Analizzando per polifosfato inorganico nei batteri

Descriviamo un metodo semplice per rapida quantificazione di polifosfato inorganico in diversi batteri, tra cui specie micobatteriche, Gram-positivi e Gram-negative.

Polifosfato inorganico (polipo) è un polimero biologico trovato in cellule da tutti i domini della vita ed è necessaria per la virulenza e la risposta allo stress in molti batteri. Ci sono una varietà di metodi per quantificare polyP nei materiali biologici, molti dei quali sono laboriosi o insensibile, limitando la loro utilità. Presentiamo qui un metodo semplificato per la quantificazione del polipo nei batteri, usando un'estrazione della colonna membrana silice ottimizzata per un'elaborazione rapida di più campioni, digestione del polipo con il polipo specifiche exopolyphosphatase ScPPX e rilevamento della risultante fosfato libero con un saggio colorimetrico basato su acido ascorbico sensibile. Questa procedura è semplice, poco costoso e permette la quantificazione affidabile polipo in diverse specie batteriche. Vi presentiamo la quantificazione di polipo rappresentativo dal batterio gram-negativo (Escherichia coli), il batterio gram-positivo dell'acido lattico (Lactobacillus reuteri) e la specie micobatterica (Mycobacterium smegmatis). Abbiamo anche un semplice protocollo per purificazione di affinità del nichel di quantità di mg di ScPPX, che non è attualmente disponibile in commercio.

Polifosfato inorganico (polipo) è un biopolimero lineare delle unità di fosfato phosphoanhydride-collegato che si trova in tutti i domini di vita^1,2,3. In diversi batteri, polipo è essenziale per la risposta allo stress, motilità, formazione di biofilm, controllo del ciclo cellulare, antibiotico-resistenza e virulenza^{4,5,6,7,8 ,9,10,11}. Studi del metabolismo di polipo in batteri quindi hanno il potenziale per produrre intuizioni fondamentali la capacità dei batteri di causare malattia e prosperano in ambienti diversi. In molti casi, tuttavia, i metodi disponibili per quantificare polipo in cellule batteriche sono un fattore limitante in questi studi.

Ci sono diversi metodi attualmente utilizzati per misurare i livelli di polipo in materiali biologici. Questi metodi implicano in genere due fasi distinte: estrazione di polipo e quantificare il polipo presente in tali estratti. L'attuale metodo gold standard, sviluppato per il lievito Saccharomyces cerevisiae da Bru e colleghi¹², polipo estratti insieme a DNA e RNA usando fenolo e cloroformio, seguita dalla precipitazione dell'etanolo, il trattamento con desossiribonucleasi (DNasi) e ribonucleasi (RNasi) e la digestione del polyP purificato risultante con lo S. cerevisiae polipo-degradanti enzima exopolyphosphatase (ScPPX)¹³ a cedere gratis fosfato, che è poi quantificato utilizzando un analisi colorimetrica base verde di malachite. Questa procedura è altamente quantitativa ma alta intensità di lavoro, limitando il numero di campioni che possono essere elaborati in un singolo esperimento e non è ottimizzato per campioni batterici. Altri hanno segnalato estrazione polipo da una varietà di cellule e tessuti utilizzando perline ("glassmilk") di silice o silice membrana colonne^{6,14,15,16,17, 18}. Questi metodi non estrarre in modo efficiente catena corta polipo (meno di 60 unità di fosfato)^12,14,15, anche se questo è di meno preoccupazione per i batteri, che sono pensati generalmente per sintetizzare principalmente Polipo della lungo-catena³. Vecchi metodi di estrazione di polipo con acidi forti^19,20 non più ampiamente sono usati, poiché il polyP è instabile in condizioni acide¹².

Ci sono anche una varietà di metodi segnalati per quantificare il polyP. Tra i più comuni è 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), una tintura fluorescente più tipicamente usata per macchiare il DNA. Complessi di DAPI-polipo hanno maxima di eccitazione e di emissione di fluorescenza diversi oltre DAPI-DNA complessi^21,22, ma c'è una notevole interferenza da altri componenti cellulari, tra cui RNA, nucleotidi e inositolo fosfati^12,15,16,23, riducendo la specificità e la sensibilità delle misurazioni di polipo effettuate utilizzando questo metodo. In alternativa, il polipo e adenosina difosfato (ADP) può essere convertiti in adenosina trifosfato (ATP) usando purificato Escherichia coli chinasi polipo (PPK) e l'ATP risultante quantificati tramite luciferasi^{14,17 ,18}. Questo permette la rilevazione di piccole quantità di polipo, ma richiede due fasi di reazione enzimatica e luciferina e ADP molto puro, che sono i reagenti costosi. In particolare il digest polipo in fosfato libero^6,12,13,24, che può essere rilevato utilizzando metodi più semplici, ma ScPPX è inibita da DNA e RNA¹², ScPPX trattamento della dnasi e RNasi che necessita di polipo-contenenti estratti. PPK, né ScPPX sono disponibili in commercio, e purificazione di PPK è relativamente complesso^25,26.

Polipo in lisati cellulari o estratti possa anche essere visualizzato su gel di poliacrilammide di DAPI^27,28,29,30, un metodo che permette la valutazione della lunghezza della catena, ma è la macchiatura negativa scarsamente quantitativa e bassa velocità.

Ora segnaliamo un saggio di polipo veloce, poco costoso, media-velocità di trasmissione che permette la rapida quantificazione del polyP livelli in diverse specie batteriche. Questo metodo inizia con la lisi delle cellule batteriche a 95 ° C in 4m guanidina isotiocianato (GITC)¹⁴ per inattivare cellulare fosfatasi, seguite da un'estrazione della colonna membrana silice ottimizzata per un'elaborazione rapida di campioni multipli. Il polipo-contenere l'Estratto risultante viene poi digerito con un grande eccesso di ScPPX, eliminando la necessità per il trattamento della dnasi e RNasi. Includiamo un protocollo per la purificazione di affinità nichel semplice di quantità di mg di ScPPX. Infine, fosfato libero polipo-derivato è quantificato con un saggio colorimetrico semplice, sensibile, basati su acido ascorbico²⁴ e normalizzato a proteine cellulari totali. Questo metodo semplifica la misurazione del polipo in cellule batteriche, e dimostriamo l'utilizzo con specie rappresentative di batteri gram-negativi, batteri Gram-positivi e micobatteri.

1. purificare il lievito Exopolyphosphatase (ScPPX)

1. Trasformare il ceppo di sovraespressione di proteina di e. coli BL21 (DE3)³¹ con plasmide pScPPX2⁶ di elettroporazione³² o trasformazione chimica³³.
2. Inoculare 1 L di brodo di Lisogenesi (LB) contenente 100 µ g ampicillina di^-1 mL in un pallone da 2 L unbaffled con una singola colonia di BL21 (DE3) contenente pScPPX2 e incubi durante la notte a 37 ° C senza agitazione, per un'assorbanza a 600 nm (un₆₀₀) di circa 0.3, misurata con uno spettrofotometro.
3. Avviare la cultura agitazione (180 giri/min) e incubare per 30 min a 37 ° C, durante il quale le cellule crescerà a un A₆₀₀ di 0,4 - 0,5.
4. Aggiungere isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM e un ulteriore 100 µ g mL^-1 è ampicillin, quindi incubare per 4 h a 37 ° C con agitazione a 180 giri/min.
   Nota: Questo protocollo di sovraespressione genera una grande quantità di ScPPX solubile. Tuttavia, la sovraespressione di ScPPX è molto indulgente, e una varietà di altri comuni protocolli di sovraespressione della proteina sono stati usati per purificare con successo ScPPX.
5. Trasferire le cellule a una centrifuga 1 L e raccoglierle mediante centrifugazione per 20 min a 5000 x g a 4 ° C. Eliminare il surnatante e trasferire il pellet cellulare in una provetta conica da 50 mL.
   Nota: Palline delle cellule possono essere conservati a tempo indeterminato a-80 ° C.
6. Scongelare il pellet sul ghiaccio, quindi esso risospendere in 9 mL di 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl e imidazolo di 5 mM (pH 8) per un volume totale di circa 10 mL.
7. Aggiungere (concentrazioni finali) 1 mg mL^-1 lisozima, 2 mM MgCl₂e 50 unità mL^-1 di un'endonucleasi di RNA e DNA-degradanti (Vedi Tabella materiali) ed incubare per 30 min in ghiaccio.
   Nota: ScPPX lega gli acidi nucleici (dati non mostrati), così il trattamento nucleasi è essenziale durante la purificazione.
8. Utilizzando un sonicatore con un microtip (Vedi Tabella materiali), lisare le cellule da 2 cicli di sonicazione su ghiaccio al 50% di potenza, pulsare 5 s s on e 5 fuori, con un resto di 2 min tra i cicli.
   Nota: Utilizzare adeguate protezioni acustiche durante la sonicazione. Analogamente al caso con sovraespressione, una varietà di metodi di lisi delle cellule sono accettabili per la purificazione di ScPPX.
9. Rimuovere i detriti insolubili mediante centrifugazione il lisato per 20 min a 20.000 x g a 4 ° C. Filtrare il surnatante risultante (circa 10 mL) attraverso un filtro di siringa di 0,8 µm poro dimensione dell'acetato di cellulosa.
10. Caricare il lisato su una carica di nichel 5 mL chelanti colonna (Vedi Tabella materiali) utilizzando una pompa peristaltica o una grossa siringa.
11. Lavare la colonna con 50 mL di imidazolo di 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5 mM (pH 8).
12. Lavare la colonna con 50 mL di imidazolo di 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20 mM (pH 8).
13. Eluire ScPPX con 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl e imidazolo di 0,5 M (pH 8), raccolta 15 frazioni di 1 mL. Prova queste frazioni di eluizione per contenuto proteico con il dosaggio di proteina Bradford³⁴ (Vedi Tabella materiali) ed eseguire un gel di SDS-PAGE³⁵ per confermare quali frazioni contengono ScPPX purificata (peso molecolare = 45 kDa).
14. Piscina le frazioni contenenti ScPPX puro e regolare la concentrazione della proteina in pool di circa 2 mg mL^-1 con 50 mM HEPES e 0,5 M di NaCl. Più alte concentrazioni di proteina possono precipitare nel passaggio successivo.
15. Scambiare il ScPPX purificata nel buffer di memoria (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, glicerolo al 10% [v/v]) tramite dialisi. Inserire frazioni ScPPX raccolte in una lunghezza sigillata di 12.000-14.000 Da peso molecolare cutoff dialisi membrana tubazione (Vedi Tabella materiali) e sospendere in 1 L di buffer di archiviazione con continua agitazione a 4 ° C per almeno 4 h. Ripetere questo passaggio con prodotti freschi buffer di memoria per un totale di 3 cambi di buffer.
16. Trasferire la proteina purificata, dializzata una provetta da centrifuga o tubi e centrifugare per 20 min a 20.000 x g a 4 ° C per rimuovere eventuali aggregati insolubili. Trasferire con cautela il surnatante in una provetta conica pulito da 15 mL.
17. Regolare la concentrazione della ScPPX purificata a 1 mg mL^-1 con buffer di archiviazione, aggiungere 0,1% (p/v) l'albumina di siero bovino indenne da proteasi (BSA; concentrazione finale) e conservare fino a 6 mesi a 4 ° C.
    Nota: ScPPX perde oltre il 90% della sua attività quando è congelato¹³.

2. raccolta campioni per l'estrazione di polifosfato

1. Crescere i batteri sotto le condizioni di interesse per determinare il contenuto di polipo. Per questo protocollo, crescere Lactobacillus reuteri³⁶ durante la notte a 37 ° C senza agitazione all'enzima malico induzione (MEI) media³⁷ senza cisteina (MEI-C).
2. Raccogliere abbastanza cellule mediante centrifugazione in una microcentrifuga da 1,5 mL a totale 50 – 100 µ g di proteina cellulare (Vedi punto 3 qui sotto). Per e. coli, si tratta di 1 mL di una cultura di fase di log a un A₆₀₀ di 0.2 - 0.4. Di L. reuteri, si tratta di 1 mL di una coltura durante la notte. Regolare come necessario per le altre specie di interesse.
3. Rimuovere completamente il supernatante dal pellet cellulare.
4. Risospendere il pellet cellulare in 250 µ l di tampone di lisi GITC (4m guanidina isotiocianato, 50 mM Tris-HCl, pH 7) e lisare mediante incubazione a 95 ° C per 10 min. Store lisati a-80 ° C.
   Nota: Essere coerente con il tempo di Lisi, poiché estesa incubazione a temperatura elevata potrebbe causare riduzione del polyP di idrolisi³⁸. Lisati possono essere conservati a tempo indeterminato a-80 ° C.
   Attenzione: Guanidina isotiocianato è un sale di caotropici e dovrebbe essere maneggiato con guanti e smaltito come rifiuti pericolosi.

3. misurazione del contenuto di proteina di lisati cellulari

1. Preparare gli standard di BSA che contiene 0, 0,1, 0,2 e 0,4 mg mL^-1 di BSA in tampone di lisi GITC.
   Nota: È importante rendere gli standard di BSA in GITC, poiché GITC influenza lo sviluppo del colore dell'analisi di Bradford. Standard di BSA possono essere conservati a tempo indeterminato a-20 ° C.
2. Aliquotare 5 µ l di lisati cellulari scongelati, omogeneizzato e di standard di BSA per separare pozzetti in una piastra a 96 pozzetti chiaro.
3. Aggiungere 195 µ l di reagente di Bradford³⁴ in ciascun pozzetto e misurare l'assorbanza a 595 nm (un₅₉₅) in un lettore di piastra (Vedi Tabella materiali).
4. Calcolare la quantità di proteina in ciascun pozzetto di confronto con la curva standard di BSA, usando la formula y = mx + b, dove y è un₅₉₅, x è µ g di BSA, m è la pendenza della curva standard, e b è l'intercetta y della curva standard. Moltiplicare il valore risultante da 0.05 a determinare il totale mg di proteina in ciascun campione.

4. estrazione di polifosfato

1. Aggiungere 250 µ l di etanolo al 95% per ogni campione GITC-lisati e vortex per mescolare.
2. Applicare tale miscela per una colonna di silice membrana spin e centrifugare per 30 s a 16.100 x g.
3. Scartare il flusso continuo, poi aggiungere 750 µ l di 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% di etanolo e centrifugare per 30 s a 16.100 x g.
4. Eliminare il flusso continuo e centrifugare per 2 min 16.100 x g.
5. Posizionare la colonna in una provetta di microfuge pulito da 1,5 mL e aggiungere 150 µ l di 50 mM Tris-HCl (pH 8).
6. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi eluire il polipo mediante centrifugazione per 2 min a 8.000 x g.
   Nota: Se lo si desidera, gli eluati possono conservati a-20 ° C per almeno 1 settimana.

5. digerendo polifosfato

1. Preparare standard contenenti lo 0, 5, 50 o fosfato di potassio 200 µM in 50 mM Tris-HCl (pH 8).
   Nota: Fosfati di potassio possono essere conservati a tempo indeterminato a temperatura ambiente.
2. Aliquotare e 100 µ l di ogni standard di fosfato e di estratti campioni di polipo in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti chiaro.
3. Preparare un mix master contenente (per campione): 30 µ l di 5 x ScPPX reazione tampone (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 250 millimetri di acetato di ammonio, pH 7.5)¹³e 19 µ l di H₂O 1 µ l di ScPPX purificato (1 mg mL^-1).
4. Aggiungere 50 µ l di master mix in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti. Incubare per 15 min a 37 ° C.
   Nota: Se lo si desidera, i polipo digerito campioni possono essere conservati a-20 ° C a tempo indeterminato.

6. rilevazione fosfato libero²⁴

1. Preparare la soluzione di rilevamento base sciogliendo 0,185 g di tartrato di antimonio in 200 mL di acqua, aggiungere 150 mL di 4 N H₂così₄, aggiungendo quindi 1,49 g di Eptamolibdato di ammonio. Mescolare per sciogliere e quindi portare ad un volume finale di 456 mL. Filtrare la soluzione per rimuovere particelle e conservare al riparo dalla luce a 4 ° C per 1 mese.
2. Preparare una soluzione di acido ascorbico 1 M. Conservare al riparo dalla luce a 4 ° C per 1 mese.
3. Preparare un brodo di lavoro fresco di soluzione di rilevamento ogni giorno mescolando 9,12 mL di soluzione di rilevamento base con 0,88 mL di acido ascorbico 1 M. Lasciare la soluzione di rilevamento di venire a temperatura ambiente prima dell'uso.
4. Aggiungere 50 µ l di soluzione di rilevamento per ogni campione e standard della piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per circa 2 min consentire lo sviluppo di colore.
5. Misurare l'assorbanza a 882 nm con un lettore di piastra e calcolare la concentrazione di fosfato di ciascun campione in confronto alla curva standard del fosfato di potassio.
   Attenzione: La soluzione di rilevamento contiene sali tossici e acidi forti. Indossare guanti e trattare la soluzione in eccesso come rifiuti tossici.

7. calcolo del contenuto cellulare di polifosfato

1. Convertire le concentrazioni di fosfato determinate nel passaggio 6.5 a nanomoles di polipo-derivati fosfato in ogni cella intero lisato secondo la seguente formula:
   Polipo nmol = 1,5 x (fosfato µM / 10)
   Nota: Il metodo basato sulla curva standard nel passaggio 6 determina la concentrazione di fosfato (in µM) in ciascun campione di polipo µ l 100 aliquotati al punto 5.2. Per convertire questa concentrazione in un numero di nmol, 100 µ l è diviso per 10⁶ per dare un volume in L, moltiplicato per la concentrazione (µmol L^-1), quindi moltiplicato per 1.000 (il numero di nmol in un µmol). Questo riduce al dividendo la concentrazione per 10. Il volume di estratto totale preparato nel passaggio 4 è 150 µ l, quindi è necessario moltiplicare il valore risultante per 1,5 per calcolare il nmol di fosfato presente nell'estratto intero.
2. Normalizzare il contenuto cellulare polipo alla proteina cellulare totale dividendo nmol polipo per la proteina totale di mg in ogni campione determinato al punto 3.4. Livelli di polipo sono espressi in termini di concentrazione di fosfato libero polipo-derivati individuo.
   Nota: In alcuni casi, la quantità di fosfato di polipo-derivati presente in un campione può rientrano nel range lineare della curva standard fosfato (passo 6.5). Se i livelli del polyP sono molto elevati, l'eluato contenente polipo in eccesso dal passaggio 4.6 può essere diluito 01:10 o 1: 100, se necessario e poi misurato nuovamente come descritto nei passaggi da 5 a 7.

I passaggi chiave del protocollo sono diagrammed in forma semplificata nella Figura 1.

Per illustrare l'utilizzo di questo protocollo con i batteri gram-negativi, il selvaggio-tipo e. coli MG1655³⁹ era cresciuto fino a Mid-registro fase nel terreno ricco di LB a 37 ° C con agitazione (200 giri), quindi sciacquati e incubati per altre 2 h in morpholinopropanesulfonate-buffered (MOPS) minimo medio⁴⁰ contenente 4 g L^-1 di glucosio e 0,1 mM K₂HPO₄, una circostanza conosciuta per indurre la produzione di polipo^14,29. Come mostrato nella Figura 2A, abbiamo non rilevato nessun polipo in tipo selvatico Escherichia coli coltivato in LB e 192 ± 14 (media ± deviazione standard [SD]) nmol polipo mg^-1 proteina totale in MOPS, coerente con precedenti rapporti^14,29 . Come previsto, un ∆ppk mutante⁶, cui manca polipo chinasi⁴¹, non prodotto nessun polipo in entrambi medio, un ∆ppx mutante⁶, che non ha exopolyphosphatase⁴², prodotto circa la stessa quantità di Polipo come wild-type e un ∆phoB mutante²⁹, che è difettoso in trasporto del fosfato, prodotto significativamente meno polipo oltre il selvaggio-tipo^14,29,43.

Per illustrare l'utilizzo di questo protocollo con i batteri Gram-positivi, il selvaggio-tipo L. reuteri ATCC PTA 6475³⁶ e un mutante di null isogeniche ppk1 privo della chinasi di polipo, costruita utilizzando oligo-regia recombineering⁴⁴, sono stati cresciuto durante la notte in MEI-C a 37 ° C senza agitazione. Come indicato nella Figura 2B, la proteina wild-type accumulato 51 ± 6 nmol polipo mg^-1 totale in queste condizioni, mentre il mutante di ppk1 contenuto in meno di metà di questa quantità. L. reuteri contiene una seconda chinasi di polipo, codificata dalla ppk2 gene⁴⁵, che presumibilmente rappresenta il polyP presenta nel mutante null ppk1 .

Per illustrare l'utilizzo di questo protocollo con i micobatteri, Mycobacterium smegmatis strain SMR5⁴⁶ era cresciuto alla fase di Mid-registro in reverendolys-de Bont (HdB) media⁴⁷, poi sciacquati e quintuplo diluito in HdB o HdB con 2% di etanolo. Queste culture sono state incubate quindi durante la notte a 37 ° C con agitazione (180 giri/min). Come mostrato in Figura 2, in assenza di etanolo, M. smegmatis accumulato 141 ± 52 nmol polipo mg^-1 proteina totale, mentre il trattamento dell'etanolo ha provocato un aumento triplo a 437 ± 102 nmol proteina polipo mg^-1 complessivo. Questo risultato era atteso, poiché etanolo precedentemente è stata segnalata per elevare i livelli di polipo in M. smegmatis⁴⁸.

Figura 1: schema della procedura di estrazione e misurazione di polifosfato. Sono illustrati i passaggi essenziali del protocollo di quantificazione di polipo. Pellet di cellule batteriche vengono lisate a 95 ° C in GITC (guanidina isotiocianato). Piccole aliquote dei lisati sono analizzate per il contenuto di proteine usando l'analisi di Bradford. Polipo è estratta utilizzando colonne di membrana di silice e poi digerito con ScPPX. Il fosfato libero risultante è quantificato utilizzando il dosaggio di acido ascorbico. Fosfato di polipo-derivata totale è normalizzato a proteine totali per ciascun campione. Un₅₉₅ = assorbanza a 595 nm; Un₈₈₂ = assorbanza a 882 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: rappresentante risultati con diversi batteri. (A), e. coli MG1655 wild-type e isogeniche ∆ppk, ∆ppxe mutantiphoB ∆ sono state coltivate a 37 ° C con agitazione (200 giri/min) a un₆₀₀ = 0.2 - 0.4 nel ricco LB medium (cerchi neri) e poi spostato a terreno minimo (MOPS contenente 4 g L^-1 di glucosio e 0,1 mM K₂HPO₄) per 2 h (cerchi bianchi; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC PTA 6475 (cerchi) e un mutante null isogeniche ppk1 (triangoli) si sono sviluppati durante la notte a 37 ° C in media di MEI-C senza agitazione (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 era cresciuta a 37 ° C con agitazione (180 giri/min) a un₆₀₀ = 1 in mezzo HdB con (piazze chiuse) o senza (piazze) 2% di etanolo (n = 3, ± SD). Livelli di polipo sono espressi in termini di concentrazione di fosfato libero polipo-derivati individuo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il protocollo descritto qui semplifica e accelera la quantificazione dei livelli di polipo in diversi batteri, con un tipico insieme di 24 campioni prendendo circa 1,5 h per elaborare completamente. Questo permette di screening rapido di campioni e analisi di librerie mutante e semplifica il esperimenti cinetici misura l'accumulo di polipo nel corso del tempo. Abbiamo dimostrato che il protocollo funziona in modo efficace sui rappresentanti di tre diversi phyla: proteobacteria, firmicutes e actinobacteria, che sono noti per la loro resiliente, difficile da lisare pareti cellulari⁴⁹.

Rilevamento del polyP di digestione con ScPPX è più specifico e più sensibile di rilevazione della fluorescenza con DAPI ed è più economico e tecnicamente più semplice di conversione di polipo all'ATP utilizzando PPK. Anche se ScPPX è inibita da DNA e RNA¹², abbiamo superato questo utilizzando un grande eccesso di enzima (1 µ g per campione) per raggiungere la digestione completa anche in batteri contenenti più di 6.000 nmol polipo mg^-1 proteina²⁹. Altri metodi pubblicati uso 10-15 ng di ScPPX per reazione^12,24. Il nostro protocollo per purificazione di ScPPX in genere produce più di 5 mg di puro ScPPX per litro della cultura di sovraespressione, che è sufficiente per più di 5.000 saggi. Abbiamo trovato che diversi protocolli per purificazione di nichel-affinità delle proteine His-tag funzionano bene per purificare ScPPX overexpressed da pScPPX2 (dati non mostrati), e ci sono una vasta gamma di tali protocolli disponibili per soddisfare i laboratori con diverse capacità tecniche.

Precedenti protocolli utilizzando ScPPX digestione per il rilevamento di polipo hanno spesso invocata malachite verde-based saggi colorimetrici per quantificare fosfato libero^6,12. Queste analisi sono sensibili, ma in genere richiedono accuratamente temporizzato aggiunta sequenziale di due o tre reagenti separati per fare misurazioni accurate^24,50,51. Il sistema di rilevamento basati su acido ascorbico usato qui²⁴ ha un più ampio intervallo lineare di rilevazione di verde malachite senza perdita di sensibilità, coinvolge solo l'aggiunta di un reagente singolo e non richiede precise timing.

Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per il successo del presente protocollo. Campioni in primo luogo, batterici dovrebbero essere lisati in GITC immediatamente dopo la raccolta, per garantire che i livelli di polipo non cambia dopo il tempo di campionamento e di inattivare rapidamente fosfatasi cellulari. In secondo luogo, non Incubare GITC lisati a 95 ° C per più di 10 min e riporli immediatamente in seguito a-80 ° C per ridurre al minimo idrolisi di polipo possibili. In terzo luogo, prestare attenzione quando dispensazione campioni in piastre da 96 pozzetti per le misure di proteina o fosfato di non schizzare o qualsiasi cosa, da un campione a goccia in un altro. I saggi colorimetrici, particolarmente per fosfato, sono molto sensibili, e piccole quantità di contaminazione fortemente può falsare i risultati. Infine, alcuni reagenti usati nel presente protocollo (cioè ScPPX, soluzione di rilevamento) hanno limitato la vita di scaffale. Preparare fresco ScPPX ogni 6 mesi e fresco soluzione di rilevamento ogni mese.

Una limitazione del nostro metodo è che le colonne di silice non legano polipo meno di 60 fosfato unità lungo molto ben^12,14,15. Sebbene i batteri sintetizzano in genere principalmente lungo-catena polipo³, si consiglia di esperimenti preliminari mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide^27,30 per valutare la lunghezza della catena in una determinata specie batterica prima di utilizzare la nostra procedura. Per specie dove catena corta polipo costituisce una frazione sostanziale della piscina polipo, il nostro protocollo non è appropriato e ti consigliamo di estrazione del polipo tramite un metodo diverso (ad es., fenolo-cloroformio estrazione¹²) e consiglierei anche integra ScPPX digestione con commercialmente disponibile S. cereviseae pirofosfatasi (PPA1)²⁴, poiché ScPPX non digerisce pirofosfato¹³ e questo ha un impatto proporzionalmente maggiore sulle misurazioni della più breve-catena Polipo. Come alternativa alla ScPPX, idrolisi acida³⁸ potrebbero essere utilizzati per idrolizzare il polipo per liberare fosfato, ma ciò richiederebbe ulteriori passaggi di DNasi, RNasi e purificazione per garantire che solo polipo-derivati fosfato è stato misurato. In alcuni casi, può essere utile utilizzare un metodo alternativo di estrazione per verificare se l'efficienza di estrazione di polipo con GITC varia tra ceppi o condizioni, specialmente con i batteri conosciuti per avere spessore pareti cellulari, quali i micobatteri. Se i livelli di polipo sotto il limite di rilevamento di questo test sono importanti per lo studio di una particolare specie, può essere necessario utilizzare uno schema di rilevamento differenti, ad esempio utilizzando PPK per convertire polipo in ATP, che può essere rilevato tramite estremamente sensibile analisi di luciferase-based commercialmente disponibili^14,17,18.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo progetto era sostenuto dalla University of Alabama a Birmingham dipartimento di microbiologia avvio fondi e sovvenzioni NIH R35GM124590 (per MJG) e NIH sovvenzione R01AI121364 (FW).