JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה פשוטה על כימות מהירה של אי-אורגנית הפוליפוספאט בחיידקים מגוונים, כולל זנים גראם שליליים, גראם חיובי ו- mycobacterial.

Abstract

הפוליפוספאט אי-אורגנית (פוליפ) הוא פולימר הביולוגי נמצאו תאים בכל תחומי החיים, והוא נדרש עבור התקפה אלימה ותגובת דחק בחיידקים רבים. ישנם מגוון רחב של שיטות לכימות פוליפ בחומרים ביולוגיים, שרבים מהם הם עתירי עבודה או רגישות, הגבלת התועלת שלהם. אנו מציגים כאן שיטה יעילה על פוליפ כימות של חיידקים, באמצעות סיליקה ממברנה טור החילוץ אופטימיזציה עבור עיבוד מהיר של מספר דגימות, העיכול של פוליפ עם exopolyphosphatase ספציפיים פוליפ ScPPX זיהוי של פוספט חינם שנוצר עם רגיש מבוססי חומצה אסקורבית ערכי צבע מוחלטים וזמינותו. הליך זה היא פשוטה, זולה, מאפשרת כימות פוליפ אמין מגוונת מיני החיידקים. אנו מציגים כימות פוליפ מייצג חיידק גראם שליליים (Escherichia coli), חיידק גראם חיוביים חומצה לקטית (לקטובצילוס reuteri), המין mycobacterial (Mycobacterium smegmatis). אנו כוללים גם פרוטוקול פשוט לטיהור זיקה ניקל של כמויות מ ג של ScPPX, אשר אינה כיום זמינים מסחרית.

Introduction

הפוליפוספאט אי-אורגנית (פוליפ) הוא ביופולימרים ליניארי של יחידות מקושרים phosphoanhydride פוספט המצויה בכל תחומי החיים-1,-2,-3. בחיידקים מגוונים, פוליפ הוא חיוני תגובת המתח, תנועתיות, ביופילמים, בקרה מחזור התא, עמידות לאנטיביוטיקה של התקפה אלימה4,5,6,7,8 ,9,10,11. מחקרים של פוליפ מטבוליזם של חיידקים לכן יש את הפוטנציאל להניב תובנות יסוד היכולת של החיידקים לגרום למחלות ולשגשג בסביבות מגוונות. עם זאת, במקרים רבים, השיטות הזמינות עבור לכימות פוליפ בתאי חיידקים הם גורם מגביל במחקרים אלה.

ישנן מספר שיטות בשימוש כיום כדי למדוד רמות פוליפ חומרים ביולוגיים. שיטות אלה כוללות בדרך כלל שני שלבים נפרדים: חילוץ פוליפ וכימות הפוליפ נוכח תמציות אלה. השיטה הנוכחית תקן הזהב, שפותחה עבור שמרים האפייה -ברו ועמיתיו12, תמציות פוליפ יחד עם ה-DNA ו- RNA באמצעות פנול, כלורופורם, ואחריו אתנול משקעים, טיפול עם deoxyribonuclease (DNase) ribonuclease (RNase), ואת מערכת העיכול של הפוליפ מטוהרים שנוצר עם cerevisiae ס משפיל-פוליפ אנזים exopolyphosphatase (ScPPX)13 תשואות פוספט חינם, אשר הוא אז לכמת באמצעות מלכיט מבוסס-ירוק ערכי צבע מוחלטים וזמינותו. ההליך זה מאוד כמותית אך עתירי עבודה, הגבלת מספר דוגמאות ניתן יהיה לעבד ניסוי יחיד, והוא אינו ממוטב עבור דגימות בקטריאליות. אחרים דיווחו על חילוץ פוליפ ממגוון רחב של תאים ורקמות חרוזים סיליקה ("glassmilk") או סיליקה ממברנה עמודות6,14,15,16,17, 18. שיטות אלה לא ביעילות לחלץ קצרות שרשרת פוליפ (פחות מ 60 יחידות פוספט)12,14,15, זה אמנם פחות לדאגה עבור חיידקים, אשר נחשבים בדרך כלל לסנתז בעיקר פוליפ ארוכי שרשרת3. שיטות בוגרים של פוליפ חילוץ באמצעות חומצות חזקות19,20 נמצאים בשימוש נרחב יותר, מאז פוליפ יציב תחת תנאים חומציים12.

יש גם מגוון רחב של שיטות דיווח פוליפ לכימות. בין הנפוצה ביותר היא 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), הפלורסנט יותר לרוב נעשה שימוש כדי להכתים את הדנ א. דאפי-פוליפ מתחמי maxima עירור, פליטת קרינה פלואורסצנטית שונה מאשר דאפי-DNA מתחמי21,22, אבל יש הפרעה ניכרת של רכיבים אחרים התאית, כולל ה-RNA, נוקלאוטידים ואינוזיטול פוספטים12,15,16,23, הפחתת רגישות של פוליפ מדידות שנעשו באמצעות שיטה זו של ירידה לפרטים. לחלופין, פוליפ, אדנוזין diphosphate (ADP) יכולים להיות מומרים אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות מטוהרים Escherichia coli פוליפ קינאז (ממ ק), וכתוצאה מכך מ- ATP לכמת באמצעות לוציפראז14,17 ,18. זה מאפשר הגילוי של כמויות קטנות מאוד של פוליפ, אך דורש שני צעדים התגובה אנזימטיות, luciferin והן ADP טהור, אשר ריאגנטים יקר. ScPPX במיוחד מעכל פוליפ לתוך פוספט חינם6,12,13,24, אשר ניתן לאתרם באמצעות שיטות פשוטות יותר, אבל ScPPX מעוכבת על ידי DNA ו- RNA12, המחייב DNase RNase וטיפול של פוליפ המכילים תמציות. ממ ק וגם ScPPX הם זמינים מסחרית, טיהור ממ ק מורכבות יחסית25,26.

פוליפ תא lysates או תמציות גם להיות visualized על ג'לים לזיהוי מאת דאפי שלילי מכתים27,28,29,30, שיטה לאפשר הערכה של אורך שרשרת, אך תפוקה נמוכה, לקוי כמותית.

כעת מדווחים על assay פוליפ מהיר, זול, תפוקה בינונית המאפשר כימות מהירה של פוליפ רמות מגוונת מיני החיידקים. שיטה זו מתחיל lysing תאים חיידקיים ב 95 ° C 4 מ- guanidine-isothiocyanate (GITC)-14 כדי להשבית phosphatases הסלולר, ואחריו סיליקה ממברנה טור החילוץ אופטימיזציה עבור עיבוד מהיר של דגימות מרובים. התמצית המתקבלת המכילות פוליפ מתעכלת ואז עם עודף גדול של ScPPX, ביטול הצורך DNase וטיפול RNase. אנו כוללים פרוטוקול לטיהור זיקה ניקל פשוטה של כמויות מ ג של ScPPX. לבסוף, פוליפ-derived פוספט חינם לכמתו פשוט, רגיש, המבוסס על חומצה אסקורבית assay ערכי צבע מוחלטים24 , מנורמל לחלבון סלולרי הכולל. שיטה זו מייעלת את המדידה של פוליפ תאים חיידקיים, נדגים את השימוש עם נציג מינים של חיידקים גראם שליליים, חיידקים גראם חיוביים mycobacteria.

Protocol

1. טיהור שמרים Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. להפוך את המתח ביטוי חלבון e. coli BL21(DE3)31 עם פלסמיד pScPPX26 על-ידי אלקטרופורציה32 או שינוי כימי33.
  2. לחסן 1 ליטר מרק lysogeny (LB) המכיל 100 מ ל µg-1 אמפיצילין בבקבוקון unbaffled 2 ל' עם מושבה בודדת של BL21(DE3) המכיל pScPPX2, דגירה בין לילה ב 37 ° C ללא רועדת ספיגת על 600 nm (600) של 0.3, כפי שנמדד בספקטרופוטומטר.
  3. להתחיל את התרבות רועד (180 סל ד), תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, אשר במהלכו התאים יגדלו A600 של 0.4 - 0.5.
  4. להוסיף איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ריכוז סופי של 1 מ מ, נוספת 100 µg מ ל-1 אמפיצילין, ולאחר מכן תקופת דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-180 סל ד.
    הערה: פרוטוקול ביטוי זה מייצר כמות גדולה של ScPPX מסיסים. עם זאת, ביטוי ScPPX הוא מאוד סלחני, במגוון של פרוטוקולים ביטוי חלבון נפוצים אחרים השתמשו לטהר בהצלחה ScPPX.
  5. להעביר את התאים בקבוק 1 ליטר צנטריפוגה ולקצור אותם על ידי צריך שתוציאו בשביל 20 דקות ב 5000 g x-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע ולהעביר בגדר תא ל צינור חרוטי 50 מ.
    הערה: תא כדורי ניתן לאחסן באופן בלתי מוגבל ב- 80 ° c
  6. הפשרת בגדר על קרח, אז resuspend זה ב 9 מ של 50 מ מ HEPES, 0.5 M NaCl ו 5 מ מ imidazole (pH 8) עבור אמצעי אחסון סך של-10 מ"ל.
  7. להוסיף (ריכוזים הסופי) 1 מ ג מ ל-1 ליזוזים, 2 מ מ MgCl2ו- 50 יחידות מ ל-1 של endonuclease משפיל RNA ו- DNA (ראה טבלה של חומרים) דגירה במשך 30 דקות על קרח.
    הערה: ScPPX נקשר חומצות גרעין (נתונים לא מוצג), אז נוקלאז טיפול חיוני במהלך טיהור.
  8. באמצעות sonicator microtip (ראה טבלה של חומרים), lyse התאים על ידי 2 מחזורים של sonication על הקרח ב- 50% חשמל, הפועמים 5 s s על ו- 5, עם מנוחה 2 דקות בין מחזורי.
    הערה: השתמש הגנת השמיעה המתאים במהלך sonication. באופן דומה למקרה עם ביטוי, מגוון שיטות פירוק התא מקובלים לטיהור ScPPX.
  9. הסרת לכלוך לא מסיסים על ידי צריך שתוציאו את lysate למשך 20 דקות ב 20,000 g x-4 מעלות צלזיוס. לסנן את תגובת שיקוע וכתוצאה מכך (כ- 10 מ"ל) דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.8 אצטט תאית גודל הנקבוביות.
  10. טען את lysate על גבי טעונה ניקל mL 5 chelating עמודה (ראה טבלה של חומרים) באמצעות משאבה סחרור או מזרק גדול.
  11. יש לשטוף את העמודה עם 50 מ של 50 מ מ HEPES, 0.5 M NaCl, 5 מ מ imidazole (pH 8).
  12. יש לשטוף את העמודה עם 50 מ של 50 מ מ HEPES, 0.5 M NaCl, 20 מ מ imidazole (pH 8).
  13. Elute ScPPX עם 50 מ"מ HEPES, 0.5 M NaCl ו 0.5 M imidazole (pH 8), איסוף השברים 1-mL 15. מבחן אלה שברים • תנאי החלבונים תוכן עם ברדפורד assay חלבון, או34 (ראה טבלה של חומרים) ולהפעיל של ג'ל מרחביות-עמוד35 כדי לאשר שברים אשר מכילים ScPPX מטוהרים (משקל מולקולרי = 45 kDa).
  14. בריכה שברים המכיל ScPPX טהור ולהתאים את הריכוז של חלבון במאגר על mL 2 מ ג-1 עם 50 מ מ HEPES ו 0.5 M NaCl. ריכוז חלבון גבוה עלול לזרז בשלב הבא.
  15. להחליף את ScPPX מטוהרים לתוך מאגר אחסון (20 מ"מ טריס-HCl [pH 7.5], 50 מ מ. אשלגן כלורי, 10% [וי/v] גליצרול) על-ידי דיאליזה. למקם שברים ScPPX במאגר באורך אטום של 12,000-14,000 Da משקל מולקולרי דיאליזה הקיצוץ ממברנה אבובים (ראה טבלה של חומרים), להשעות ב- 1 ליטר של מאגר אחסון עם ערבוב רציף ב 4 ° C לפחות 4 h. חזור על שלב זה טריים מאגר אחסון עבור סכום כולל של שינויי מאגר 3.
  16. להעביר את חלבון מטוהרים, דיאליזה שפופרת צנטרפוגה או צינורות, צנטריפוגה כעשרים דקות ב 20,000 g x ב 4 ° C כדי להסיר כל אגרגטים קשי תמס. להעביר בזהירות את תגובת שיקוע צינור חרוטי נקי 15 מ"ל.
  17. התאם את ריכוז ScPPX מטוהרים כ 1 מ ג מ ל-1 עם מאגר אחסון, להוסיף 0.1% (w/v) אלבומין ללא פרוטאז שור (BSA; הריכוז הסופי), החנות עד 6 חודשים ב 4 º C.
    הערה: ScPPX מאבד יותר מ- 90% של פעילותה כשזה קפוא13.

2. אקצור את דגימות לחילוץ הפוליפוספאט

  1. לגדול חיידקים תחת התנאים של עניין לקביעת תוכן פוליפ. עבור פרוטוקול זה, לצמוח לקטובצילוס reuteri36 ללון ב- 37 מעלות צלזיוס בלי רועדת מפחד אנזים חטיפים אינדוקציה (מיי) בינוני37 בלי ציסטאין (מיי-C).
  2. הקציר מספיק תאים על ידי צנטריפוגה בצינור microcentrifuge 1.5 mL לסך 50 – 100 µg של חלבון תאית (ראה שלב 3 להלן). E. coli, זה 1 מ"ל של תרבות שלב יומן על A600 של 0.2 - 0.4. עבור ל' reuteri, זו 1 מ"ל של תרבות בין לילה. להתאים ככל הדרוש עבור מינים אחרים של ריבית.
  3. להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע של כדורי תא.
  4. Resuspend תא כדורי ב- µL 250 GITC מאגר פירוק (4 מ guanidine isothiocyanate, 50 מ מ טריס-HCl, pH 7) ואת lyse על ידי דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בחנות lysates ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: להיות עקבי עם הזמן פירוק, מאז דגירה ממושכת בטמפרטורה גבוהה עלולה לגרום השפלה של פוליפ על ידי הידרוליזה38. ניתן לאחסן Lysates ללא הגבלה ב- 80 ° c
    התראה: Guanidine isothiocyanate מלח chaotropic צריכים להיות מטופלים עם כפפות ואני מסולק כפסולת מסוכנת.

3. מדידה את תכולת חלבון תא Lysates

  1. הכנת תקנים BSA המכיל 0, 0.1, 0.2 ו- 0.4 מ ג מ ל-1 של BSA במאגר פירוק GITC.
    הערה: חשוב להפוך את הסטנדרטים BSA GITC, מאז GITC משפיעה על התפתחות הצבע וזמינותו ברדפורד. ניתן לאחסן BSA סטנדרטים ללא הגבלת זמן ב-20 ° C.
  2. Aliquot µL 5 של המופשרים, מעורבב היטב תא lysates ושל סטנדרטים BSA כדי להפריד בארות בצלחת ברור 96-ובכן.
  3. להוסיף µL 195 של ברדפורד ריאגנט34 מכל קידוח ולמדוד את ספיגת-595 nm (595), קורא צלחת (ראה טבלה של חומרים).
  4. לחשב את כמות החלבונים היטב כל על ידי השוואה עיקול רגיל BSA, באמצעות נוסחה y = mx + b, שבו y הוא595, x הוא µg של BSA, m הוא השיפוע של העקומה רגיל, ו b החיתוך-y של העקומה סטנדרטי. הכפל את הערך שהתקבל ב- 0.05 כדי לקבוע את סה כ מ ג חלבון בכל מדגם.

4. חילוץ הפוליפוספאט

  1. להוסיף 250 µL של אתנול 95% כל מדגם GITC-lysed של מערבולת לערבב.
  2. החל את התערובת על סיליקה ממברנה ספין עמודה צנטריפוגה ב-30 s-16,100 x g.
  3. למחוק את הזרימה דרך, ואז מוסיפים 750 µL של 5 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 50 מ מ NaCl, 5 מ מ EDTA, 50% אתנול וביו -צנטריפוגה ב-30 s-16,100 x g.
  4. למחוק את זרימה דרך וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב 16,100 x g.
  5. למקם את העמודה צינור microfuge mL 1.5 נקי ולהוסיף 150 µL של 50 מ מ טריס-HCl (pH 8).
  6. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, ואז elute פוליפ על ידי צריך שתוציאו למשך 2 דקות ב 8000 g x.
    הערה: אם רצונך בכך, eluates ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס לפחות שבוע אחד.

5. עיכול הפוליפוספאט

  1. הכנת סטנדרטים המכיל 0, 5, 50 או 200 מיקרומטר אשלגן פוספט ב 50 מ מ טריס-HCl (pH 8).
    הערה: אשלגן פוספט תקנים ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.
  2. µL 100 aliquot של כל פוספט רגיל, של חילוץ פוליפ דגימות לתוך בארות נפרדים של צלחת ברור 96-ובכן.
  3. להכין מיקס מאסטר המכיל (לכל דגימה): 30 µL של 5 x ScPPX התגובה מאגר (100 מ מ טריס-HCl, 25 מ מ MgCl2, אצטט אמוניום 250 מ מ, pH 7.5)13, µL 19 של H2O ו- 1 µL של ScPPX מטוהרים (1 מ ג מ ל-1).
  4. להוסיף 50 µL של המיקס מאסטר כל טוב של צלחת 96-ובכן. תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C.
    הערה: אם רצונך בכך, הדגימות פוליפ מתעכל שניתן לאחסן ב-20 ° C ללא הגבלת זמן.

6. זיהוי פוספט חינם24

  1. הכנת הבסיס לזיהוי פתרון על ידי המסת 0.185 גר' אנטימון אשלגן tartrate ב 200 מ של מים, להוסיף 150 מ ל N H 42אז4, ואז מוסיפה 1.49 גר' אמוניום heptamolybdate. מערבבים להמיס ולהביא ואז נפח סופי של 456 mL. לסנן את הפתרון להסיר חלקיקים ולאחסן מוגן מפני אור ב 4 ° C עד כחודש.
  2. להכין פתרון מניות של חומצה אסקורבית 1 מ'. חנות מוגן מפני אור ב 4 ° C עד כחודש.
  3. להכין מלאי עבודה טריים של זיהוי פתרון כל יום על ידי ערבוב 9.12 מ"ל של פתרון זיהוי הבסיס עם mL 0.88 של חומצה אסקורבית 1 מ'. לאפשר את הפתרון זיהוי לחזור לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  4. להוסיף 50 µL של פתרון זיהוי כל דגימה של תקן בצלחת 96-ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר למשך כ 2 דקות לאפשר פיתוח צבע.
  5. למדוד את ספיגת-882 nm בקורא צלחת לחשב ריכוז כל מדגם פוספט על ידי השוואה, אשלגן פוספט עיקול רגיל.
    התראה: הפתרון זיהוי מכיל מלחים רעילים וחומצות חזקות. יש ללבוש כפפות, להתייחס פתרון עודף כאל פסולת רעילה.

7. חישוב תכנים סלולריים הפוליפוספאט

  1. להמיר את ריכוזי פוספט שנקבע בשלב 6.5 כדי nanomoles של פוליפ-derived פוספט בכל תא כולו lysate לפי הנוסחה הבאה:
    פוליפ nmol = 1.5 x (מיקרומטר פוספט / 10)
    הערה: השיטה הרגילה המבוסס על עיקול בשלב 6 קובע את הריכוז של פוספט (ב מיקרומטר) בכל 100 µL פוליפ מדגם aliquoted בשלב 5.2. כדי להמיר את הריכוז מספר nmol, מחולק 100 µL ב- 106 כדי לתת נפח ב- L, להכפיל הריכוז (µmol L-1), ולאחר מכן מוכפל 1,000 (מספר nmol ב µmol). זה מפחית את חלוקת הריכוז על ידי 10. האחסון הכוללת תמצית מוכן בשלב 4 הוא 150 µL, ולכן יש צורך להכפיל את הערך המתקבל של 1.5 כדי לחשב את nmol של פוספט המצויים תמצית כל.
  2. לנרמל פוליפ הסלולר תוכן הכוללת חלבון תאית על ידי חלוקת nmol פוליפ על ידי החלבון הכולל מ"ג בכל מדגם שנקבע בשלב 3.4. פוליפ רמות באים לידי ביטוי במונחים של הריכוז של פוספט חינם פוליפ-derived בודדים.
    הערה: במקרים מסוימים, כמות פוליפ-derived פוספט הנוכח במדגם יפלו מחוץ לטווח ליניארי של העקומה סטנדרטי פוספט (שלב 6.5). אם הרמות של פוליפ גבוהה מאוד, eluate המכילים פוליפ עודף מ שלב 4.6 ניתן 1:10 מדולל או בטחונות, במקרה הצורך, ומדד ואז שוב כפי שמתואר שלבים 5 עד 7.

תוצאות

השלבים המפתח של הפרוטוקול נמצאים בדיאגרמה ובצורה פשוטה באיור1.

כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול זה עם חיידקים גראם שליליים, פראי-סוג e. coli MG165539 היה גדל לשלב יומן אמצע LB בינוני עשיר ב 37 ° C עם טלטול (200 סל ד), ואז לשטוף, מודגרות עבור h 2 נוספים ב באגירה morpholinopropanesulfonate (MOPS) מינימלי בינונית40 המכילה גלוקוז-1 4 g L ו- 0.1 מ מ K2HPO4, תנאי מוכרת הייצור של פוליפ14,29. כפי שמוצג באיור 2A, גילינו את הפוליפ לא בפראי-סוג החיידק גדל LB ואת 192 ± 14 (זאת אומרת ± סטיית תקן [SD]) nmol פוליפ מ ג-1 הכולל חלבון סחבות, עקבי עם הקודם דוחות14,29 . כצפוי, δממ ק מוטציה6, אשר חסר פוליפ קינאז41, המיוצר אין פוליפ או בינוני, δppx מוטציה6, אשר חסרה exopolyphosphatase42, המיוצר בערך אותה כמות של פוליפ כמו הפראי-סוג, של δphoB מוטציה29, אשר נמצא פגום בהעברה פוספט, הפיק פוליפ באופן משמעותי פחות מאשר29,פראי-סוג14,43.

כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול זה עם חיידקים גראם חיוביים, פראי-סוג ל' reuteri בקרת האוויר ועד ההורים 647536 , isogenic ppk1 null מוטציה חסר קינאז פוליפ, שימוש מכוון oligo recombineering44, היו גדל בין לילה מיי-C ב 37 ° C ללא רועד. כפי שמוצג באיור 2B, פראי-סוג שהצטברו 51 ± 6 nmol פוליפ מ ג-1 סך החלבון בתנאים אלה, כאשר המוטציה ppk1 הכילה פחות מחצי מכמות זו. ל' reuteri מכיל קינאז פוליפ השני, מקודד על ידי ppk2 ג'ין45, אשר ככל הנראה להציג חשבונות עבור הפוליפ החשבונאי null ppk1 .

כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול זה עם mycobacteria, זן SMR5 Mycobacterium smegmatis 46 גדל לשלב יומן אמצע Hartmans-דה Bont (HdB) בינוני47, ואז שטופים, מדולל פי חמש ב HdB או HdB עם 2% אתנול היו תרבויות אלה ואז מתפשט בן לילה ב 37 ° C עם טלטול (180 סל ד). כפי שמוצג באיור 2C, בהיעדרו של אתנול, מ smegmatis שהצטברו 141 ± 52 nmol פוליפ מ ג-1 הכולל חלבון, בזמן הטיפול אתנול הביא עלייה החולוני כדי 437 ± 102 nmol פוליפ מ ג-1 חלבון הכולל. תוצאה זו היה צפוי, שכן אתנול דווחה בעבר להעלות את רמות פוליפ smegmatis מ48.

figure-results-2953
איור 1: תרשים של נוהל חילוץ או מידה הפוליפוספאט. השלבים החיוניים של פרוטוקול כימות פוליפ מומחשים. כדורי תא החיידק הם lysed ב 95 ° C ב- GITC (guanidine isothiocyanate). Aliquots קטן של lysates לבדיקה לתוכן חלבון באמצעות וזמינותו ברדפורד. פוליפ מופק תוך שימוש בעמודות ממברנה סיליקה, ואז מתעכל עם ScPPX. פוספט חינם וכתוצאה מכך הוא לכמת באמצעות חומצה אסקורבית וזמינותו. סכום פוליפ-derived פוספט מנורמל לחלבון הכולל עבור כל דגימה. 595 = ספיגת-595 nm; 882 = ספיגת-882 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3754
איור 2: נציג התוצאות עם חיידקים שונים. (א) δ פראי-סוג של isogenic e. coli MG1655ממ ק, δppxוδphoB מוטציות היו בוגרים ב 37 ° C עם טלטול (200 סל ד) אל600 = 0.2 - 0.4 LB עשיר בינוני (עיגולים שחורים) ולאחר מכן העביר בינונית מזערי (MOPS המכילה גלוקוז-1 4 g L ו- 0.1 מ מ K2HPO4) עבור 2 h (עיגולים לבנים; n = 3, ± SD). (B) ל' reuteri בקרת האוויר ועד ההורים 6475 (מעגלים), מוטציה null של isogenic ppk1 (משולשים) היו מבוגר בן לילה ב 37 ° C C-מיי בינוני מבלי לרעוד (n = 3, ± SD). (C) מ smegmatis SMR5 גדל ב 37 ° C עם טלטול (180 סל ד) אל600 = 1 HdB בינוני עם (ריבועים סגור) או בלי (ובכיכרות פתוחות) 2% אתנול (n = 3, ± SD). פוליפ רמות באים לידי ביטוי במונחים של הריכוז של פוספט חינם פוליפ-derived בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מפשט ומאיץ כימות של פוליפ רמות חיידקים מגוונות, עם ערכה טיפוסית של דגימות 24 לוקח בערך 1.5 h לעבד באופן מלא. זה מאפשר מיון מהיר של דגימות וניתוח של ספריות מוטציה, מפשט את הניסויים קינטי מדידה ההצטברות של פוליפ לאורך זמן. הראו כי הפרוטוקול פועלת ביעילות על נציגי שלוש phyla שונים: פרוטאובקטריה, firmicutes, ו actinobacteria, אשר ידועים לשמצה שלהם גמיש, שקשה lyse קירות התא49.

זיהוי של פוליפ על ידי עיכול עם ScPPX ספציפי יותר ורגיש יותר מאשר זיהוי זריחה עם דאפי, הוא זול יותר וברור יותר מבחינה טכנית מאשר המרה של פוליפ ל- ATP באמצעות ממ ק. למרות ScPPX מעוכבת על ידי DNA ו- RNA12, התגברנו על זה על-ידי שימוש עודף גדול מאוד של אנזים (1 µg עבור דגימה) כדי להשיג עיכול מלאה אפילו בחיידקים המכיל למעלה מ-6,000 nmol פוליפ מ ג-1 חלבון29. שימוש 10-15 אחרים שפורסמו שיטות ng של ScPPX לכל תגובה12,24. פרוטוקול שלנו לטיהור ScPPX מניב בדרך כלל יותר מ 5 מ"ג של ScPPX טהור לליטר של תרבות ביטוי, אשר מספיק מבחני יותר מ-5,000. מצאנו כי מספר פרוטוקולים שונים לטיהור ניקל-זיקה של חלבונים שלו מתויג לעבוד טוב לטהר ScPPX overexpressed מן pScPPX2 (נתונים לא מוצג), ויש מגוון רחב של פרוטוקולים כזה זמין להתאים מעבדות עם משתנה יכולות טכניות.

הפרוטוקולים הקודמים באמצעות עיכול ScPPX לגילוי פוליפ צריכים לעיתים קרובות לסמוך על מלכיט מבוסס-ירוק ערכי צבע מוחלטים מבחני לכמת פוספט חינם6,12. אלה מבחני רגישות, אך בדרך כלל דורשים תוספת רציפים מתוזמן בקפידה של שניים או שלושה ריאגנטים נפרד לבצע מדידות מדויקות-24,-50,-51. מערכת זיהוי מבוסס חומצה אסקורבית בשימוש כאן24 רחב ליניארי מגוון של זיהוי מאשר מלכיט ירוק ללא אובדן רגישות כרוך רק תוספת של ריאגנט יחיד, אינו דורש דיוק עיתוי.

ישנם מספר שלבים הם קריטיים להצלחה של פרוטוקול זה. דגימות הראשון, חיידקי צריך להיות lysed ב GITC מיד לאחר הקטיף, כדי להבטיח כי רמות פוליפ אינם משתנים לאחר זמן הדגימה וכדי במהירות בטל phosphatases הסלולר. שנית, לא דגירה GITC lysates ב 95 מעלות צלזיוס למשך יותר מ- 10 דקות, ולאחסן אותם מיד לאחר מכן ב- 80 ° C כדי למזער את הפוליפ אפשרי הידרוליזה. שלישית, היה זהיר בעת pipetting דגימות 96-ובכן לוחות למדידות או חלבון או פוספט להתיז או לטפטף כל דבר החל דוגמא אחת לאחרת. מבחני ערכי צבע מוחלטים, במיוחד עבור פוספט, רגישים מאוד, כמויות קטנות של זיהום בחום יכול להטות את התוצאות. סוף סוף, קצת ריאגנטים בשימוש פרוטוקול זה (קרי ScPPX, זיהוי פתרון) מוגבלת חיי המדף. להכין ScPPX טריים כל 6 חודשים ורענן זיהוי פתרון כל חודש.

מגבלה אחת של השיטה שלנו היא כי סיליקה עמודות מאגד פוליפ פחות מ 60 פוספט יחידות זמן טוב מאוד12,14,15. למרות חיידקים לסנתז בדרך כלל בעיקר ארוכי שרשרת פוליפ3, אנו ממליצים ניסויים ראשוני באמצעות לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה27,30 כדי להעריך את אורך שרשרת זן חיידקי נתון לפני השימוש את הנהלים שלנו. עבור מינים איפה קצר-שרשרת פוליפ מהווה חלק ניכר של הבריכה פוליפ, פרוטוקול שלנו אינו מתאים ואנחנו ממליצים חילוץ פוליפ בשיטה שונה (למשל, פנול-כלורופורם החילוץ12), ממליצים גם שכשהם ScPPX עיכול עם זמינים מסחרית cereviseae ס pyrophosphatase (PPA1)24, מאחר ScPPX לא מעכלים רב-תכליתי13 ואת זה יש השפעה גבוהה באופן יחסי על מדידות של שרשרת קצרה יותר פוליפ. כחלופה ScPPX, חומצה הידרוליזה38 יכול לשמש כדי hydrolyze פוליפ לשחרר פוספט, אך זה דורש צעדים DNase RNase, טיהור נוספת כדי לוודא רק פוליפ-derived פוספט נמדדה. במקרים מסוימים, ייתכן שימושי כדי להשתמש בשיטת החילוץ חלופיים כדי לבדוק אם היעילות של פוליפ הפקת עם GITC משתנה בין זנים או תנאים, במיוחד עם חיידקים ידוע קירות התא עבה, כגון mycobacteria. אם רמות של פוליפ מתחת לגבול של זיהוי של assay הזה חשוב ללימודי השייכות למין מסוים, ייתכן צורך להשתמש ערכת זיהוי שונים, כגון שימוש ממ ק כדי להמיר פוליפ ATP, אשר ניתן לאתרם באמצעות מאוד ברגישות מבחני מבוססי לוציפראז זמינים מסחרית14,17,18.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

פרויקט זה נתמך על ידי אוניברסיטת אלבמה-קרנות אתחול המחלקה למיקרוביולוגיה של ברמינגהאם NIH מענק R35GM124590 (MJG) ואת NIH מענק R01AI121364 (FW).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plasmid pScPPX2Addgene112877available to academic and other non-profit institutions
LB brothFisher ScientificBP1427-2E. coli growth medium
ampicillinFisher ScientificBP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Gold BiotechnologyI2481C
HEPES bufferGold BiotechnologyH-400-1
potassium hydroxide (KOH)Fisher ScientificP250500for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazoleFisher ScientificO3196500
lysozymeFisher ScientificAAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP columnGE Life Sciences17040901any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrateFisher ScientificAC415611000for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filtersFisher Scientific09-302-168
Bradford reagentBio-Rad5000205
Tris bufferFisher ScientificBP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667Bother dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA144-212for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl)Fisher ScientificP217500
glycerolFisher ScientificBP2294
10x MOPS medium mixtureTeknovaM2101E. coli growth medium
glucoseFisher ScientificD161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
dehydrated yeast extractFisher ScientificDF0886-17-0
tryptoneFisher ScientificBP1421-500
magnesium sulfate heptahydrateFisher ScientificM63-50
manganese sulfate monohydrateFisher ScientificM113-500
guanidine isothiocyanateFisher ScientificBP221-250
bovine serum albumin (protease-free)Fisher ScientificBP9703100
clear flat bottom 96-well platesSigma-AldrichM0812-100EAany clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate readerTecan, Inc.not applicableany plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanolFisher Scientific04-355-451
silica membrane spin columnsEpoch Life Science1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher ScientificBP120500
1.5 mL microfuge tubesFisher ScientificNC9580154
ammonium acetateFisher ScientificA637-500
antimony potassium tartrateFisher ScientificAAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
ammonium heptamolybdateFisher ScientificAAA1376630
ascorbic acidFisher ScientificAC401471000

References

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63(2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27(2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267(2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  33. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757(2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76(2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143exopolyphosphatasemycobacteria

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved