaut. Wir sind ein Protokoll für einfache Nickel Affinitätsreinigung mg-Mengen von ScPPX. PolyP abgeleitet frei Phosphat ist schließlich mit einem einfach, sensible, Ascorbinsäure-basierte kolorimetrischen Probe24 quantifiziert und normiert auf zelluläre Gesamtprotein. Diese Methode vereinfacht die Messung der PolyP in Bakterienzellen, und wir zeigen seine Verwendung mit repräsentativer Arten von Gram-negativen Bakterien, grampositive Bakterien und Mykobakterien.
1. reinigen Hefe Exopolyphosphatase (ScPPX)
(2) Ernte Proben für Polyphosphat Extraktion
3. Messung des Eiweißgehalts der Zelle Lysates
4. extrahieren Polyphosphat
(5) verdauen Polyphosphat
6. Nachweis von freien Phosphat24
7. Berechnung der zellulären Polyphosphat Inhalt
In vereinfachter Form in Abbildung 1sind die wichtigsten Schritte des Protokolls diagrammed.
Veranschaulichen die Verwendung dieses Protokolls mit Gram-negativen Bakterien, Wildtyp E. Coli war MG165539 gewachsen, Mid Log-Phase im Reich LB-Medium bei 37 ° C mit schütteln (200 u/min), dann gespült und für weitere 2 h in inkubiert Morpholinopropanesulfonate-gepuffert (MOPS) minimale mittlere40 mit 4 g L-1 Glukose und 0,1 mM K2HPO4, eine Bedingung bekannt, Produktion von PolyP14,29zu induzieren. Wie in Abbildung 2A, erkannt wir keine Polypen in Wildtyp E. Coli gewachsen in LB und 192 ± 14 (Mittelwert ± Standardabweichung [SD]) Nmol PolyP mg-1 Gesamtprotein im MOPS, konsistent mit früheren Berichten14,29 . Wie erwartet ein ∆Ppk mutierten6, welche Mängel PolyP Kinase41, produziert keine Polypen in jedem Medium, produziert ein ∆Ppx mutierten6, die Exopolyphosphatase42fehlt, etwa die gleiche Menge an PolyP als der Wildtyp und einem ∆PhoB mutierten29, die in Phosphat Transport defekt, produziert deutlich weniger Polypen als der Wildtyp14,29,43.
Die Verwendung dieses Protokolls mit Gram-positiven Bakterien, Wildtyp L. Reuteri demonstrieren waren ATCC PTA 647536 und einer isogenen ppk1 null Mutant fehlt PolyP-Kinase, konstruiert unter der Regie von Oligo Restriktionsenzymen44, gestiegen, über Nacht in MEI-C bei 37 ° C ohne schütteln. Wie in Abbildung 2 b, der Wildtyp kumulierte 51 ± 6 Nmol PolyP mg-1 Gesamt-Protein unter diesen Bedingungen gezeigt, während die ppk1 mutierten kleiner als Hälfte diese Menge enthalten. L. Reuteri enthält eine zweite PolyP-Kinase kodiert, indem die ppk2 gen45, die vermutlich entfallen die Polypen in der ppk1 -null-Mutante präsentieren.
Um die Verwendung dieses Protokolls mit Mykobakterien zu demonstrieren, wurde Mycobacterium Smegmatis Stamm SMR546 Hartmans de Bont (HdB) mittlere47, dann gespült und verwässerte das Fünffache in HdB oder HdB mit 2 % Ethanol angebaut, Mid Log-Phase. Diese Kulturen wurden dann über Nacht bei 37 ° C mit schütteln (180 u/min) inkubiert. Wie in Abbildung 2gezeigt, in der Abwesenheit von Ethanol, angesammelt M. Smegmatis 141 ± 52 Nmol PolyP mg-1 Gesamt-Protein, während Ethanol Behandlung 102 Nmol PolyP mg-1 Gesamt-Protein eine Verdreifachung 437 ± geführt. Dieses Ergebnis war zu erwarten, da Ethanol zuvor gemeldet wurde, PolyP Ebenen M. Smegmatis48zu erheben.
Abbildung 1: Schematische Darstellung Polyphosphat Extraktion und Messung Verfahren. Die wesentlichen Schritte des Protokolls PolyP Quantifizierung werden dargestellt. Bakterienzelle Pellets sind bei 95 ° C im GITC (Guanidin erfolgt) lysiert. Kleine aliquoten die Lysates sind für den Eiweißgehalt unter Verwendung des Bradford-Tests untersucht. PolyP wird abgesaugt, mit Kieselsäure Membran Spalten und dann mit ScPPX verdaut. Die daraus resultierende freie Phosphat wird quantifiziert mit der Ascorbinsäure-Test. Insgesamt PolyP abgeleitet Phosphat ist in Gesamt-Protein für jede Probe normalisiert. Eine595 = Extinktion bei 595 nm; Ein882 = Extinktion bei 882 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Vertreter führt mit verschiedenen Bakterien. (A) E. Coli MG1655 Wildtyp und isogenen ∆Ppk, ∆Ppxund ∆PhoB Mutanten wurden angebaut, bei 37 ° C mit schütteln (200 u/min) auf einem600 = 0,2 - 0,4 im Reich LB-Medium (schwarze Kreise) und dann verschoben auf minimaler Medium (MOPS mit 4 g L-1 Glukose und 0,1 mM K2HPO4) 2 h (weiße Kreise; n = 3, ± SD). (B) L. Reuteri ATCC PTA 6475 (Kreise) und eine isogenen ppk1 null-Mutante (Dreiecke) waren Erwachsene über Nacht bei 37 ° C in MEI-C Medium ohne schütteln (n = 3, ± SD). (C) M. Smegmatis SMR5 wurde angebaut, bei 37 ° C mit schütteln (180 u/min) auf einem600 = 1 in HdB Medium mit (geschlossene Quadrate) oder ohne (offene Quadrate) 2 % Äthanol (n = 3, ± SD). PolyP Ebenen sind durch die Konzentration der einzelnen Polypen abgeleitet freie Phosphat ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Das hier beschriebene Protokoll vereinfacht und beschleunigt die Quantifizierung der PolyP Ebenen in unterschiedlichen Bakterien mit einem typischen Satz von 24 Proben nehmen ca. 1,5 h vollständig verarbeiten. Dies ermöglicht eine schnelle Screening von Proben und Analyse der mutierten Bibliotheken und vereinfacht kinetische Experimente, die die Ansammlung von Polypen im Laufe der Zeit zu messen. Wir haben bewiesen, dass das Protokoll effektiv auf Vertreter der drei verschiedene Stämme funktioniert: Proteobakterien, Firmicuten, und Actinobacteria, sind berüchtigt für ihre robust und schwer zu lösen Sie Zellwände49.
Nachweis von Polypen durch Vergärung mit ScPPX ist spezifischer und empfindlicher als Fluoreszenz-Detektion mit DAPI und ist billiger und technisch unkompliziert als Umwandlung von Polypen zu ATP mit PPK. Obwohl ScPPX von DNA und RNA12gehemmt wird, haben wir dies überwinden, mit einem sehr großen Überschuss des Enzyms (1 µg pro Probe), komplette Verdauung auch in Bakterien, enthält mehr als 6.000 Nmol PolyP mg-1 Protein29zu erreichen. Anderen veröffentlichten Methoden Gebrauch 10 bis 15 ng von ScPPX pro Reaktion12,24. Unser Protokoll zur ScPPX Reinigung ergibt in der Regel mehr als 5 mg reines ScPPX pro Liter Überexpression Kultur, das reicht für mehr als 5.000 Assays. Wir haben festgestellt, dass mehrere unterschiedliche Protokolle für Nickel-Affinität Reinigung des His-Tags Proteine funktionieren gut in ScPPX überexprimiert von pScPPX2 zu reinigen (Daten nicht gezeigt), und es gibt eine Vielzahl solcher Protokolle zur Verfügung Labors mit unterschiedlichen technische Kapazitäten.
Frühere Protokolle mit ScPPX Verdauung für die Erkennung von Polypen Vertrauen oft auf Malachit Grün-basierte farbmetrischen Assays, freie Phosphat6,12zu quantifizieren. Diese Tests sind empfindlich, aber in der Regel werden sorgfältig zeitlich aufeinanderfolgende Zugabe von zwei oder drei separaten Reagenzien, genaue Messungen24,50,51zu machen. Die Ascorbinsäure-basierte Detektionssystem verwendet hier24 hat eine breitere linearen Bereich der Erkennung als Malachitgrün ohne Verlust der Sensibilität, betrifft nur die Zugabe von einem einzigen Reagens und erfordert keine präzise Zeitmessung.
Es gibt mehrere Schritte, die entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls sind. Erste, bakterielle Proben sollte sofort nach der Ernte in GITC lysiert werden, um sicherzustellen, dass Polypen Ebenen nicht nach dem Zeitpunkt der Probenahme ändern und zelluläre Phosphatasen rasch inaktivieren. Zweitens nicht GITC Lysates bei 95 ° C für mehr als 10 min inkubieren, und speichern Sie sie sofort danach bei-80 ° C möglich PolyP Hydrolyse zu minimieren. Drittens: Seien Sie vorsichtig beim Pipettieren der Proben in 96-Well-Platten für Protein oder Phosphat Messungen nicht zu spritzen oder Tropfen alles von eine Probe in ein anderes. Die farbmetrischen Assays, besonders für Phosphat, sind sehr empfindlich, und geringe Mengen an Verunreinigungen können die Ergebnisse stark verzerren. Schließlich haben einige Reagenzien, die in diesem Protokoll (d. h. ScPPX, Angriffsermittlungslösung) Haltbarkeit begrenzt. Frische ScPPX vorbereiten, alle 6 Monate und frisch Angriffsermittlungslösung jeden Monat.
Eine Einschränkung unserer Methode ist, dass Kieselsäure Spalten nicht PolyP weniger als 60 Phosphat Einheiten lange sehr gut12,14,15 binden. Obwohl Bakterien in der Regel meist langkettigen PolyP3synthetisieren, empfehlen wir Vorversuchen mit Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese27,30 Kettenlänge in einem bestimmten Bakterienarten vor der Verwendung zu bewerten Unser Verfahren. Für Arten wo kurzkettige PolyP einen wesentlichen Teil der PolyP Pool macht, unser Protokoll eignet sich nicht und wir empfehlen Polypen zu kassieren, indem eine andere Methode (z.B. Phenol-Chloroform Extraktion12), und würde auch empfehlen zur Ergänzung der ScPPX Verdauung mit handelsüblichen S. Cereviseae hat Pyrophosphatase (PPA1)24, da ScPPX nicht Pyrophosphat13 und dies verdauen wird eine proportional größere Wirkung auf Messungen der kürzere Kette PolyP. Als Alternative zu ScPPX saure Hydrolyse38 Hydrolyseneigung Polypen um Phosphat frei verwendet werden könnten, aber dazu müssten zusätzliche DNase, RNase und Reinigung Schritte um sicherzustellen, dass nur Polypen abgeleitet Phosphat gemessen wurde. In einigen Fällen ist es möglicherweise sinnvoll, eine alternative Methode zu verwenden, um zu testen, ob die Effizienz der PolyP Extraktion mit GITC zwischen Stämmen oder Bedingungen, insbesondere mit Bakterien bekannt variiert, Dicke Zellwände wie Mykobakterien haben. Wenn Polypen unterhalb der Nachweisgrenze des Assays für Studien einer bestimmten Art wichtig sind, kann es sein erforderlich, verwenden Sie eine verschiedene Erkennung Schema, wie die Verwendung von PPK umzuwandeln PolyP in ATP, die extrem sensibel mit nachgewiesen werden können handelsübliche Luciferase basierende Assays14,17,18.
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Dieses Projekt wurde von der University of Alabama bei Birmingham Institut für Mikrobiologie Start Fonds und NIH Grant R35GM124590 (MJG) und NIH Grant R01AI121364 (FW) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
glucose | Fisher Scientific | D161 | |
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
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